基于銀納米顆粒免疫比色法檢測甲胎蛋白

背景介紹甲胎蛋白（AFP）是臨床診斷肝細(xì)胞癌（HCC）最廣泛使用的血清標(biāo)志物，可用于HCC的診斷、治療評(píng)估、預(yù)后預(yù)測和復(fù)發(fā)監(jiān)測。傳統(tǒng)的AFP蛋白的檢測方法存在分析成本高、操作復(fù)雜等問題。因此，迫切需要開發(fā)一種簡便、高效且成本低的方法用于癌蛋白檢測。銀納米粒子具有較好的光學(xué)性能，制備成本低，可用于構(gòu)建比色傳感實(shí)現(xiàn)蛋白檢測。基于銀納米粒子的比色法與傳統(tǒng)的蛋白檢測方法相比，具有操作簡單、快速且具有較低的成本效益。文章亮點(diǎn)1.提出了一種銀納米粒子比色傳感器可實(shí)現(xiàn)甲胎蛋白AFP的靈敏、高效檢測;2.操作簡單，只需要將分析樣本和免疫試劑相混合，發(fā)生免疫識(shí)別后即可檢測;3.與傳統(tǒng)的ELISA和其他蛋白檢測方法相比，本方法具有操作簡單、快速且具有較低的成本效益，為癌蛋白的檢測提供了一種新方案。內(nèi)容介紹1

實(shí)驗(yàn)部分1.1

主要儀器與試劑1.2

實(shí)驗(yàn)方法1.2.1

AgNPs的制備種子銀納米顆粒的制備：將20mL質(zhì)量濃度1%檸檬酸三鈉溶液和75mL超純水加入至250mL圓底燒瓶中，然后將混合液加熱至70°C，恒溫反應(yīng)15min。2

結(jié)果與討論2.1

AFP檢測原理由于AgNPs具有較大的消光系數(shù)，表現(xiàn)出尺寸依賴的光學(xué)特性，在生物傳感領(lǐng)域展現(xiàn)出優(yōu)異的性能。2.2

AgNPs的表征圖2aTEM表征表明制備的銀納米顆粒的形貌為球形，粒徑均勻，且具有較好的分散性，平均粒徑為20nm（圖2b）。a.TEM；b.

粒徑分布；c.XRD；d.UV-vis圖2

AgNPs的表征Fig.2

AgNPscharacterization2.3

AgNPs-抗體偶聯(lián)物表征為實(shí)現(xiàn)AFP特異性檢測，需采用AFP特異性抗體對(duì)AgNP表面進(jìn)行修飾。在制備AgNPs-抗體偶聯(lián)物之前，首先采用SH-PEG-COOH對(duì)AgNPs表面進(jìn)行功能化，以通過碳二亞酰胺法進(jìn)行抗體與AgNPs的連接，并且修飾的PEG可以保持AgNPs膠體的穩(wěn)定性，使其自身不發(fā)生團(tuán)聚。圖3a展示了AgNPs與抗體探針結(jié)合前后的UV-vis表征，可以看到經(jīng)過層層修飾后，AgNPs的最大紫外吸收峰發(fā)生了紅移；裸AgNPs的吸收峰為392nm，經(jīng)過PEG修飾后，移動(dòng)至397nm，繼而連接完抗體（包被或標(biāo)記）后，其紫外吸收峰位置移動(dòng)至403nm。圖中I-IV分別表示裸AgNPs，AgNPs-PEG，AgNPs-PEG-antiAFP(包被)偶聯(lián)物，AgNPs-PEG-antiAFP(標(biāo)記)偶聯(lián)物a.UV-vis；b.DLS圖3

AgNPs經(jīng)PEG和抗體修飾前后的表征Fig.3

CharacterizationofAgNPsbeforeandaftermodificationwithPEGandantibody2.4

免疫反應(yīng)條件優(yōu)化免疫反應(yīng)時(shí)間是影響免疫測定性能的重要參數(shù)，因此，我們研究了孵育時(shí)間對(duì)免疫復(fù)合物形成的影響。圖4展示了AgNPs免疫復(fù)合物的粒徑和孵育時(shí)間的關(guān)系。a.不同孵育時(shí)間下AgNPs免疫復(fù)合物的DLS圖；

b.AgNPs免疫復(fù)合物的粒徑和孵育時(shí)間的關(guān)系圖4

AgNPs免疫復(fù)合物在不同免疫反應(yīng)時(shí)間下的DLS表征Fig.4

DLScharacterizationofAgNPsimmune-complexesunderdifferentimmunereactiontime3

結(jié)論本文采用三明治夾心結(jié)構(gòu)，以AgNPs標(biāo)記抗體作為檢測探針，當(dāng)體系中存在目標(biāo)蛋白AFP時(shí)，抗原-抗體發(fā)生免疫識(shí)別，形成納米顆粒團(tuán)聚體，可通過銀納米顆粒溶液顏色的變化檢測樣品中目標(biāo)蛋白含量。