控制菌檢查法

控制菌檢查控制菌檢查用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適應(yīng)性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配置的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。菌種試驗(yàn)用菌種的傳代次數(shù)不得超過(guò)5代（從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102或CVCC1570]金黃色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）[CMCC(B)26003或CVCC1882]乙型副傷寒沙門菌（SalmonellaparatyphiB）[CMCC(B)50094]銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[CMCC(B)10104]生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）[CMCC(B)64941]白色念珠球菌（canidiaalbicans）[CMCC(F)98001]菌液制備接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時(shí)；接種白色念珠球菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18～24小時(shí)。用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為10～100cfu的菌懸液。菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在2～8℃可在24小時(shí)內(nèi)使用。適應(yīng)性檢查控制菌檢查用培養(yǎng)基的適應(yīng)性檢查項(xiàng)目包括促生長(zhǎng)能力、抑制能力及指示能力的檢查。表1控制菌檢查用培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)能力、抑制能力及指示能力檢查控制菌檢查培養(yǎng)基特性試驗(yàn)菌株大腸埃希菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力大腸埃希菌抑制能力金黃色葡萄球菌4-甲基傘形酮葡萄糖苷酸培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力+指示能力大腸埃希菌曙紅亞甲基藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力+指示能力大腸埃希菌大腸菌群乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力大腸埃希菌抑制能力金黃色葡萄球菌乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力+指示能力大腸埃希菌曙紅亞甲基藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力+指示能力大腸埃希菌沙門菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力乙型副傷寒沙門菌四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力乙型副傷寒沙門菌抑制能力金黃色葡萄球菌膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基或沙門、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力+指示能力乙型副傷寒沙門菌曙紅亞甲基藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力+指示能力乙型副傷寒沙門菌三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基指示能力乙型副傷寒沙門菌控制菌檢查培養(yǎng)基特性試驗(yàn)菌株銅綠假單胞菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力銅綠假單胞菌抑制能力金黃色葡萄球菌溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力銅綠假單胞菌抑制能力大腸埃希菌綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力+指示能力銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力金黃色葡萄球菌抑制能力大腸埃希菌卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力+指示能力金黃色葡萄球菌抑制能力大腸埃希菌梭菌梭菌增菌培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力生孢梭菌哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力生孢梭菌白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力白色念珠菌沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力+指示能力白色念珠菌念珠菌顯色培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力+指示能力白色念珠菌抑制能力大腸埃希菌1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力+指示能力白色念珠菌液體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力檢查分別接種不大于100cfu的試驗(yàn)菌（表1）于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)。與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。固體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力檢查取試驗(yàn)菌各0.1ml（含菌數(shù)50～100cfu）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征應(yīng)一致。培養(yǎng)基抑制能力檢查接種不少于100cfu的試驗(yàn)菌（表1）于被檢培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度計(jì)最長(zhǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，試驗(yàn)菌應(yīng)不得生長(zhǎng)。固體培養(yǎng)基指示能力檢查取試驗(yàn)菌各0.1ml（含菌數(shù)50～100cfu）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基上試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應(yīng)情況等應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基一致。液體培養(yǎng)基指示能力檢查分別接種不大于100cfu的試驗(yàn)菌（表1）于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)。與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌生長(zhǎng)情況、指示劑反應(yīng)等應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基一致?？刂凭鷻z查方法的驗(yàn)證當(dāng)建立獸藥的微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行控制菌檢查方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該獸藥的控制菌檢查。若獸藥的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)，依各品種項(xiàng)下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)驗(yàn)證的菌株，驗(yàn)證大腸菌群檢查劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～24小時(shí)。銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、無(wú)定形、周邊擴(kuò)散、表面濕潤(rùn)，灰白色，周圍時(shí)有藍(lán)綠色素?cái)U(kuò)散。如平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。如平板上生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選2～3個(gè)菌落，分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)18～24小時(shí)。取斜面培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色、鏡檢及氧化酶試驗(yàn)。氧化酶試驗(yàn)取潔凈濾紙片置于平皿內(nèi)，用無(wú)菌玻棒取斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上，滴加新配制的1%二鹽酸二甲基對(duì)苯胺試液，在30秒內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。若斜面培養(yǎng)物為非革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌或氧化酶試驗(yàn)陰性，均判供試品未檢出銅綠假單胞菌。否則，應(yīng)進(jìn)行綠膿菌素試驗(yàn)。綠膿菌素（Pyocyanin）試驗(yàn)取斜面培養(yǎng)物接種于PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)24小時(shí)，加三氯甲烷3～5ml至培養(yǎng)管中，攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。靜置片刻，將三氯甲烷相移至另一試管中，加入1mol/L鹽酸溶液約1ml，振搖后，靜置片刻，觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色，為綠膿菌素試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。同時(shí)用未接種的PDP培養(yǎng)基斜面同法做陰性對(duì)照，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)呈陰性。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性及綠膿菌素試驗(yàn)陽(yáng)性，判供試品檢出銅綠假單胞菌。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性及綠膿菌素試驗(yàn)陰性，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，確認(rèn)是否為銅綠假單胞菌。（5）金黃色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml或10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的亞碲酸鈉（鉀）肉湯（或營(yíng)養(yǎng)肉湯）培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時(shí)。必要時(shí)可延長(zhǎng)至48小時(shí)。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉培瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)24～72小時(shí)。若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落不同于表6所列特征，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。表6金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)甘露醇氯化鈉培瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有黃色環(huán)，菌落直徑0.7～1mm卵黃氯化鈉瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有卵磷脂分解的乳濁圈，菌落直徑1～2mm若平板上生長(zhǎng)的菌落與表7所列的菌落特征相符或疑似，應(yīng)挑選2～3個(gè)菌落，分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)18～24小時(shí)。取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色．并接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時(shí)，做血漿凝固酶試驗(yàn)。血漿凝固酶試驗(yàn)取滅菌小試管3支，各加入血漿和無(wú)菌水混合液（1:1)0.5ml，再分別加入可疑菌株的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml、金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml、營(yíng)養(yǎng)肉湯或0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液0.5ml,即為試驗(yàn)管、陽(yáng)性對(duì)照管和陰性對(duì)照管。將3管同時(shí)培養(yǎng)，3小時(shí)后開始觀察直至24小時(shí)。陰性對(duì)照管的血漿應(yīng)流動(dòng)自如，陽(yáng)性對(duì)照管血漿應(yīng)凝固，若試驗(yàn)管血漿凝固為血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。如陽(yáng)性對(duì)照管或陰性對(duì)照管不符合規(guī)定時(shí)，應(yīng)另制備血漿，重新試驗(yàn)。若上述疑似菌為非革蘭氏陽(yáng)性球菌、血漿凝固酶試驗(yàn)陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。(6)梭菌（Clostridium）

取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、lml、10cm2)2份，其中l(wèi)份置80℃過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)取七述平板上的菌落，置潔凈玻片上，滴加3％過(guò)氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產(chǎn)生，為過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。若上述可疑菌落為革蘭氏陽(yáng)性梭菌，有或無(wú)卵圓形或球形的芽孢，過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陰性，判供試品檢出梭菌，否則判供試品未檢出梭菌。（7）白色念珠菌（Candidaalbicans）

取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、lml、l0cm2）直接或處理后接種至適量（不少于10Oml）的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48～72小時(shí)。取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24～48小時(shí)（必要時(shí)延長(zhǎng)至72小時(shí)）。白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落呈乳白色，偶見(jiàn)淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時(shí)間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有皺褶。若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出白色念珠菌。如平板上生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選2～3個(gè)菌落分別接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24～48小時(shí)（必要時(shí)延長(zhǎng)至72小時(shí)）。若平板上無(wú)綠色或翠綠色的菌落生長(zhǎng)，判供試品未檢出白色念珠菌。若平板上生長(zhǎng)的菌落為綠色或翠綠色．挑取相符或疑似的菌落接種于1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上．培養(yǎng)24～48小時(shí)。取培養(yǎng)物進(jìn)行染色、鏡檢及芽管試驗(yàn)。芽管試驗(yàn)

挑取l％聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清的載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤(rùn)的平皿內(nèi)，于35～37℃培養(yǎng)1～3小時(shí)，置顯微鏡下觀察孢子上有否長(zhǎng)出短小芽管。若上述疑似菌為非革蘭氏陽(yáng)性菌，顯微鏡下未見(jiàn)厚膜孢子、假菌絲、芽管，判供試品未檢出白色念珠菌。結(jié)果判斷供試品檢出控制菌或其他致病菌時(shí)，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再?gòu)?fù)試。供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，應(yīng)從同一批樣品中隨機(jī)抽樣，獨(dú)立復(fù)試兩次，以3次結(jié)果的平均值報(bào)告菌數(shù)。若供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)及控制菌三項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定