微生物限度檢查操作規(guī)程中國藥典四部通則

標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第1頁起草人審核人批準(zhǔn)人起草日期審核日期批準(zhǔn)日期起草部門質(zhì)量管理部頒發(fā)部門辦公室生效日期一、范圍：本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了微生物限度的檢查方法和操作規(guī)定；合用于檢品需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)、控制菌的檢查。二、引用標(biāo)準(zhǔn)：《中國藥典》2023年版(通則1105-1106)三、目錄1．微生物限度標(biāo)準(zhǔn)2．設(shè)備、儀器及用品3．消毒液、稀釋劑、試液及培養(yǎng)基4．檢查總則（通則1105：非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法，通則1106非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法）5．微生物計(jì)數(shù)法檢查6．控制菌檢查法7．實(shí)驗(yàn)技術(shù)8.附件1．微生物限度標(biāo)準(zhǔn)非無菌藥用原料及輔料的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)需氧菌總數(shù)(cfu/g或cfu/ml)霉菌和酵母菌總數(shù)(cfu/g或cfu/ml)控制菌藥用原料及輔料103102**未做統(tǒng)一規(guī)定。1.1成品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)品名法定標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)需氧菌總數(shù)(cfu/g或cfu/ml)霉菌和酵母菌總數(shù)(cfu/g或cfu/ml)控制菌需氧菌總數(shù)(cfu/g或cfu/ml)霉菌和酵母菌總數(shù)(cfu/g或cfu/ml)控制菌大腸埃希菌沙門菌大腸埃希菌沙門菌乳糖≤1000≤100—無≤100≤50——無水乳糖≤100≤10—/10g—/100g≤100≤10—/10g—/100g蔗糖無無無無≤100≤50——(1)．“—”為不得檢出。(2)．目測(cè)霉變者以不合格論。(3)．“無”為標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)或無相應(yīng)規(guī)定。標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第2頁1.2工藝用水微生物限度標(biāo)準(zhǔn)品名法定標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)需氧菌總數(shù)(cfu/ml)控制菌（MPN/100mL或CFU/100mL）需氧菌總數(shù)(cfu/ml)控制菌（MPN/100mL或CFU/100mL）生活飲用水≤100不得檢出≤100不得檢出純化水≤lOO不得檢出≤80不得檢出1.3內(nèi)包裝材料微生物限度標(biāo)準(zhǔn)品名(單位)需氧菌總數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)控制菌需氧菌總數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)控制菌藥用聚乙烯烴塑料袋(100cm2)≤1000cfu≤100cfu—≤100cfu≤10cfu—說明： 1．“—”為每100cm2中不得檢出。2．目測(cè)霉變者以不合格論。3．“無”為標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)或無相應(yīng)規(guī)定。2．設(shè)施、儀器及用品2.1、設(shè)施：2.1.1．微生物限度檢查室及相關(guān)設(shè)施：微生物計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)環(huán)境應(yīng)符合微生物限度檢查的規(guī)定。檢查全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期進(jìn)行監(jiān)測(cè)。2.1.2．其他設(shè)備：高壓蒸汽滅菌器；細(xì)菌培養(yǎng)箱（30~35℃）；霉菌培養(yǎng)箱（25~28℃）；電爐（或其他適宜的加熱裝置）；恒溫水??；電熱干燥箱（250~300℃）；電冰箱。生化試劑儲(chǔ)存箱。2.2儀器及器皿2.2.1．菌落計(jì)數(shù)器；顯微鏡（1500X）；電子天平或藥物天平（感量0.1g）；pH系列比色計(jì)。2.2.2．玻璃器皿：錐形瓶（250~300ml，內(nèi)裝玻璃珠若干）、研缽（玻璃或陶瓷制，∮10~12cm）、培養(yǎng)皿（∮9cm）、量筒（100ml）、試管（18×180mm）及塞、吸管（1ml分度0.01，10ml分度0.1）、載玻片、蓋玻片、玻璃消毒缸（帶蓋）。2.2.3新購的玻璃器皿的清潔：先用流水沖洗，浸泡于1%~2%鹽酸（工業(yè)用）液中約2~6小時(shí)，除去游離堿質(zhì)，再用流水沖洗。用于化學(xué)分析的玻璃儀器，需用重鉻酸鉀清潔液浸泡數(shù)分鐘后，再用流水沖洗，最后以純化水涮洗2~3次，晾干備用。2.3用過的玻璃器皿：2.3.1未被病原微生物污染的器皿：可隨時(shí)洗滌。用清水沖洗（或浸泡），除容量?jī)x器外，可用毛刷和肥皂粉，內(nèi)外刷洗，再用清水涮洗干凈，晾干備用。容量?jī)x器宜用清潔液浸泡或涮洗，再用流水沖洗，最后以純化水涮洗2~3次。標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第3頁2.3.2已被病原微生物污染的器皿：需先通過滅菌解決后再按常法洗滌。試管及培養(yǎng)皿：先正放或直立于高壓蒸汽滅菌器內(nèi)，經(jīng)121℃滅菌30分鐘。趁熱傾出培養(yǎng)物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗，最后以流水涮凈。吸管：所有直立浸沒于清潔液的長(zhǎng)筒形容器中，筒底應(yīng)襯有棉或橡皮墊，以防管尖損壞。24小時(shí)后，逐支用流水反復(fù)沖洗潔凈，晾干后包扎滅菌備用。載、蓋玻片：應(yīng)分別浸泡于清潔液12~24小時(shí)后，取出用流水沖洗，再放入3%~5%肥皂水或5%碳酸鈉液內(nèi)煮沸10~15分鐘，待自然冷卻后，再用流水沖洗。瀝干后置95%乙醇中浸泡，晾干備用。2，3，3玻璃器皿用前應(yīng)洗滌干凈，無殘留抗菌物質(zhì)。吸管口上端距0.5cm處塞入約2cm的適宜疏松棉花，置吸管桶內(nèi)或牛皮紙袋中。錐形瓶、量筒、試管均應(yīng)加棉塞或硅膠塞，若用振蕩器制備混懸液時(shí)，尚需用玻璃紙包裹瓶塞（以免振蕩時(shí)供試液污染瓶塞），再用牛皮紙包扎。玻璃器皿，均于160℃干熱滅菌2小時(shí)或高壓蒸汽121℃滅菌30分鐘，烘干備用。2.4用品2.4.1大、小橡皮乳頭（放于干凈帶蓋的容器中，并應(yīng)定期用70%~75%乙醇溶液浸泡）。2.4.2無菌衣、帽、口罩、手套（洗凈后配套，用牛皮紙包嚴(yán)）滅菌，備用。也可用一次性無菌衣、帽、口罩、手套。2.4.3接種環(huán)（白銥金或鎳鉻合金，環(huán)徑4~5mm、長(zhǎng)度6~10cm）、乙醇燈、乙醇棉球或碘伏棉球、滅菌剪刀或滅菌手術(shù)刀和滅菌鑷子、滅菌稱樣紙、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號(hào)筆、白瓷盤、洗手盆、陶瓦蓋（12cm）、實(shí)驗(yàn)記錄紙等。3消毒液、稀釋劑、試液及培養(yǎng)基3.1消毒液、稀釋劑及試液。3.1.10.1%苯扎溴銨溶液：供洗手、擦拭操作臺(tái)面用。3.1.25%石碳酸溶液：配制后裝入玻璃消毒缸內(nèi)，供消毒帶菌吸管用，抑或選用其他適宜消毒液。3.1.3．75%乙醇溶液：配好后制乙醇棉球，供擦手、擦拭操作工具用。3.1.4．0.9%無菌氯化鈉溶液：取氯化鈉9.0g，加水使溶解成1000ml，121℃滅菌20分鐘。3.1.5．司盤-80、單硬脂酸甘油酯、吐溫-80：供非水溶性供試品供試液制備用。3.1.6．無菌0.1%氯化三苯四氮唑溶液（TTC）：取氯化三苯四氮唑0.1g，加水使溶解成10ml。3.1.7．甲基紅指示液：取甲基紅0.1g，加入95%乙醇300ml，水適量，使溶解，再加水至500ml。3.1.8．V-P試液：①氫氧化鉀試液：取氫氧化鉀40.0g，加水使溶解成100ml；②α-萘酚乙醇試液：取α-萘酚6.0g，加無水乙醇使溶解成100ml。3.1.9．革蘭染色液：①沙黃染液：取沙黃0.25g，加95%的乙醇10ml，使完全溶解后，加水至100ml；②結(jié)晶紫染液：取結(jié)晶紫1.0g，加95%的乙醇20ml，使溶解，加1%的草酸銨溶液80ml，混勻。靜置48小時(shí)使用，置密閉棕色瓶中儲(chǔ)存；③碘試液：取碘化鉀2.0g，加水3~5ml使溶解，加入碘片1.0g，使所有溶解后，加水稀釋至300ml，置密標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第4頁閉棕色瓶中儲(chǔ)存。3.1.10．中性紅指示液：取中性紅1.0g，研細(xì)，加95%乙醇60ml，使溶解，再加水到100ml。變色范圍pH6.8~8.0（紅→黃）。3.1.11．亞甲藍(lán)指示液：取亞甲藍(lán)0.5g，加水使溶解成100ml。3.1.12．溴麝香草酚藍(lán)指示液：取溴麝香草酚藍(lán)0.4g，加1mol/L氫氧化鈉溶液0.64ml使溶解，再加水至100ml。變色范圍pH6.0~7.6（黃→藍(lán)）。3.1.13．酸性品紅指示液：以酸性品紅0.5g，加水100ml使溶解，再逐漸加1mol/L氫氧化鈉溶液16ml，每加1滴均應(yīng)將溶液充足搖勻后再加第二滴，直至溶液呈草黃色；于沸水內(nèi)保持15分鐘，再靜置2小時(shí)，濾過，即得。優(yōu)點(diǎn)：無色，在倒管內(nèi)初期發(fā)酵易觀測(cè)，不易被還原。變色范圍pH6.0~7.4（紅→黃）。3.1.14．曙紅鈉指示液：取曙紅鈉2.0g，加水使溶解成100ml。3.1.15．靛基質(zhì)試液：取對(duì)二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充足振搖，使完全溶解后，取濃鹽酸20ml漸漸滴入，邊加邊振搖，以免驟熱導(dǎo)致溶液色澤變深，置冰箱保存，備用。3.2培養(yǎng)基3.2.1．培養(yǎng)基的制備及儲(chǔ)存3,2,1,1溶化：一般應(yīng)放在玻璃器皿或搪瓷器內(nèi)。加入純化水，隔水加熱以促其溶解，加熱時(shí)應(yīng)經(jīng)常攪拌，防止焦結(jié)，待其溶解后補(bǔ)足水分。3.2.1.2在使用干燥培養(yǎng)基時(shí)，先將純化水按定量加入容器中，然后稱取一定量培養(yǎng)基干粉放入水中，靜置10~15分鐘，攪拌，振蕩，或延長(zhǎng)時(shí)間以促進(jìn)溶解，一般不要加熱，必要時(shí)加熱，但時(shí)間不宜過長(zhǎng)，溫度不宜過高，避免某些營(yíng)養(yǎng)成分被破壞。3.2.1.3校正酸堿度：培養(yǎng)基必須有適當(dāng)?shù)膒H值。測(cè)定pH值是培養(yǎng)基配制過程中的重要環(huán)節(jié)之一，干燥培養(yǎng)基一般已校正過pH值，用時(shí)也必須再驗(yàn)證。pH值測(cè)定期，一般用指示劑滴入培養(yǎng)基中觀測(cè)其顏色的變化，或用pH計(jì)校正，如與所需pH值不符，可用酸或堿液加以校正。一般用氫氧化鈉校正的弱堿性培養(yǎng)基，高壓滅菌前培養(yǎng)基的pH值高0.2左右，滅菌后基本合適。調(diào)整pH值后要加熱過濾，使培養(yǎng)基澄清。3.2.2培養(yǎng)基的分裝：3.2.2.1液體、半固體培養(yǎng)基一般在高壓滅菌前分裝，約裝試管容積的1/3，在滅菌后還要加入成分的液體、半固體培養(yǎng)基，滅菌后再分裝于滅菌試管或錐形瓶中。3.2.2.2固體培養(yǎng)基一般分裝在250ml、500ml錐形瓶中，高壓滅菌后根據(jù)需要分裝平皿或試管。平皿：如傾注平皿，應(yīng)在無菌室中放置3～4小時(shí)，如用塑料平皿須在35℃培養(yǎng)箱中倒置30～60分鐘。水蒸氣會(huì)自然蒸發(fā)。斜面：制備低層斜面分裝于試管，約占容積的1/5，滅菌后趁熱斜放于細(xì)玻璃棒和木桿上，使成斜度，分裝時(shí)注意管口和瓶塞上勿沾有培養(yǎng)基，避免污染。制備高層斜面分裝于試管，約占試管容積的1/3，滅菌后趁熱放置成高層短斜面，待其凝固后應(yīng)用。3.2.3培養(yǎng)基的滅菌：培養(yǎng)基的滅菌多采用高壓蒸汽滅菌，各種培養(yǎng)基的滅菌時(shí)間和壓力，按其成分不同而定。普通培養(yǎng)基多采用121℃、103.42kPa滅菌15分鐘，但容器和裝量較大時(shí)，可延長(zhǎng)至20分鐘。高壓滅菌應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行，必須逐漸加熱，徹底排除滅菌器內(nèi)的冷空氣，再逐漸升壓保持預(yù)定的壓力和時(shí)間，達(dá)成全殺滅微生物的目的。標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第5頁3.2.4培養(yǎng)基的儲(chǔ)存：保存培養(yǎng)基的時(shí)間需視培養(yǎng)基中水分蒸發(fā)的限度及有無污染而定，已制備好培養(yǎng)基要保存于冷暗處或冰箱中，但由于各種培養(yǎng)基的性質(zhì)不同，不也許固定一個(gè)保存期限。制備好的平板或試管培養(yǎng)基，為防止水分蒸發(fā)，應(yīng)置于塑料袋內(nèi)，4℃保存，可延長(zhǎng)使用期限。微量生化反映管熔封于細(xì)玻管內(nèi)，室溫下可保存1年左右。3.3注意事項(xiàng)：3.3.1采用干燥培養(yǎng)基時(shí)，按說明配制，應(yīng)對(duì)滅菌后的培養(yǎng)基pH值進(jìn)行校驗(yàn)。若為自配培養(yǎng)基，原料應(yīng)挑選，瓊脂凝固力應(yīng)測(cè)定，以擬定配制時(shí)瓊脂的用量。試劑規(guī)格規(guī)定應(yīng)為化學(xué)純（CP）以上規(guī)格，其中不能具有對(duì)細(xì)菌、霉菌、大腸桿菌生長(zhǎng)有害的克制物。3.3.2配制的培養(yǎng)基不應(yīng)當(dāng)有沉淀，如有沉淀，應(yīng)于溶化后趁熱過濾，并應(yīng)于2小時(shí)內(nèi)滅菌，避免細(xì)菌繁殖。3.3.3培養(yǎng)基的分裝量不得超過容器的2/3，以免滅菌時(shí)溢出。包裝時(shí)，塞子必須塞緊，以免松動(dòng)或脫落導(dǎo)致染菌。3.3.4配制培養(yǎng)基的pH值測(cè)定期，其波動(dòng)范圍應(yīng)在規(guī)定的pH±0.2之內(nèi)，還需注意高壓滅菌后的pH值變化。3.3.5每批培養(yǎng)基均應(yīng)有配制記錄，涉及名稱、配制量（各種成分用量）、配制者、校對(duì)者、配制日期以及性能和無菌實(shí)驗(yàn)。3.3.6每批培養(yǎng)基在用于樣品的分離鑒定之前均應(yīng)作性能實(shí)驗(yàn)，以保證微生物檢查的質(zhì)量。性能實(shí)驗(yàn)須用已知標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行預(yù)試，符合規(guī)定方可應(yīng)用。3.3.7棉塞以普通棉花制作，棉塞松緊應(yīng)適宜，過松易污染雜菌，過緊影響透氣性；每次用后需高壓滅菌并隨即烘干，要防塵、防霉；變硬無彈力時(shí)需更換。3.3.8各種試管應(yīng)先配上合適的棉塞，待高壓滅菌后再分裝培養(yǎng)基，可防止污染。3.3.9培養(yǎng)基配制時(shí)，應(yīng)先將有沉淀物的原料如蛋白胨、牛肉膏、鹽類和瓊脂配好，經(jīng)調(diào)節(jié)pH值、加熱并煮沸溶化后再濾清；濾清時(shí)注意趁熱過濾，濾除異物、沉淀后，應(yīng)將蒸發(fā)失去的溶液量按原溶液量加純化水補(bǔ)足。3.3.10應(yīng)嚴(yán)格遵守各種培養(yǎng)基規(guī)定的滅菌溫度和時(shí)間，滅菌后培養(yǎng)基不得有混濁現(xiàn)象，每瓶配制并滅菌后的培養(yǎng)基、稀釋劑均應(yīng)在外表清楚標(biāo)明滅菌日期。3.3.11每批稀釋劑、培養(yǎng)基均應(yīng)有空白實(shí)驗(yàn)，合格后方能使用。3.3.12滅菌后的培養(yǎng)基在冷暗處保存，放置時(shí)間不能過長(zhǎng)，一般在兩周內(nèi)用完。久存培養(yǎng)基失水過多、固體干涸變形、液體出現(xiàn)沉淀、棉塞松弛或脫落者均不得使用。已熔化的培養(yǎng)基應(yīng)一次用完，啟動(dòng)后不宜再用。3.3.13勿用電爐直接熔化瓊脂培養(yǎng)基，以免營(yíng)養(yǎng)成份過度受熱而破壞，應(yīng)用水浴或微波爐加熱。4.檢查總則（1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法）4.1微生物計(jì)數(shù)法合用范圍：系用于能在有氧條件下生長(zhǎng)的嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)。當(dāng)本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合相應(yīng)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)按下述規(guī)定進(jìn)行檢查，涉及樣品的取樣量和結(jié)果的判斷等。除另有規(guī)定外，本法不合用于活菌制劑的檢査。如供試品有抗菌活性，應(yīng)盡也許去除或中和。供試品檢査時(shí)，若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)其有效性及對(duì)微生物無毒性。供試液制備時(shí)假如使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對(duì)微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第6頁4.2微生物計(jì)數(shù)法4.2.1合用性實(shí)驗(yàn)用菌株(表1)實(shí)驗(yàn)菌株實(shí)驗(yàn)菌液的制備計(jì)數(shù)培養(yǎng)基合用性檢查計(jì)數(shù)方法合用性實(shí)驗(yàn)需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CCMCC(B)26003〕胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30?35C，培養(yǎng)時(shí)間18?24小時(shí)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30-35℃培養(yǎng)時(shí)間不超過3天，接種量不大于100cfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（MPN法），培養(yǎng)溫度30-35℃,培養(yǎng)時(shí)間不超過3天，接種量不大于100cfu銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)CCMCC(B)10104胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30-35℃，培養(yǎng)時(shí)間18?24小時(shí)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30-35℃培養(yǎng)時(shí)間不超過3天，接種量不大于100cfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（MPN法），培養(yǎng)溫度30-35℃，培養(yǎng)時(shí)間不超過3天，接種量不大于100cfu枯草芽孢桿菌{.Bacillussubtilis)〔CMCC(B)63501〕胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30-35℃培養(yǎng)時(shí)間18-24小時(shí)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30-35℃培養(yǎng)時(shí)間不超過3天，接種量不大于lOOcfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（MPN法），培養(yǎng)溫度30-35℃，培養(yǎng)時(shí)間不超過3天，接種量不大于lOOcfu白色念珠菌(Candidaalbicans)CCMCC(F)98001〕沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度20-25℃培養(yǎng)時(shí)間2-3天胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30-35℃培養(yǎng)時(shí)間不超過5天，接種量不大于lOOcfu沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度20-25℃培養(yǎng)時(shí)間不超過5天，接種量不大于lOOcfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（MPN法不合用）培養(yǎng)溫度30?35°C，培養(yǎng)時(shí)間不超過5天，接種量不大于lOOcfu沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度20-25℃培養(yǎng)時(shí)間不超過5天，接種量不大于lOOcfu標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第7頁黑曲霉（Asper君山wsniger)CCMCC(F)98003〕沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度20-25℃培養(yǎng)時(shí)間5?7天，或直到獲得豐富的孢子胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30-35℃培養(yǎng)時(shí)間不超過5天，接種量不大于lOOcfu沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度20-25℃培養(yǎng)時(shí)間不超過5天，接種量不大于lOOcfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（MPN法不合用）培養(yǎng)溫度30-35℃培養(yǎng)時(shí)間不超過5天，接種量不大于lOOcfu沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度20-25℃培養(yǎng)時(shí)間不超過5天，接種量不大于lOOcfu注：當(dāng)需用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基合用性檢查，檢査方法同沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。4.2.2計(jì)數(shù)方法：涉及平皿法、薄膜過濾法和最也許數(shù)法（Most-Probable-NumberMethod,簡(jiǎn)稱MPN法）。MPN法用于微生物計(jì)數(shù)時(shí)精確度較差，但對(duì)于某些微生物污染量很小的供試品，MPN法也許是更適合的方法。供試品檢查時(shí)，應(yīng)根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選擇計(jì)數(shù)方法，檢測(cè)的樣品量應(yīng)能保證所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以判斷供試品是否符合規(guī)定。所選方法的合用性須經(jīng)確認(rèn)。計(jì)數(shù)培養(yǎng)基合用性檢査和供試品計(jì)數(shù)方法合用性實(shí)驗(yàn)供試品微生物計(jì)數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行合用性檢查。供試品的微生物計(jì)數(shù)方法應(yīng)進(jìn)行方法合用性實(shí)驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物計(jì)數(shù)。若檢查程序或產(chǎn)品發(fā)生變化也許影響檢查結(jié)果時(shí)，計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新進(jìn)行合用性實(shí)驗(yàn)。4.2.3菌種及菌液制備4.2.3.1菌種實(shí)驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證實(shí)驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。4.2.3.2計(jì)數(shù)培養(yǎng)基合用性檢查和計(jì)數(shù)方法合用性實(shí)驗(yàn)用菌株見（表1）。菌液制備按(表1)規(guī)定程序培養(yǎng)各實(shí)驗(yàn)菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加人3?5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7_0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在2?8℃，可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2?8℃,在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。4.2.4陰性對(duì)照為確認(rèn)實(shí)驗(yàn)條件是否符合規(guī)定，應(yīng)進(jìn)行陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)應(yīng)無菌生長(zhǎng)。如陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。4.2.5培養(yǎng)基合用性檢査微生物計(jì)數(shù)用的成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基合用性檢查。按(表1)規(guī)定，接種不大于lOOcfu的菌液至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，置表1規(guī)定條件下培養(yǎng)。每一實(shí)驗(yàn)標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第8頁菌株平行制備2管或2個(gè)平皿。同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)。被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.5?2范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，實(shí)驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。4.3計(jì)數(shù)方法合用性實(shí)驗(yàn)4.3.1供試液制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采用適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時(shí)，應(yīng)均勻加熱，且溫度不應(yīng)超過45℃。供試液從制備至加入檢查用培養(yǎng)基，不得超過1小時(shí)。常用的供試液制備方法如下（假如下列供試液制備方法經(jīng)確認(rèn)均不合用，應(yīng)建立其他適宜的方法）4.3.1.1水溶性供試品取供試品，用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或PH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成1:10供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至6?8。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。4.3.1.2水不溶性非油脂類供試品取供試品，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或PH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基制備成1:10供試液。分散力較差的供試品，可在稀釋液中加人表面活性劑如0.1%的聚山梨酯80,使供試品分散均勻。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至6?8。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。4.3.1.3油脂類供試品取供試品，加人無菌十四烷酸異丙酯使溶解，或與最少量并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯80或其他無抑菌性的無菌表面活性劑充足混勻。表面活性劑的溫度一般不超過40t：(特殊情況下，最多不超過45°C)，小心混合，若需要可在水浴中進(jìn)行，然后加人預(yù)熱的稀釋液使成1:10供試液，保溫，混合，并在最短時(shí)間內(nèi)形成乳狀液。必要時(shí)，用稀釋液或含上述表面活性劑的稀釋液進(jìn)一步10倍系列稀釋。4.3.1.4需用特殊方法制備供試液的供試品膜劑供試品取供試品，剪碎，加PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或PH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，浸泡，振搖，制成1:10的供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至6?8。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品取供試品，加人PH6.8無菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或PH7.6無菌磷酸鹽緩沖液(用于結(jié)腸溶制劑），置45℃水浴中，振搖，使溶解，制成1:10的供試液。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。4.3.1.5氣霧劑、噴霧劑供試品取供試品，置一20°C或其他適宜溫度冷凍約1小時(shí)，取出，迅速消毒供試品啟動(dòng)部位，用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑緩緩所有釋出。供試品亦可采用其他適宜的方法取出。用無菌注射器從每一容器中吸出藥液于無菌容器中混合，然后取樣檢査。4.3.1.6貼劑供試品取供試品，去掉防粘層，將粘貼面朝上放置在無菌玻璃或塑料器皿上，在粘貼面上覆蓋一層適宜的無菌多孔材料(如無菌紗布），避免貼膏劑粘貼在一起。將解決后的貼膏劑放入盛有適宜體積并具有表面活性劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）稀釋液的容器中，振蕩至少30分鐘。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第9頁4.3.2.接種和稀釋按下列規(guī)定進(jìn)行供試液的接種和稀釋，制備微生物回收實(shí)驗(yàn)用供試液。所加菌液的體積應(yīng)不超過供試液體積的1%。為確認(rèn)供試品中的微生物能被充足檢出，一方面應(yīng)選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法合用性實(shí)驗(yàn)。4.3.2.1實(shí)驗(yàn)組取上述制備好的供試液，加入實(shí)驗(yàn)菌液，混勻，使每lml供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于lOOcfu。4.3.2.2供試品對(duì)照組取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同實(shí)驗(yàn)組操作。4.3.2.3菌液對(duì)照組取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液，按實(shí)驗(yàn)組操作加人實(shí)驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收實(shí)驗(yàn)。4.3.2.4若因供試品抗菌活性或溶解性較差的因素導(dǎo)致無法選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方法合用性實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用適宜的方法對(duì)供試液進(jìn)行進(jìn)一步的解決。假如供試品對(duì)微生物生長(zhǎng)的克制作用無法以其他方法消除，供試液可通過中和、稀釋或薄膜過濾解決后再加人實(shí)驗(yàn)菌懸液進(jìn)行方法合用性實(shí)驗(yàn)。4.4抗菌活性的去除或滅活供試液接種后，按下列“微生物回收”規(guī)定的方法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。若實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值小于菌液對(duì)照組菌落數(shù)值的50%,可采用下述方法消除供試品的抑菌活性。4.4.1增長(zhǎng)稀釋液或培養(yǎng)基體積。4.4.2加入適宜的中和劑或滅活劑。中和劑或滅活劑（表2)可用于消除干擾物的抑菌活性，最佳在稀釋液或培養(yǎng)基滅菌前加入。若使用中和劑或滅活劑，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)設(shè)中和劑或滅活劑對(duì)照組，即取相應(yīng)量稀釋液替代供試品同實(shí)驗(yàn)組操作，以確認(rèn)其有效性和對(duì)微生物無毒性。中和劑或滅活劑對(duì)照組的菌落數(shù)與菌液對(duì)照組的菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5?2范圍內(nèi)。表2常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物可選用的中和劑或滅活方法戊二醛、汞制劑酚類、乙醇、醛類、醛類季銨化合物、對(duì)羥基苯甲酸、雙胍類化合物季銨化合物、碘、對(duì)羥基苯甲酸水銀水銀、汞化物、醛類EDTA、唆喏酮類抗生素磺胺類β內(nèi)酰胺類抗生素亞硫酸氫鈉吸附物稀釋法甘氨酸卵磷脂聚山梨酯巰基醋酸鹽硫代硫酸鹽鎂或鈣離子對(duì)氨基苯甲酸β內(nèi)酰胺酶4.4.3采用薄膜過濾法^4.4.4上述幾種方法的聯(lián)合使用。若沒有適宜消除供試品抑菌活性的方法，對(duì)特定實(shí)驗(yàn)菌回收的失敗，表白供試品對(duì)該實(shí)驗(yàn)菌具有較強(qiáng)抗菌活性，同時(shí)也表白供試品不易被該類微生物污染。但是，供試品也也許僅對(duì)特定實(shí)驗(yàn)菌株具有克制作用，而對(duì)其他菌株沒標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第10頁有克制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，在不影響檢查結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長(zhǎng)的更高稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法合用性實(shí)驗(yàn)。若方法合用性實(shí)驗(yàn)符合規(guī)定，應(yīng)以該稀釋級(jí)供試液作為最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行供試品檢査。4.5供試品中微生物的回收表1所列的計(jì)數(shù)方法合用性實(shí)驗(yàn)用的各實(shí)驗(yàn)菌應(yīng)逐個(gè)進(jìn)行微生物回收實(shí)驗(yàn)。微生物的回收可采用平皿法、薄膜過濾法或MPN法。4.5.1平皿法平皿法涉及傾注法和涂布法。表1中每株實(shí)驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平皿，以算術(shù)均值作為計(jì)數(shù)結(jié)果。傾注法：取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液lml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入15?20ml溫度不超過45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應(yīng)相應(yīng)增長(zhǎng)。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。涂布法：取15?20ml溫度不超過45℃的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，注人直徑90mm的無菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養(yǎng)基表面干燥。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基用量也應(yīng)相應(yīng)增長(zhǎng)。每一平板表面接種上述照“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液不少于0.1ml。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。4.5.2薄膜過濾法薄膜過濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45pm，直徑一般為50mm，若采用其他直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。供試品及其溶劑應(yīng)不影響濾膜材質(zhì)對(duì)微生物的截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤(rùn)濕濾膜。油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充足干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100ml?？倹_洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液適量（一般取相稱于lg、lml或10cm2的供試品，若供試品中所含的菌數(shù)較多時(shí)，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中，混勻，過濾。用適量的沖洗液沖洗濾膜。若測(cè)定需氧菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上；若測(cè)定霉菌和酵母總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。每株實(shí)驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。4.5.3MPN法MPN法的精密度和準(zhǔn)確度不及薄膜過濾法和平皿計(jì)數(shù)法，僅在供試品需氧菌總數(shù)沒有適宜計(jì)數(shù)方法的情況下使用，本法不合用于霉菌計(jì)數(shù)。若使用MPN法，按下列環(huán)節(jié)進(jìn)行。取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液至少3個(gè)連續(xù)稀釋級(jí)，每一稀釋級(jí)取3份lml分別接種至3管裝有9?10ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同法測(cè)定菌液對(duì)照組菌數(shù)。必要時(shí)可在培養(yǎng)基中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。接種管置30?35°C培養(yǎng)3天，逐日觀測(cè)各管微生物生長(zhǎng)情況。假如由于供試品的因素使得結(jié)果難以判斷，可將該管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至胰標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第11頁酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)1?2天，觀測(cè)是否有微生物生長(zhǎng)。根據(jù)微生物生長(zhǎng)的管數(shù)從表3查被測(cè)供試品每lg或每lml中需氧菌總數(shù)的最也許數(shù)。表3微生物最也許數(shù)檢索表生長(zhǎng)管數(shù)需氧菌總數(shù)最也許數(shù)95%置信限每管含樣品的g或ml數(shù)MPN/g或ml下限上限0.10.010.001000<309.4001309.501030.1100116.11.2170206.21.2170309.43.5351003.60.2171017.21.217102114351107.41.320111114351201143512115538130165382009.21.535201144352022053821015438211205382122799422021540221289942223599423029994231369943002359430138910430264161813104391813117517190標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第12頁312120303603131603038032093183603211503038032221030400323290909903302409099033146090198033211002004000333>1100注：表內(nèi)所列檢查量如改用lg(或ml)、0.lg(或ml)和O.Olg(或ml)時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)減少10倍；如改用O.Olg(或ml)、O.OOlg(或ml)和O.OOOlg(或ml)時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增長(zhǎng)10倍，其余類推。5.微生物計(jì)數(shù)法檢查5.1計(jì)數(shù)方法合用性實(shí)驗(yàn)中，采用平皿法或薄膜過濾法時(shí)，實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5?2范圍內(nèi)；采用MPN法時(shí)，實(shí)驗(yàn)組菌數(shù)應(yīng)在菌液對(duì)照組菌數(shù)的95%置信限內(nèi)。若各實(shí)驗(yàn)菌的回收實(shí)驗(yàn)均符合規(guī)定，照所用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。方法合用性確認(rèn)時(shí)，若采用上述方法還存在一株或多株實(shí)驗(yàn)菌的回收達(dá)不到規(guī)定，那么選擇回收最接近規(guī)定的方法和實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢査。5.2供試品檢查5.2.1檢查量：檢查量即一次實(shí)驗(yàn)所用的供試品量(g、ml或cm2)。一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于2個(gè)最小包裝的供試品，混合，取規(guī)定量供試品進(jìn)行檢查。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢查量為10g或10ml;膜劑為100cm2;貴重藥品、微量包裝藥品的檢查量可以酌減。檢查時(shí)，應(yīng)從2個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品，大蜜丸還不得少于4丸，膜劑還不得少于4片。5.2.2供試品的檢査按計(jì)數(shù)方法合用性實(shí)驗(yàn)確認(rèn)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測(cè)定。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于測(cè)定需氧菌總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)以稀釋液代替供試液進(jìn)行陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)應(yīng)無菌生長(zhǎng)，假如陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)査。5.3平皿法平皿法涉及傾注法和涂布法。除另有規(guī)定外，取規(guī)定量供試品，按方法合用性實(shí)驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和菌數(shù)測(cè)定，每稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平板。培養(yǎng)和計(jì)數(shù)除另有規(guī)定外，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在30?35°C培養(yǎng)3?5天，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板在20?25°C培養(yǎng)5?7天，觀測(cè)菌落生長(zhǎng)情況，點(diǎn)計(jì)平板上生長(zhǎng)的所有菌落數(shù)，計(jì)數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延生長(zhǎng)成片的平板不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級(jí)兩個(gè)平板的菌落數(shù)平均值不小于15，則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則需氧菌總數(shù)標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第13頁測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu的稀釋級(jí)、霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于lOOcfu的稀釋級(jí)，作為菌數(shù)報(bào)告的依據(jù)。取最髙的平均菌落數(shù)，算lg、lml或10cm2供試品中所含的微生物數(shù)，取兩位4效數(shù)字報(bào)告。如各稀釋級(jí)的平板均無菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以<1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。5.4薄膜過濾法除另有規(guī)定外，按計(jì)數(shù)方法合用性實(shí)驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備。取相稱于lg、lml或10cm2供試品的供試液，若供試品所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級(jí)的供試液，照方法合用性實(shí)驗(yàn)確認(rèn)的方法加至適量稀釋液中，立即過濾，沖洗，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)和計(jì)數(shù)培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿法，每張濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過lOOcfu菌數(shù)報(bào)告規(guī)則以相稱于lg、lml或10cm2供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長(zhǎng)，以<1報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過濾lg、lml或10cm2供試品），或<1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。5.5MPN法取規(guī)定量供試品，按方法合用性實(shí)驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和供試品接種，所有實(shí)驗(yàn)管在30?35X：培養(yǎng)3?5天，假如需要確認(rèn)是否有微生物生長(zhǎng)，按方法合用性實(shí)驗(yàn)擬定的方法進(jìn)行。記錄每一稀釋級(jí)微生物生長(zhǎng)的管數(shù)，從表3査每lg或lml供試品中需氧菌總數(shù)的最也許數(shù)。5.6結(jié)果判斷需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的總菌落數(shù)(涉及真菌菌落數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的總菌落數(shù)(涉及細(xì)菌菌落數(shù)）。若因沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌使霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)結(jié)果不符合微生物限度規(guī)定，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素）的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或其他選擇性培養(yǎng)基（如玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基)進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定。使用選擇性培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基合用性檢查。若采用MPN法，測(cè)定結(jié)果為需氧菌總數(shù)。各品種項(xiàng)下規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)解釋如下：lOcfu：可接受的最大菌數(shù)為20;102cfu：可接受的最大菌數(shù)為200;103cfu：可接受的最大菌數(shù)為2023，依此類推。若供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢査結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。6．控制菌檢查法（非無菌產(chǎn)品微生物限度：控制菌檢查法）6.1控制菌檢查法系用于在規(guī)定的實(shí)驗(yàn)條件下，檢査供試品中是否存在特定的微生物。當(dāng)本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合相應(yīng)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)按下列規(guī)定進(jìn)行檢查，涉及樣品取樣量和結(jié)果判斷等^6.1.1供試品檢出控制菌或其他致病菌時(shí)，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再復(fù)試。6.1.2供試液制備及實(shí)驗(yàn)環(huán)境規(guī)定同“非無菌產(chǎn)品微生物限度6.1.3檢查：微生物計(jì)數(shù)法(通則1105)”。標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第14頁6.1.4假如供試品具有抗菌活性，應(yīng)盡也許去除或中和。供試品檢查時(shí)，若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)有效性及對(duì)微生物無毒性。供試液制備時(shí)假如使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對(duì)微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。6.2培養(yǎng)基合用性檢查和控制菌檢查方法6.2.1合用性實(shí)驗(yàn)6.2.1.1供試品控制菌檢查中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行合用性檢査。6.2.1.2供試品的控制菌檢查方法應(yīng)進(jìn)行方法合用性實(shí)驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的控制菌檢查。6.2.1.3若檢查程序或產(chǎn)品發(fā)生變化也許影響檢查結(jié)果時(shí)，控制菌檢查方法應(yīng)重新進(jìn)行合用性實(shí)驗(yàn)。6.2.2菌種及菌液制備菌種實(shí)驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證實(shí)驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)CCMCC(B)26003〕銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa)￡CMCC(B)10104〕大腸埃希菌(EsdieWchacoa)CCMCC(B)44102〕乙型副傷寒沙門菌（SalmonellaparatyphiB)CCMCC(B)50094〕白色念珠菌（canidiaAlbicans)CCMCC(F)98001〕生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）CCMCC(B)64941〕菌液制備將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌分別接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，30?35°C培養(yǎng)18?24小時(shí)；將白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，20?25°C培養(yǎng)2?3天；將生孢梭菌接種于梭菌增菌培養(yǎng)基中置厭氧條件下30?35°C培養(yǎng)24?48小時(shí)或接種于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中30?35°C培養(yǎng)18?24小時(shí)。上述培養(yǎng)物用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在2?8°C，可在24小時(shí)內(nèi)使用。生孢梭菌孢子懸液可替代新鮮的菌懸液，孢子懸液可保存在2?8*C，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。6.2.3陰性對(duì)照為確認(rèn)實(shí)驗(yàn)條件是否符合規(guī)定，應(yīng)進(jìn)行陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)應(yīng)無菌生長(zhǎng)。如陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。6.2.4培養(yǎng)基合用性檢查6.2.4.1控制菌檢查用的成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的合用性檢查?？刂凭鷻z査用培養(yǎng)基的合用性檢查項(xiàng)目涉及促生長(zhǎng)能力、克制能力及指示特性的檢查。各培養(yǎng)基的檢查項(xiàng)目及所用的菌株見表1。6.2.4.2液體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力檢査分別接種不大于lOOcfu的實(shí)驗(yàn)菌(表1)于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不大于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管實(shí)驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。6.2.4.3固體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力檢査用涂布法分別接種不大于lOOcfu的實(shí)驗(yàn)菌（表1)于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢査規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不大于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特性應(yīng)一致。標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第15頁表1控制菌檢査用培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)能力、克制能力和指示特性控制菌檢査培養(yǎng)基特性實(shí)驗(yàn)菌株耐膽鹽革蘭陰性菌腸道菌增菌液體培養(yǎng)基紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力克制能力促生長(zhǎng)能力+指示特性大腸埃希菌、銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌、銅綠假單胞菌大腸埃希菌麥康凱液體培養(yǎng)基麥康凱瓊脂培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力克制能力促生長(zhǎng)能力+指樂特性大腸埃希菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌沙門菌RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力克制能力促生長(zhǎng)能力+指示特性指示能力乙型副傷寒沙門菌金黃色葡萄球菌乙型副傷寒沙門菌乙型副傷寒沙門菌銅綠假單胞菌溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力克制能力銅綠假單胞菌大腸埃希菌金黃色葡萄球菌甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力+指示特性克制能力金黃色葡萄球菌大腸埃希菌梭菌梭菌增菌培養(yǎng)基哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力促生長(zhǎng)能力生孢梭菌生孢梭菌白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基念珠菌顯色培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力促生長(zhǎng)能力+指示特性促生長(zhǎng)能力+指示能力克制能力白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌大腸埃希菌培養(yǎng)基克制能力檢査接種不少于lOOcfu的實(shí)驗(yàn)菌（表1)于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢査規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不小于規(guī)定的最長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)菌應(yīng)不得生長(zhǎng)。培養(yǎng)基指示特性檢査用涂布法分別接種不大于lOOcfu的實(shí)驗(yàn)菌（表1)于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不大于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基上實(shí)驗(yàn)菌生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特性、指示劑反映情況等應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基一致。6.3控制菌檢壷方法合用性實(shí)驗(yàn)6.3.1供試液制備按下列“供試品檢査”中的規(guī)定制備供試液。實(shí)驗(yàn)菌根據(jù)各品種項(xiàng)下標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第16頁微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)實(shí)驗(yàn)菌株，確認(rèn)耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法時(shí)，采用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為實(shí)驗(yàn)菌。合用性試狳按控制菌檢査法取規(guī)定量供試液及不大于lOOcfu的實(shí)驗(yàn)菌接人規(guī)定的培養(yǎng)基中；采用薄膜過濾法時(shí)，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加人實(shí)驗(yàn)菌，過濾后，注人規(guī)定的培養(yǎng)基或取出濾膜接人規(guī)定的培養(yǎng)基中。依相應(yīng)的控制菌檢査方法，在規(guī)定的溫度和最短時(shí)間下培養(yǎng)，應(yīng)能檢出所加實(shí)驗(yàn)菌相應(yīng)的反映特性。結(jié)果判斷上述實(shí)驗(yàn)若檢出實(shí)驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查方法進(jìn)行供試品檢查；若未檢出實(shí)驗(yàn)菌，應(yīng)消除供試品的抑菌活性[見非無菌產(chǎn)品微生物檢査：微生物計(jì)數(shù)法(通則1105)中的“抗菌活性的去除或滅活”]，并重新進(jìn)行方法合用性實(shí)驗(yàn)。6.3.2假如通過實(shí)驗(yàn)確證供試品對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的抗菌作用無法消除，可認(rèn)為受克制的微生物不易存在于該供試品中，選擇抑菌成分消除相對(duì)徹底的方法進(jìn)行供試品的檢查。6.4供試品檢査：供試品的控制菌檢查應(yīng)按經(jīng)方法合用性實(shí)驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行。6.5陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)：方法同供試品的控制菌檢查，對(duì)照菌的加量應(yīng)不大于lOOcfu。陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。6.6陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)：以稀釋劑代替供試液照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)應(yīng)無菌生長(zhǎng)。假如陰性對(duì)照有菌生:長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。7．實(shí)驗(yàn)技術(shù)7.1耐膽鹽革蘭陰性菌(Bile~TolerantGram-NegativeBacteria)7.1.1供試液制備和預(yù)培養(yǎng)取供試品，用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為稀釋劑照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法(通則1105)”制成1:10供試液，混勻，在20?25C培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)使供試品中的細(xì)菌充足恢復(fù)但不增殖(約2小時(shí))。7.1.2定性實(shí)驗(yàn)除另有規(guī)定外，取相稱于lg或lml供試品的上述預(yù)培養(yǎng)物接種至適宜體積(經(jīng)方法合用性實(shí)驗(yàn)擬定）腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，30?35°C培養(yǎng)24?48小時(shí)后，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，30?35°C培養(yǎng)18?24小時(shí)。假如平板上無菌落生長(zhǎng)，判供試品未檢出耐膽鹽革蘭陰性菌。7.1.3定最實(shí)驗(yàn)選擇和分離培養(yǎng)取相稱于o.lg、O.Olg和O.OOlg(或0.1ml、0.01ml和0.OOltnl)供試品的預(yù)培養(yǎng)物或其稀釋液分別接種至適宜體積(經(jīng)方法合用性實(shí)驗(yàn)擬定）腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，30?35℃培養(yǎng)24?48小時(shí)。上述每一培養(yǎng)物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，30?35℃培養(yǎng)18?24小時(shí)。結(jié)果判斷若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長(zhǎng)，則相應(yīng)培養(yǎng)管為陽性，否則為陰性。根據(jù)各培養(yǎng)管檢查結(jié)果，從表2查lg或lml供試品中具有耐膽鹽革蘭陰性菌的也許菌數(shù)。標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第17頁表2耐膽鹽革蘭陰性菌的也許菌數(shù)(N)各供試品量的檢査結(jié)果每lg(或lml)供試品中也許的菌數(shù)cfu0.lg或0.lml0.01g或0.01ml0.001g或0.001ml+++—++—-+---N>103102<N<10310<N<102N<10注：（1)+代表紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上有菌落生長(zhǎng)；一代表紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上無菌落生長(zhǎng)。(2)若供試品量減少10倍（如O.Olg或0_01ml，0.OOlg或0.001ml，0，0001g或0.0001ml)，則每lg(或lml)供試品中也許的菌數(shù)(N)應(yīng)相應(yīng)增長(zhǎng)10倍.7.2大腸埃希菌(Escherichiacoli)7.2.1供試液制備和增菌培養(yǎng)：取供試品:照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法（通則1105)”制成1:10供試液。取相稱于lg或lml供試品的供試液，接種至適宜體積(經(jīng)方法合用性實(shí)驗(yàn)擬定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30?35°C培養(yǎng)18?24小時(shí)。7.2.2選擇和分離培養(yǎng)：取上述培養(yǎng)物lml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，42?44℃培養(yǎng)24?48小時(shí)。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，30?35°C培養(yǎng)18?72小時(shí)。7.2.3結(jié)果判斷若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定實(shí)驗(yàn)，確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長(zhǎng)，或雖有菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。7.3沙門菌(Salmonella)7.3.1供試液制備和增菌培養(yǎng)：取10g或10ml供試品直接或:解決后接種至適宜體積（經(jīng)方法合用性實(shí)驗(yàn)擬定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30?35C培養(yǎng)18?24小時(shí)。選擇和分離培養(yǎng)取上述培養(yǎng)物0.1ml接種至10mlRV沙門增菌液體培養(yǎng)基中，30?35°C培養(yǎng)18?24小時(shí)。7.3.2取少量RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，30?35℃：培養(yǎng)18?48小時(shí)。沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)良好，菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。用接種針挑選疑似菌落于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)18?24小時(shí)，或采用其他適宜方法進(jìn)一步鑒定。7.3.3結(jié)果判斷：若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長(zhǎng)，且三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面為紅色、底層為黃色，或斜面黃色、底層黃色或黑色，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定實(shí)驗(yàn)，確證是否為沙門菌。假如平板上沒有菌落生長(zhǎng)，或雖有菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面未見紅色、底層未見黃色（或斜面黃色、底層未見黃色或黑色，判供試品未檢出沙門菌。標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第18頁7.4銅綠假單胞藺{Pseudomonasaeruginosa)7.4.1供試液制備和壜菌培養(yǎng)：取供試品，照“非無菌產(chǎn)品微:生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法（通則1105)”制成1:10供試液。取相稱于lg或lml供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法合用性實(shí)驗(yàn)擬定的）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻。30?35T：培養(yǎng)18?24小時(shí)。7.4.2選擇和分離培養(yǎng)取上述培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，30?35℃培養(yǎng)18?72小時(shí)。取上述平板上生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行氧化酶實(shí)驗(yàn)，或采用其他適宜方法進(jìn)一步鑒定，氯化酶實(shí)驗(yàn)將潔凈濾紙片置于平皿內(nèi)，用無菌玻棒取上述平板上生長(zhǎng)的菌落涂于濾紙片上，滴加新配制的1%二鹽酸N，iV-二甲基對(duì)苯二胺試液，在30秒內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶實(shí)驗(yàn)陽性，否則為陰性。7.4.3結(jié)果判斷：若溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上有:菌落生長(zhǎng)，且氧化酶實(shí)驗(yàn)陽性，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定實(shí)驗(yàn)，確證是否為銅綠假單胞菌。假如平板上沒有菌落生長(zhǎng)，或雖有菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，或氧化酶實(shí)驗(yàn)陰性，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。7.5金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)7.5.1供試液制備和增藺培養(yǎng)：取供試品，照“非無菌產(chǎn)品微:生物限度檢査：微生物計(jì)數(shù)法（通則1105)”制成1:10供試液。取相稱于lg或lml供試品的供試液，接種至適宜體積(經(jīng)方法合用性實(shí)驗(yàn)擬定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻。30?35°C培養(yǎng)18?24小時(shí)。7.5.2選擇和分離培養(yǎng)取上述培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，30?35*C培養(yǎng)18?72小時(shí)。7.5.3結(jié)果判斷若甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上有黃色菌落或外周有黃色環(huán)的白色菌落生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定實(shí)驗(yàn)，確證是否為金黃色葡萄球菌；若平板上沒有與上述形態(tài)特性相符或疑似的菌落生長(zhǎng)，或雖有相符或疑似的菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。7.6梭菌（Clostridium）7.6.1供試液制備和熱解決：取供試品，照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法（通則1105)”制成1:10供試液。取相稱于lg或lml供試品的供試液2份，其中1份置80℃保溫10分鐘后迅速冷卻。7.6.2增菌、選擇和分離培養(yǎng)：將上述2份供試液分別接種至適宜體積(經(jīng)方法合用性實(shí)驗(yàn)擬定）的梭菌增菌培養(yǎng)基中，置厭氧條件下30?35°C培養(yǎng)48小時(shí)。取上述每一培養(yǎng)物少量，分別涂抹接種于哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，置厭氧條件下30?35°C培養(yǎng)48?72小時(shí)。7.6.3過氯化氫酶實(shí)驗(yàn)：取上述平板上生長(zhǎng)的菌落，置潔凈玻片上，滴加3%過氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產(chǎn)生，為過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)陽性，否則為陰性。7.6.4結(jié)果判斷：若哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上有厭氧桿菌生長(zhǎng)（有或無芽孢），且過氧化氫酶反映陰性的，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定實(shí)驗(yàn)，確證是否為梭菌；假如哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有厭氧桿菌生長(zhǎng)，或雖有相符或疑似的菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，或過氧化氫酶反映陽性，判供試品未檢出梭菌。標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第19頁7.7白色念珠菌（Candidaalbicans)7.7.1供試液制備和堆菌培養(yǎng)：取供試品，照“非無菌產(chǎn)品微:生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法（通則1105)”制成1:10供試液。取相稱于lg或lml供試品的供試液，接種至適宜體積(經(jīng)方法合用性實(shí)驗(yàn)擬定）的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，混勻，30?35℃培養(yǎng)3?5天。7.7.2選擇和分離：取上述預(yù)培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，30?35°C培養(yǎng)24?48小時(shí)。白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落呈乳白色，偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時(shí)間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有皺褶。挑取疑似菌落接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24?48小時(shí)(必要時(shí)延長(zhǎng)至72小時(shí)），或采用其他適宜方法進(jìn)一步鑒定。7.7.3結(jié)果判斷：若沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長(zhǎng)，且疑似菌在念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的菌落呈陽性反映，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定實(shí)驗(yàn)，確證是否為白色念珠菌；若沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長(zhǎng)，或雖有菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，或疑似菌在念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的菌落呈陰性反映，判供試品未檢出白色念珠菌。7.8稀釋液：稀釋液配制后，應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。（1）PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液照無菌檢査法（通則1101)制備。（2）pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液、PH7.2無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液照緩沖液（通則8004)配制后，過濾，分裝，滅菌。如需要，可在上述稀釋液滅菌前或滅菌后加人表面活性劑或中和劑等。（3）0.9%無菌氯化鈉溶液取氯化鈉9.0g,加水溶解使成1000ml，過濾，分裝，滅菌。培養(yǎng)基及其制備方法7.9培養(yǎng)基及其制備方法培養(yǎng)基可按以下處方制備（見中國藥典2023年版，通則1107非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)）（第148頁-149頁），也可使用按該處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。配制后，應(yīng)按驗(yàn)證過的高壓滅菌程序滅菌。8.附件附件1《微生物限度檢查記錄》（KF-SOP-07-13（J）-01）附件2《控制菌檢查記錄》（KF-SOP-07-13(J)-02）附件3《計(jì)數(shù)培養(yǎng)基合用性檢查記錄》（KF-SOP-07-13(J)-03）附件4《控制菌檢查培養(yǎng)基合用性檢查記錄》（KF-SOP-07-13(J)-04）附件5《陽性菌使用記錄》（KF-SOP-07-13(J)-05）

附件1微生物限度檢查記錄檢查編號(hào)：KF-SOP-07-13（J）-01檢品名稱檢品來源檢品批號(hào)檢查日期年月日包裝規(guī)格報(bào)告日期年月日批量kg（件）檢查依據(jù)中國藥典2023年版四部供試品制備：常規(guī)法供試品g（ml）加無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液（PH7.0）（配制批號(hào)）至ml需氧菌總數(shù)30~35℃(5)霉菌和酵母菌總數(shù)23~28℃(7)培養(yǎng)基配制批號(hào)：培養(yǎng)時(shí)間月日時(shí)～月日時(shí)培養(yǎng)基配制批號(hào)：培養(yǎng)時(shí)間月日時(shí)～月日時(shí)原液1：101：100陰性對(duì)照原液1：101：100陰性對(duì)照12121212121224h24h48h48h72h72h96h96h120h120h144h168h平均平均結(jié)果cfu/g、ml結(jié)果cfu/g、ml大腸埃希菌檢查菌種編號(hào)：實(shí)驗(yàn)方法培養(yǎng)基配制批號(hào)培養(yǎng)時(shí)間h培養(yǎng)溫度℃結(jié)果備注供試品陽性對(duì)照陰性對(duì)照BLMUG靛基質(zhì)結(jié)論本品依據(jù)中國藥典2023年版四部《通則1105》和《通則1106》進(jìn)行檢查，結(jié)果。檢查人復(fù)核人附件2控制菌檢查記錄檢查編號(hào)：KF-SOP-07-13（J）-02檢品名稱檢品來源檢品批號(hào)檢查日期年月日包裝規(guī)格報(bào)告日期年月日批量kg（件）檢查依據(jù)中國藥典2023年版四部大腸埃希菌檢查供試品制備：取供試品（g/ml/cm2），加PH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至ml，混勻，作為的供試液。培養(yǎng)基信息：①BL配制批號(hào)：②MUG配制批號(hào)：③EMB配制批號(hào)：培養(yǎng)溫度：培養(yǎng)時(shí)間：培養(yǎng)箱編號(hào)：BLMUG靛基質(zhì)EMB革蘭染色、鏡檢IMRV—PC乳糖發(fā)酵供試品陰性對(duì)照陽性對(duì)照結(jié)果□檢出□未檢出（規(guī)定：）大腸菌群檢查供試品制備：取供試品（g/ml），加PH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至ml，混勻，作為的供試液。培養(yǎng)基信息：①乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基配制批號(hào)：②EMB配制批號(hào)：③乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基配制批號(hào)：培養(yǎng)溫度：培養(yǎng)時(shí)間：培養(yǎng)箱編號(hào)：乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基EMB乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基供試品10-110-210-3陰性對(duì)照結(jié)果（規(guī)定：）沙門菌檢查供試品預(yù)增菌：取供試品（g/ml），直接接種于200ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，混勻，即得。培養(yǎng)基信息：①營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配制批號(hào)：②四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基配制批號(hào)：③膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基配制批號(hào)：④EMB配制批號(hào)：培養(yǎng)溫度：培養(yǎng)時(shí)間：培養(yǎng)箱編號(hào)：