飼料中豬源性成分的定性檢測 實時熒光PCR法 征求意見稿

1GB/T21101—202X飼料中豬源性成分的定性檢測實時熒光PCR法本文件規(guī)定了豬源性成分的實時熒光PCR檢測方法。本文件適用于飼料（包括飼料原料、配合飼料、濃縮飼料、精料補充料）中豬（Susscrofa)）源性成分的實時熒光PCR定性檢測。也適用于動物組織及加工品中豬（Susscrofa)）源性成分的實時熒光PCR定性檢測。本文件相對檢測下限為0.1%（W/W)，絕對檢測下限為5拷貝DNA/PCR反應(yīng)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T19495.3轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸提取純化方法GB/T20195動物飼料試樣的制備3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1實時熒光PCRreal-timePCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過熒光信號的積累實時監(jiān)控整個PCR擴(kuò)增過程3.2Ct值cyclethreshold每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。4縮略語下列縮略語適用于本文件。DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）bp：堿基對（basepair）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）Tris：三羥甲基氨基甲烷（trihydroxymethylaminomethane）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）5原理2GB/T21101—202X根據(jù)豬β-actin基因的特異性序列設(shè)計引物和探針，采用實時熒光PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光信號和Ct值實現(xiàn)對豬源性成分的定性檢測。6試劑和材料除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。實驗用水符合GB/T6682的要求。所有試劑均使用無DNA酶污染的容器存儲或分裝。6.1實時熒光PCR試劑（2×實時熒光PCR預(yù)混液)。6.2溶液配置用水：應(yīng)符合GB/T6682二級水的要求。。6.3實時熒光PCR用超純水：不含DNA酶和RNA酶。6.41mol/LTris-HCl溶液（pH8.0稱取121.1g三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中，用鹽酸調(diào)pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa、121°C條件下滅菌20min。6.50.5mol/LEDTA溶液(pH8.0)：稱取186.1gNa2EDTA·2H2O溶解于800mL水中，磁力攪拌器121°C條件下滅菌20min，室溫保存。6.6TE緩沖液（pH8.0）：分別量取10mLTris-HCl溶液和2mLEDTA溶液，加水定容至1000mL。在103.4kPa、121°C條件下滅菌20min。6.7引物和探針：用TE緩沖液將每條引物或者探針分別配制成100μmol/L儲存液備用，置-20℃以下凍存，避免多次凍融。序列見表1。表1引物探針序列5’-AGAGGGAGCCTGAGAAACGG5’-CCAGACTTGCCCTCCAATGG5’-[FAM]-CCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCG-[TAMRA]-3’豬5′-CGTAGGTGCACAGTAGPorcine-97bp-R5′-[FAM]-CCAGGTCGGGGAGTC-[7儀器設(shè)備7.1密閉的樣品粉碎儀或研磨機(jī)：碾磨細(xì)度達(dá)到60目，粉碎容器和刀具易于清洗。7.2離心機(jī)：離心速度≥14,000rpm。7.3紫外分光光度計或微量核酸蛋白測定儀。7.4實時熒光PCR儀。7.5電子天平：感量：0.1g。7.6微量移液器：2、10、100、200、1000μL等各種規(guī)格。8樣品按照GB/T20195規(guī)定制備試樣，至少200g，使用樣品粉碎儀或研磨機(jī)粉碎成粉狀，混合均勻，裝入密閉容器中，備用。在粉碎或碾磨一個樣品后，要將粉碎儀或研磨機(jī)的容器和刀具清洗干凈，防止污染下一個樣品。3GB/T21101—202X9檢測步驟9.1核酸提取按照GB/T19495.3的方法提取。提取出的核酸如需保存，須置于≤-20℃冰箱中。稱取粉碎后的樣品0.2~0.3g，按照GB/T19495.3附錄C.6.2中CTAB-2方法或其他合適的方法提取核酸。每個樣品設(shè)置兩個提取重復(fù)，并且設(shè)置一個提取空白對照。也可采用經(jīng)驗證可靠的商業(yè)化DNA提取純化方法或試劑盒進(jìn)行核酸提取純化，具體參照說明書使9.2DNA濃度和純度的測定吸取DNA提取液1μL，以超純水作為空白對照，使用分光光度計或微量核酸蛋白測定儀測定DNA模板的質(zhì)量濃度。將提取的DNA溶液用于實時熒光PCR檢測。將提取的DNA模板的質(zhì)量濃度稀釋到20ng/μL，用于實時熒光PCR檢測。9.3實時熒光PCR9.3.1對照和樣品檢測過程中分別設(shè)置陽性對照、陰性對照、空白對照。含有已知豬源成分的DNA樣品或含目標(biāo)片段的質(zhì)粒作陽性對照，用已知不含有目標(biāo)物種成分的樣品（植物核酸樣品）作陰性對照，用等體積的超純水代替模板作為空白對照。由于核酸提取時，已經(jīng)設(shè)置了兩個重復(fù)，在進(jìn)行實時熒光PCR檢測時，對于每個DNA樣品，不再設(shè)置重復(fù)，只進(jìn)行單次實時熒光PCR檢測。9.3.2反應(yīng)體系按照表2配置50μL反應(yīng)體系。表2實時熒光PCR實驗反應(yīng)體系—注：最終反應(yīng)體系中試劑添加的種類和總體系體積可能會根據(jù)不同的實時熒光PCR試劑產(chǎn)生差異。進(jìn)行不同體系配置時，需要參照不同試劑使用說明書，并且需要保證表2中所列引物、探9.3.3反應(yīng)程序按照表3的程序在實時熒光PCR儀上進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增。表3實時熒光PCR反應(yīng)程序4GB/T21101—202X1注：根據(jù)不同實時熒光PCR試劑的要求，可以對反應(yīng)程序中循環(huán)（擴(kuò)增）步驟進(jìn)行相應(yīng)等效修改。10質(zhì)量控制10.1內(nèi)參對照基因擴(kuò)增的質(zhì)量控制當(dāng)進(jìn)行真核生物內(nèi)參對照基因18SrRNA基因檢測時，符合下列條件，說明樣品提出了DNA，適合進(jìn)行目標(biāo)動物成分的實時熒光PCR檢測。a)提取空白對照：熒光通道無熒光信號檢出，Ct值≥37.0b)實時熒光PCR空白對照：熒光通道無熒光信號檢出，Ct值≥37.0。c)陰性對照：熒光通道無熒光信號檢出，Ct值≤28.0。d)陽性對照：熒光通道有熒光信號檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct值≤28.0。e)待測樣品：熒光通道有熒光信號檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct值≤33.0。10.2目標(biāo)動物物種特異基因擴(kuò)增的質(zhì)量控制當(dāng)進(jìn)行目標(biāo)動物物種特異基因的實時熒光PCR檢測時，以下條件有一條不滿足時，實驗視為無效，需重新進(jìn)行檢測。a)提取空白對照：熒光通道無熒光信號檢出。b)實時熒光PCR空白對照：熒光通道無熒光信號檢出。c)陰性對照：熒光通道無熒光信號檢出。d)陽性對照：熒光通道有熒光信號檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。11結(jié)果判定和表述11.1結(jié)果判定在符合第10章的情況下，對樣品的檢測結(jié)果按以下進(jìn)行判定：a)陽性結(jié)果的判定如果熒光通道有熒光信號檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，并且同一樣品的兩個實時熒光PCR檢測結(jié)果一致，則判定被檢樣品為陽性。b)陰性結(jié)果的判定如果熒光通道無熒光信號檢出，并且同一樣品的兩個實時熒光PCR檢測結(jié)果一致，則判定為被檢樣品陰性。c)痕量樣品結(jié)果的判定5GB/T21101—202X對于同一個樣品的兩個實時熒光PCR結(jié)果，一個為陽性，另一個為陰性時，應(yīng)重新提取DNA（設(shè)置兩個重復(fù)并對每個DNA樣品，進(jìn)行單次實時熒光PCR檢測。如果兩個實時熒光PCR復(fù)測結(jié)果均為陽性時，該樣品判定為陽性；如果兩個實時熒光PCR復(fù)測結(jié)果一個為陰性、另一個為陽性時，該樣品判定為陰性；如果兩個實時熒光PCR結(jié)果均為陰性結(jié)果時，該樣品判定為檢測限以下為陰性。11.2結(jié)果表述11.2.1結(jié)果為陽性的表述為“檢出豬源性DNA成分”。11.2.2結(jié)果為陰性的表述為“未檢出豬源性DNA成分”。12實驗污染防治措施按照GB/T27403中附錄D的規(guī)定執(zhí)行。6GB/T21101—202X豬源性物種檢測靶基因參考序列18SrRNA：5’-AGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCACTCCCGACCCGGGGAGGTAGTGACGAAAAATAACAATACAGGACTCTTTCGAGGCCCTGTAATTGGAATGAGTCCACTTTA