飼料中β-受體激動劑的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法 征求意見稿

2飼料中β-受體激動劑的測定液相色譜-串聯(lián)質譜法本文件描述了飼料中沙丁胺醇、萊克多巴胺、克倫特羅、齊帕特羅、氯丙那林、特布他林、西馬特羅、西布特羅、馬布特羅、溴布特羅、克倫普羅、班布特羅、妥布特羅、卡布特羅、羥甲基克倫特羅、利托君、馬噴特羅、溴代克倫特羅、克倫塞羅、苯氧丙酚胺和克倫潘特等21種β-受體激動劑液相色譜-串聯(lián)質譜測定方法。本文件適用于配合飼料、濃縮飼料、精料補充料和添加劑預混合飼料中沙丁胺醇、萊克多巴胺、克倫特羅、齊帕特羅、氯丙那林、特布他林、西馬特羅、西布特羅、馬布特羅、溴布特羅、克倫普羅、班布特羅、妥布特羅、卡布特羅、羥甲基克倫特羅、利托君、馬噴特羅、溴代克倫特羅、克倫塞羅、苯氧丙酚胺和克倫潘特等21種β-受體激動劑的測定。本文件中沙丁胺醇、萊克多巴胺、克倫特羅的檢出限為5μg/kg，定量限為10μg/kg；齊帕特羅、氯丙那林、特布他林、西馬特羅、西布特羅、馬布特羅、溴布特羅、克倫普羅、班布特羅、妥布特羅、卡布特羅、羥甲基克侖特羅、利托君、馬噴特羅、溴代克倫特羅、克倫塞羅、苯氧丙酚胺和克倫潘特的檢出限為10μg/kg，定量限為50μg/kg。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T20195動物飼料試樣的制備3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4原理試樣中的β-受體激動劑用鹽酸-甲醇溶液提取，經(jīng)固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定，基質匹配標準溶液校準，外標法定量。5試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。5.1水：GB/T6682，一級。5.2甲醇：色譜純。5.3乙腈：色譜純。35.4甲酸：色譜純。5.5鹽酸溶液（0.1mol/L）：移取8.3mL鹽酸，用水稀釋、定容至1000mL，混勻。5.6鹽酸-甲醇溶液：移取80mL鹽酸溶液（5.5），加入甲醇20mL，混勻。5.75%氨水甲醇溶液：移取5mL氨水與95mL甲醇，混勻。5.80.1%甲酸溶液：移取1mL甲酸（5.4），用水稀釋、定容至1000mL，混勻。5.90.1%甲酸乙腈溶液：移取1mL甲酸（5.4），用乙腈稀釋、定容至1000mL，混勻。5.10標準儲備溶液（1mg/mL）：準確稱取21種β-受體激動劑（中英文名稱、CAS號、純度等按附錄A規(guī)定執(zhí)行）標準品各10mg（精確至0.01mg），分別于10mL容量瓶，用甲醇（5.2）溶解、定容、混勻。于－18℃以下保存，有效期12個月?；蛸徺I有證標準溶液。5.11混合標準中間溶液（10μg/mL分別準確移取標準儲備溶液（5.10）各0.5mL于50mL容量瓶中，用甲醇（5.2）稀釋、定容、混勻。于－18℃以下保存，有效期6個月。5.12混合標準系列溶液：準確移取適量混合標準中間溶液（5.11用0.1%甲酸溶液（5.8）稀釋、定容、混勻，配制成質量濃度分別為1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的混合標準系列溶液。臨用現(xiàn)配。5.13固相萃取柱：混合型陽離子交換柱，60mg/3mL，或性能相當者。5.14微孔濾膜：0.22μm，有機系。6儀器設備6.1液相色譜-串聯(lián)質譜儀：配電噴霧離子源。6.2分析天平：精度0.01g和0.00001g。6.3旋渦混合器。6.4超聲波清洗器。6.5振蕩混合器。6.6離心機：轉速不低于8000r/min。6.7固相萃取裝置。6.8氮吹儀：溫度可控制在50℃。7樣品按GB/T20195制備試樣，稱取樣品至少200g，粉碎后通過0.425mm孔篩，充分混勻，裝入密閉容器中保存，備用。選取類型相同，均勻一致、且在待測物保留時間處，儀器響應值小于方法定量限30%的飼料樣品，作為空白試樣。8試驗步驟8.1提取平行做兩份試驗。稱取試樣2g（精確至0.01g）于50mL離心管中，準確加入20mL鹽酸-甲醇溶液（5.6），渦旋混勻，振蕩提取20min，以8000r/min離心5min，上清液作為備用液。8.2凈化8.2.1配合飼料、濃縮飼料和精料補充料4固相萃取柱依次用3mL甲醇、3mL水活化。準確移取5mL備用液（8.1）過柱，依次用3mL水、3mL甲醇淋洗，抽干，用5mL5%氨水甲醇溶液（5.7）洗脫，收集洗脫液，于50℃氮吹至干，準確加入1mL0.1%甲酸溶液（5.8）溶解，渦旋混勻，過微孔濾膜（5.14），備用。8.2.2添加劑預混合飼料取適量備用液（8.1），過兩次微孔濾膜（5.14），備用。8.3基質匹配混合標準系列溶液制備8.3.1配合飼料、濃縮飼料、精料補充料選取同類型空白基質試樣，按8.1和8.2.1步驟處理，凈化吹干，準確加入1mL混合標準系列溶液（5.12）復溶，配制成濃度分別為1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL系列基質匹配混合標準系列溶液。8.3.2添加劑預混合飼料選取同類型空白基質試樣，按8.1和8.2.2步驟處理，準確移取適量上清液稀釋混合標準中間溶液（5.11）至濃度為1μg/mL基質混合標準溶液，再將其稀釋成濃度分別為1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL系列基質匹配混合標準系列溶液。8.4測定8.4.1液相色譜參考條件液相色譜參考條件如下：a）色譜柱：C18柱，柱長100mm，內徑2.1mm，粒徑1.8μm，或性能相當者；b）柱溫：35℃;c）流速：0.3mL/min；d）進樣量：5μL；e）流動相：A：0.1%甲酸溶液（5.10），B：0.1%甲酸乙腈溶液（5.11），梯度洗脫程序見表1。表1梯度洗脫程序55558.4.2質譜參考條件質譜參考條件如下：a）電離模式：電噴霧電離，正離子模式（ESI+b）檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；d）干燥氣流速：14L/min；e）霧化器壓力：20psi；f）鞘氣溫度：400℃;g）鞘氣流速：11L/min；h）毛細管電壓：3000V；i）噴嘴電壓：1500V；多反應監(jiān)測（MRM）離子對、碎裂電壓及碰撞能量參考值見表2。表2多反應監(jiān)測（MRM）離子對、碎裂電壓及碰撞能量參考值1523845678896668.4.3基質匹配混合標準系列溶液和試樣溶液測定在儀器的最佳條件下，分別取基質匹配混合標準系列溶液（8.3）和試樣溶液（8.2）上機測定?；|匹配混合標準溶液的定量離子色譜圖見附錄B。8.4.4定性在相同試驗條件下，試樣溶液與基質匹配混合標準系列工作溶液中待測物的保留時間相對偏差應在±2.5%之內。根據(jù)表2選擇的定性離子對，比較試樣譜圖中待測物定性離子的相對離子豐度與濃度接近的基質匹配標準系列工作溶液中對應的定性離子的相對離子豐度，若偏差不超過表3的規(guī)定，則可判定為樣品中存在對應的待測物。表3定性測定時相對離子豐度的最大允許偏差>50>20～50>10～208.4.5定量以基質匹配混合標準系列溶液中待測物的濃度為橫坐標，定量離子的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，標準曲線的相關系數(shù)應不低于0.99。試樣溶液中待測物的響應值應在標準曲線線性范圍內，若超出7線性范圍，應重新測定。單點校準定量時，試樣溶液中待測物的濃度與基質匹配混合標準溶液的濃度相差不超過30%。9試驗數(shù)據(jù)處理試樣中待測物的含量以質量分數(shù)wi計，單位為微克每千克(μg/kg）表示，多點校準按公式（1）計算，單點校準按公式（2）計算：…………式中：ρi——由基質匹配混合標準曲線查得試樣溶液中待測物的濃度，單位納克每毫升（ng/mLV——試樣提取溶液的體積，單位為毫升（mL）；V2——最終定容體積，單位為毫升（mLf——超出標準曲線后的稀釋倍數(shù)；V1——凈化時所用試樣提取溶液的體積，單位為毫升（mLm——試樣質量，單位為克（g）?！街校篈i——試樣溶液中待測物的色譜峰面積；Cis——基質匹配混合標準溶液中待測物的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V——試樣提取溶液的體積，單位為毫升（mLV2——最終定容體積，單位為毫升（mL）；Ais——基質匹配混合標準溶液中待測物的色譜峰面積；V1——凈化時所用試樣提取溶液的體積，單位為毫升（mLm——試樣質量，單位為克（g）。測定結果以平行測定的算術平均值表示，保留3位有效數(shù)字。10精密度在重復性條件下，兩次獨立測定結果與其算術平均值的絕對差值不大于該算術平均值的20%。8附錄A21種β-受體激動劑標準品中文名稱、英文名稱、CAS號和純度要求21種β-受體激動劑標準品中文名稱、英文名稱、CAS號和純度要求見表A.1。表A.121種β-受體激動劑標準品中文名稱、英文名稱、CAS號和純度要求123456789HydroxymethylclenbuteMapenterolhydrochlBromchlorbuterolhydrochloIsoxsuprinehy