FMR1基因突變(CGG重復數(shù))檢測試劑盒（熒光PCR毛細電泳片段分析法）（CSZ2200093）

受理號：CSZ2200093體外診斷試劑產(chǎn)品注冊技術審評報告產(chǎn)品中文名稱：基因突變(CGG重復數(shù)檢測試劑盒（熒光PCR毛細電泳片段分析法）產(chǎn)品管理類別：第三類申請人名稱：北京華瑞康源生物科技發(fā)展有限公司國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術審評中心—1—目錄基本信息………………......…3………..…………………..…3…………..………………..…3三、生產(chǎn)地址……………..…3技術審評概述…………..……4……………..……………..……4…………..………..……6……………..……………四、產(chǎn)品受益風險判定……………………14綜合評價意見………………16—2—基本信息一、申請人名稱北京華瑞康源生物科技發(fā)展有限公司二、申請人住所北京市昌平區(qū)科技園區(qū)超前路甲1號131層108室三、生產(chǎn)地址北京市昌平區(qū)科技園區(qū)超前路甲1號6號樓1021037號樓102室，號樓室—3—技術審評概述一、產(chǎn)品概述（一）產(chǎn)品主要組成成分Taq酶、ROX標記、正常對照品、陽性對照品、陽性對照品、陽性對照品、去離子水，詳見表1。表1產(chǎn)品主要組成成分規(guī)格規(guī)格組分名稱主要成分（50人份盒）（100人份/盒）引物溶液60μ管×1120μ管×1特異性熒光引物主反應混合1.2mL/管×11.2mL/管×2dNTPs混合液、等液Taq酶20μ管×140μ管×1酶在測序儀進行片段分析ROX標記50μ管×1100μ管×1用的熒光分子量標記物CGG重復數(shù)小于45質粒正常對照品μL/管×110μ管×1DNA陽性對照品CGG重復數(shù)45-54質粒μL/管×110μ管×11DNA—4—陽性對照品CGG重復數(shù)55-200質粒μL/管×110μ管×12DNA陽性對照品μL/管×110μ管×1CGG重復數(shù)>200質粒DNA3無DNA酶/RNA酶的去離去離子水200μ管×1200μ管×1子水注：本產(chǎn)品為多組分試劑盒，不同批號試劑盒中各組分不可互換。試劑盒具體組成成分、配套試劑詳見產(chǎn)品說明書。（二）產(chǎn)品預期用途該產(chǎn)品用于體外人EDTA-K2抗凝全血樣本中（CGG重復數(shù)）重復序列多態(tài)性的檢測。目前我國年月發(fā)布的《脆性X綜合征的臨床實踐指南》和美國醫(yī)學與遺傳學會（AmericanCollegeofMedicalGeneticsACMGCGG重復次數(shù)將FMR1基因分為四種基因型：CGG重復數(shù)≤4445-5455-200200FMR1基因全突變導致脆性X綜合征。X綜合征是一種X染色體連鎖的單基因遺傳病，發(fā)病率在1/8000～1/4000之間。臨床主要表現(xiàn)是重度智力低下，60%～80%的男性患者還表現(xiàn)出多動癥或自閉癥。其致病基因是—5—位于Xq27.3的FMR1（FragileXMentalReterdation1）基因，該基因編碼脆性X智力低下蛋白（XMentalReterdationProtein，F(xiàn)MRPFMRP在大腦神經(jīng)細胞的發(fā)育中FMR1基因非編碼區(qū)的重復數(shù)＞發(fā)生全突變時，導致FMR1基因沉默，F(xiàn)MRP表達量減少或缺失，造成大腦神經(jīng)細胞發(fā)育異常，臨床表現(xiàn)出重度的智力低下、發(fā)育遲緩等癥狀。試劑盒檢測結果用于男性脆性X綜合征的輔助診斷，不用于胎兒、新生兒篩查，不能采用該單一指標進行診斷。（三）產(chǎn)品包裝規(guī)格50人份盒、100人份/（四）產(chǎn)品檢驗原理本試劑盒以人的基因組為模板，采用獨特的反應混合液和FAMFMR1基因的CGG重復序列進行PCR擴增。帶有熒光信號的擴增產(chǎn)物可以被毛細管電泳儀精確識別和定位，通過與ROX標記進行對比，可判定擴增產(chǎn)物片段的長度，進而換算出檢測樣本的CGG重復數(shù)。二、臨床前研究概述（一）主要原材料1.主要原材料的選擇—6—本產(chǎn)品的主要原材料包括引物、Taq酶、dNTPs混合液、反應緩沖液和不同大小DNA片段，主要原材料均為外購。申請人選擇有資質的供應商提供原料，通過功能性試驗篩選出最佳原材料和供應商，制定了各主要原材料質量標準并經(jīng)檢驗合格。2.參考品和對照品的設置情況本產(chǎn)品企業(yè)參考品包括陰性參考品、陽性參考品、最低檢出限參考品、精密度參考品。陽性參考品9FMR1基因的不同突變型，由2份中間型、3份前突變型、2份全突變型，以及1份FMR1基因野生型和全突變型嵌合體樣本、1份基因前突6FMR1基因野生型。最低檢測限參考品9份，涵蓋本試劑盒可檢出的FMR1232份全突變1份基因野生型和全突變型嵌合體樣本、1份FMR13份，F(xiàn)MR1基因的中間型、前突變型及全突變型各1份。企業(yè)參考品來源于臨床樣本和細胞系，通過提取的基因組DNA制備并確認。本試劑盒還同時設置了陽性對照與陰性對照，對照品由質粒DNA構成，用于檢測過程中試劑和儀器的質量控制。其中陽—7—性對照由陽性對照品、陽性對照品、陽性對照品，合計三CGG重復數(shù)為46±1的中間型、CGG重復數(shù)為118±1的前突變型、CGG重復數(shù)為＞200的全突變型構成。其中陰性對照由正常對照品，CGG重復數(shù)為29±1的野生型構成。（二）生產(chǎn)工藝及反應體系研究樣品采集及提取方法研究、全血用量及提取效果的研究、DNA的提取效率和純度的研究。對PCR反應液中各成分的用量方面進行了：引物濃度研究、dNTPs濃度研究、Taq酶用量研究、ROX標記的研究等。對PCR擴增參數(shù)的研究進行了：退火溫度、退火時間、延伸的溫度、延伸的時間、循環(huán)數(shù)等。對毛細管電泳的研究進行了：PCR擴增產(chǎn)物上機量、PCR變性條件優(yōu)化研究、毛細管電泳實驗條件的研究、毛細管電泳實驗電泳程序設置研究等。并對產(chǎn)品適配的兩種機型進行了研究。通過功能性實驗，最終確定了最佳的反應體系。申請人根據(jù)試劑盒中試劑及組件的主要生產(chǎn)工藝的研究結果，確定了最佳的生產(chǎn)工藝。（三）分析性能評估—8—本產(chǎn)品分析性能評估內(nèi)容包括準確度、精密度、最低檢測限、分析特異性、適用機型與核酸提取試劑性能的研究。準確度研究中，申請人使用三批成品試劑盒在所有適用機型上，分別對陰性企業(yè)參考品和陽性企業(yè)參考品進行檢測，檢測結果顯示陰性企業(yè)參考品、陽性企業(yè)參考品符合率100%。同47XXXFMR1基因缺失樣本進一步對試劑盒準確性進行了研究，并與國外上市試劑盒進行對比研究，研究結果顯示本試劑盒檢測結果的陽性符合率、陰性符合率均為100%，試劑盒的準確性符合設計要求。精密度研究中，申請人對覆蓋3個基因型（中間型、前突變型、全突變型）閾值附近的臨床樣本，在兩個實驗室，由不同操作者在所有適用機型上，使用三批次的試劑，設置2個不同濃度水平，每個濃度重復3次，上午和下午各做一次，進行20天檢測，分別對日內(nèi)日間、批內(nèi)批間、室間(點)還對野生型，中間型，前突變型，全突變型相互間不同比例的12個嵌合組合的臨床樣本，在兩個實驗室，由不同操作者在所有適用機型上，使用三批次的試劑，設置2濃度水34天檢測，—9—分別對日內(nèi)/日間、批內(nèi)/批間、室間(不同地點)、人員間、不同儀器之間的檢測結果進行分析。結果顯示本產(chǎn)品對精密度參考品的日內(nèi)/日間、批內(nèi)/批間、人員間、儀器間和室間的檢測變異系數(shù)均不大于5%。最低檢測限研究中，申請人使用三批成品試劑盒在所有適用機型上，分別對企業(yè)參考品和臨床的樣本進行檢測限的考察及驗證，對四個基因型（野生型、中間型、前突變型、全突變型）的不同DNA濃度的臨床樣本進行檢測，確定產(chǎn)品最低檢測10ng/μ。進一步對包含四個基因型的最低檢測限參考品在所有適用機型上分別進行驗證，結果顯示10ng/μL的DNA濃度設置合理。在嵌合體的最低檢測限研究中，申請人使用三批試劑盒對兩種基因型為陽性(前突變型、全突變型)的嵌合型樣10ng/μL檢測限占比為15%。進一步對包含不同基因型別的另外同嵌合比例的嵌合體樣本在10ng/μL的總核酸添加量時進行驗證，最終確認試劑盒最低檢測限為10ng/L；嵌合型樣本的嵌合比例最低為15%。分析特異性研究中，申請人進行了干擾研究和交叉反應研究。在干擾研究中，對常見的干擾物質（如總膽紅素、甘油三酯、膽固醇、溶血樣本、血紅蛋白、白蛋白）以及常見治療性—10—物質進行了研究，結果顯示血液中50g/L白蛋白、200g/L血紅蛋白、1040nmol/L雌三醇、64nmol/L孕酮，513umol/L素，37mmol/L甘油三酯，13mmol/L膽固醇對試劑盒的檢測結果47XXX可能存在的交叉反應進行研究，結果顯示對本試劑盒的檢測結果均不造成影響。適用機型的研究中，G1000基因擴增儀（型號：TC-96/G/H(b)B，杭州博日科技股份有限公司）；基因分析儀GeneticAnalyzer（型號：3500xL3500DxLifeTechnologiesHoldingsLtd）作為研究對象，申請人對試劑盒的陰陽性密度以及室間精密度進行評估，檢測結果均符合試劑盒的設計要求，同時也滿足臨床的實際需求。核酸提取試劑性能的研究中，申請人對配套使用的核酸提取試劑盒提取的DNA的提取效率、提取后核酸純度和濃度進行研究，結果顯示核酸提取試劑性能滿足檢測系統(tǒng)的要求。（四）陽性判斷值或參考區(qū)間研究申請人首先采用ROC曲線的方式建立試劑盒的陽性判斷值，——收集包括野生型、中間型、前突變型、全突變型的臨床樣本進行檢測，對數(shù)據(jù)進行ROC曲線分析，與臨床診斷結果比較，確定CGG＞200CGG重復數(shù)計算公式及各參數(shù)進行了研究，確認了最佳的CGG重復數(shù)計算公式以及公式內(nèi)各參數(shù)的取值。申請人然后使用臨床樣本對FMR1基因型的陽性判斷值進行了驗證，研究結果顯示所有樣本的CGG重復數(shù)以及基因型檢測結果均與臨床檢驗結果一致。（五）穩(wěn)定性研究申請人對產(chǎn)品的實時穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性和使用穩(wěn)定性進行了研究，確定了在各種條件下試劑的有效保存時間。實時穩(wěn)定性研究：分別使用三批試劑盒，按規(guī)定貯存溫度61213-20℃±℃條件下，可穩(wěn)定保存12運輸穩(wěn)定性研究：分別使用三批試劑盒，按規(guī)定貯存溫度進行模擬運輸，模擬冷鏈運輸8天，分別在運輸前、運輸后、過效期，對試劑盒性能指標進行檢測確定產(chǎn)品在規(guī)定貯存溫度下的運輸對試劑盒性能無影響，運輸后可以在規(guī)定有效期內(nèi)正常使用。—12—使用穩(wěn)定性研究：通過開蓋模擬操作后4次檢測，證明試劑盒在開蓋后54個月內(nèi)使用。通過模擬凍融操作進行6次檢測，確認試劑盒反復凍融次數(shù)5次以內(nèi)可以正常使用。此外，申請人對樣本穩(wěn)定性進行了研究，結果顯示產(chǎn)品性能均能滿足產(chǎn)品說明書要求。三、臨床評價概述申請人在首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院、北京大學第一醫(yī)院、首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院共三家臨床機構完成了臨床試驗。采用試驗用體外診斷試劑分別與脆性X綜合征臨床診斷結果及臨床公認的檢測技術AmplideXFMR1Kit進行比較研究，評價試驗體外診斷試劑臨床性能。入組病例以有不明原因智力障礙礙，語言發(fā)育遲緩，特殊面容（如大頭、臉瘦長、前額突出、三指間類型比例大）等相關癥狀的男性兒童為主，樣本類型為EDTA1040變型111例，非全突變型927試驗結果顯示，試驗體外診斷試劑與與脆性X綜合征臨床診斷結果對比，靈敏度98.21%95%CI93.72%99.51%特—13—異度99.89%（99.39%99.98%AmplideXFMR1PCRKit100%（95%CI96.65%，100%100%95%CI：99.59%100%。此外臨床試驗共計入組50個脆性XX7X100%；母親未攜帶致病基因家系22個的男性成員未見脆性X綜合征相關表現(xiàn)。綜上所述，該產(chǎn)品臨床試驗設計符合《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》的相關要求。臨床試驗結果顯示該產(chǎn)品與已上市同類產(chǎn)品一致性較好。四、產(chǎn)品受益風險判定YY/T0316-2016《醫(yī)療器械風險管理對醫(yī)療器械的應（一）受益評估產(chǎn)品用于體外人EDTA-K2抗凝全血樣本中FMR1基因突變（CGG數(shù)為最終基因型判定，最終確定FMR1基因是否為全突變型用于男性脆性X對患者的臨床診斷應結合其癥狀、體征、其它實驗室檢查及治—14—療反應等情況結合考慮。孤獨譜系障礙、多動癥、行為異常及癲癇的患兒進行檢測，以輔助臨床對脆性X綜合征的診斷。臨床試驗結果與疾病臨床診斷進行對比分析，本試劑盒靈敏度與特異性良好。（二）風險評估申請人對已知危險（源）進行風險評價，按照風險可接受準則判斷每個危險（源）的風險是否達到可接受水平，對合理收益分析既判定為不可接受的風險采取控制措施，并對具體措施進行實施驗證，同時重新對采取措施后的風險進行估計，確認其風險水平是否可接受。但為保證用械安全，基于對主要剩余風險的規(guī)避，需要在說明書中提示以下信息：1.預期用途：該產(chǎn)品用于體外人EDTA-K2抗凝全血樣本中FMR1基因突變（CGG重復數(shù)）重復序列多態(tài)性的檢測。試劑盒檢測結果用于男性脆性X綜合征的輔助診斷，不用于胎兒、新生兒篩查，不能采用該單一指標進行診斷。2.警示及注意事項：產(chǎn)品說明書中介紹了該產(chǎn)品檢驗方法的局限性及使用中的注意事項?！?5—綜合評價意見73948號）等相關醫(yī)療器械法規(guī)與配套規(guī)章，經(jīng)對申請人提交的注冊申報資料進行系統(tǒng)評價,申報產(chǎn)品符合安全性、有效性的要求，符合現(xiàn)有認知水平，建議準予注冊。2024年3月15日附件：產(chǎn)品說明書—16—基因突變重復數(shù)檢測試劑盒（熒光毛細電泳片段分析法）說明書【產(chǎn)品名稱】PCR毛細電泳片段分析法）【包裝規(guī)格】50人份盒、100人份/【預期用途】該產(chǎn)品用于體外人2抗凝全血樣本中CGG重復數(shù)）重復序列多態(tài)性的檢測。目前我國年月發(fā)布的《脆性X綜合征的臨床實踐指南》1】和美國醫(yī)學與遺傳學會（AmericanCollegeofMedicalGenetics，）的指南均按照CGG重復次數(shù)將基因分為四種基因型：CGG重復數(shù)≤44為正常型”或野生型”45-54之間為中間型”或者灰區(qū)”55-200之間為前突變型200以上時為全突變型”基因全突變導致脆性X綜合征。脆性X綜合征是一種X染色體連鎖的單基因遺傳病，發(fā)病率在1/4000~1/8000之間260-80%的男性患者還表現(xiàn)出多動癥或自閉癥【3。其致病基因是位于Xq27.3的—17—（FragileXMentalReterdation1）基因，該基因編碼脆性X智力低下蛋白（FragileXMentalReterdationProtein，F(xiàn)MRPFMRP在大腦神經(jīng)細胞的發(fā)育中起到至關重要的作用4基因非編碼區(qū)的CGG重復數(shù)＞200發(fā)生全突變時，導致基因沉默，F(xiàn)MRP表達量減少或缺失，造成大腦神經(jīng)細胞發(fā)育異常，臨床表現(xiàn)出重度的智力低下、發(fā)育遲緩等癥狀56。試劑盒檢測結果用于男性脆性X綜合征的輔助診斷，不用于胎兒、新生兒篩查，不能采用該單一指標進行診斷?！緳z測原理】本試劑盒以人的基因組DNA熒光標記的引物，對CGG重復序列進行擴增。帶有ROX標記進行對比，可判定擴增產(chǎn)物片段的長度，進而換算出檢測樣本的CGG重復數(shù)。【主要組成成分】組分名稱規(guī)格（50人份/盒）規(guī)格（100人份/盒）主要成分引物溶液60μL/管120μL/管特異性熒光引物主反應混合液1.2mL/管1.2mL/管dNTPs混合液、2+等酶20μL/管40μL/管酶ROX標記50μL/管100μL/管在測序儀進行片段分析用的熒光分子量標記物正常對照品5μL/管10μL/管CGG重復數(shù)小于45質?！?8—陽性對照品15μL/管10μL/管CGG重復數(shù)45-54質粒陽性對照品25μL/管10μL/管CGG重復數(shù)55-200質粒陽性對照品35μL/管10μL/管CGG重復數(shù)>200質粒去離子水200μL/管200μL/管無酶/RNA酶的去離子水注：本產(chǎn)品為多組分試劑盒，不同批號試劑盒中各組分不可互換。核酸提取試劑盒需自備，使用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑試劑盒（京海械備20150135有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑試劑盒（京昌械備20200001號【儲存條件及有效期】1.-20℃℃避光保存，有效期為個月。2.試劑盒反復凍融不超過5-20℃℃避光保存4個月。3.生產(chǎn)日期、有效期見標簽。【適用儀器】G1000TC-96/G/H(b)BGeneticAnalyzer（型號：3500xL3500Dx，HoldingsLtd）【樣本要求】1.推薦使用新鮮2抗凝全血樣本。2.全血樣本保存℃～℃下保存5天；-25℃~-15℃保存3個月；-80℃~-60℃保存—19—個月。全血樣本反復凍融次數(shù)不超過3次。3.DNA樣本保存新提取出的℃℃保存3天，-25℃℃保存6個月，-80℃~-60℃保存52個月。樣本反復凍融次數(shù)不超過5次?！緳z驗方法】1.樣本制備1.1將2抗凝全血樣本使用核酸提取或純化試劑試劑盒進行提取，提取過程嚴格按照說明書進行。1.2提取后的樣本，其OD260/OD280的比值應在1.82.0之間；稀釋后的濃度范圍應在10～25ng/μL酶/RNA與核酸平行提取。2.試劑配制2.1酶和ROX標記以外的試劑盒組份放置于室溫，使其緩慢融化至室溫，充分震蕩混勻；酶用前需移液器輕微吹打混勻58次。2.2n=樣本數(shù)+4（對照品數(shù)）+1-15℃～-25℃避光保存。2.3PCR反應體系如下所示—20—加入組分1個反應（）主反應混合液21.4引物1.2酶0.4樣本（10～25ng/μL）2.0注：樣本在加樣區(qū)樣本制備區(qū)進行。3.加樣處理好的待測樣本、空白對照各2μL，正常對照品、陽性對照品1、陽性對照品2、陽性對照品3各1μL分別加入準備好的PCR反應液管/96孔板中。3.225μL，用去離子水補齊。4.PCR擴增將PCR反應液管孔板按一定順序放入PCR程序：循環(huán)數(shù)溫度時間1次98℃5分鐘97℃35秒30次57℃35秒68℃4分鐘1次72℃10分鐘1次4℃恒定注：擴增結束后的PCR產(chǎn)物，在進行毛細管電泳前，可在-25℃～-15℃保存7—21—5.毛細管電泳實驗5.1將ROX標記放置于室溫下融化，使用前需充分震蕩混勻。5.2每份PCR產(chǎn)物按照下表配制片段分析體系，加入毛細管電泳專用的96:組份名稱加入量（）Hi-Di甲酰胺ROX標記1PCR產(chǎn)物1.5共計14注：以上體系需用移液器充分混勻，為配合毛細管電泳儀的通道數(shù)量，沒有PCR產(chǎn)物的樣本孔應加入的Hi-Di細管當中。5.3將96孔板貼上封膜震蕩后離心，放置于基因擴增儀準備變性。5.4在95℃變性5分鐘后，溫度快速降至-20℃并持續(xù)5分鐘。5.5將96孔板裝入基因分析儀的卡槽當中，經(jīng)毛細管電泳后，進行片段分析，并保存數(shù)據(jù)。6.基因分析儀程序設置使用基因分析儀(3500xL3500Dx)自帶的DataCollection軟件進7.基因分析儀下機數(shù)據(jù)的結果分析應用GeneMapper?V6.0軟件對基因分析儀所收集到原始下機數(shù)據(jù)進行分析?！?2—7.1導入數(shù)據(jù)導入原始下機數(shù)據(jù)(.fsa的后綴文件)到GeneMapper?分子內(nèi)標信息對每個樣本的擴增產(chǎn)物峰的電泳位置進行確定。7.2導入通用分析參數(shù)文件對于第一次使用GeneMapper?軟件來分析本公司產(chǎn)品的原始下機數(shù)據(jù)前，需要導入一些通用分析參數(shù)文件。如果不是第一次使用，請直接進入7.3。7.2.1在GeneMapperManager選項卡里導入進入GeneMapper?GeneMapperManager，在該對話框中選擇AnalysisMethord選項卡，并點擊Import，導入本公司提供的AnalysisMethordSetting、PlotSetting、Size文件。7.2.2在PanelManager選項卡里導入進入GeneMapper?PanelManager，點擊ImportPanelsPanelImportSet，導入本公司提供的Bin文件。7.3數(shù)據(jù)分析7.3.1在GeneMapper?V6.0fileSampletoProject，選中待分析樣本，點擊List，點擊，樣本文件將會顯示在窗口的右側?！?3—7.3.2在GeneMapper?V6.0軟件界面的Samples頁面，選擇對應的Setting、AnalysisMethord、Panel、SizeStandard。然后從Analysis菜單選擇Analyze(或者菜單欄下方的綠色三角)ok就開始了自動處理數(shù)據(jù)。7.3.3GeneMapper?軟件處理數(shù)據(jù)完畢后，選中所有文件，點擊SizeMatchEditor查看所有樣本的ROX標記是否都被正確標記上。7.3.3.1如果有ROXAdd峰。7.3.3.2如果出現(xiàn)無法正確標記部分或全部ROX段分析。7.3.4確認所有DisplayPlotsPlotSetting界面。7.4目標峰判斷7.4.1擴增產(chǎn)物峰值會自動標記出，判讀目標峰的標準如下：基因型判讀標準FMR1基因野生型及中間型區(qū)域峰；當左側的峰值高于右側峰值的，左右峰均判讀為目標峰。FMR1基因前突變型及全突變型1個主峰，為目標峰。7.4.2()—24—的，此為雜峰。7.4.3進入Genotypes界面，點擊Export按鈕導出Genotypes的文件。該文件里的SampleFile就是指樣本名稱；Size就是指目標峰的數(shù)，即Peaki。7.4.4將所有目標峰的分子大小標記為Peaki。將Peaki代入以下公式進行計算，得出CGGi的值。注：理論上，0264.1，0取值2.962。8.質量控制8.1正常對照品選擇目標峰，將其分子大小標記為Peaki進行計算，CGGi為29±1。8.2陽性對照品1選擇目標峰，將其分子大小標記為Peaki進行計算，CGGi為46±1。8.3陽性對照品2選擇目標峰，將其分子大小標記為，進行計算，i為。8.4陽性對照品3選擇目標峰，將其分子大小標記為，進行計算，i＞200?！娟栃耘袛嘀怠炕蛐完栃耘袛嘀蹬凶x依據(jù)國內(nèi)外指南[1][10]，基因各種CGG—25—重復序列長度的基因型臨界值：CGG重復數(shù)判定CGGi＞200FMR1基因全突變型55≤CGGi≤200FMR1基因前突變型45≤CGGi≤54FMR1基因中間型【檢驗結果的解釋】1.判斷依據(jù)bp值計算得到的CGG重復數(shù)，以最大CGG數(shù)為最終基因型判定。表1檢測結果判讀表CGG重復數(shù)峰判讀方法基因型判定CGGi≤441個或者2個以上的目標峰FMR1基因野生型以最大CGG

45≤CGGi≤541個或者2個以上的目標峰FMR1基因中間型

數(shù)為最終基因55≤CGGi≤2001個或者2個以上的目標峰FMR1基因前突變型型判定CGGi＞2001個或者2個以上的目標峰FMR1基因全突變型2.由于基因位于X染色體，因此目標峰的數(shù)量會隨性別變化：樣本性別目標峰數(shù)量備注男1個一般男性樣本≥2個男性嵌合體樣本女1個兩條X染色體上的FMR1基因CGG重復數(shù)相同)2個若兩條X染色體上的FMR1基因CGG重復數(shù)不同)一般女性樣本≥3個女性嵌合體樣本3.報告檢測結果時，多個目標峰值用隔開每個CGG重復數(shù)。4.對于檢測結果重復數(shù)目在195~200床癥狀綜合分析。【檢驗方法的局限性】1.本試劑盒的檢測結果會受到模板質和量的影響，而模板的—26—提取GeneticAnalyzer儀器狀況等因素的影響，使實驗結果無法分析。使用者必須了解檢測過程中可能存在的潛在風險。2.本試劑盒僅能檢測由于基因CGG擴增為全突變導致的脆性X綜合征。無法檢測由于基因內(nèi)部其它突變造成的脆性X綜合征。3.本試劑盒在CGG重復數(shù)大于200數(shù)?！井a(chǎn)品性能指標】1.嵌合體檢出限12種嵌合體組合，每個組合中嵌合型的最低檢測限均占比為15%。表2主要基因型和嵌合基因型樣本的不同檢出限嵌合基因型野生型中間型前突變型全突變型

主要基因型野生型/√√√中間型√/√√前突變型√√/√全突變型√√√/2.企業(yè)參考品檢測2.1陰性參考品符合率陰性符合率（基因型/基因型）為6/6；2.2陽性參考品符合率陽性符合率（基因型/基因型）為9/9；—27—2.3最低檢出限最低檢出限參考品稀釋至10ng/μL時檢測9份陽性參考品，結果均符合要求；2.4精密度使用同一批次試劑盒檢測3種精密度企業(yè)參考品，每種參考品檢測10CV≤3種精密度企業(yè)參考品，每份參考品檢測次，批間精密度：CV10%。2.5干擾物質50g/L白蛋白、200g/L血紅蛋白、1040nmol/L雌三醇、64nmol/L孕酮，513umol/L總膽紅素，37mmol/L甘油三酯，13mmol/L膽固醇對結果無明顯影響。2.6交叉反應21-三體綜合征、亨廷頓舞蹈癥致病基因的CAG重復區(qū)域以及47，（超雌綜合征）的樣本對本試劑盒的檢測結果均不造成影響。3.國家參考品檢測使用脆性X核酸檢測國家參考品”，按國家參考品說明書進行全項目檢測，陽性符合率（基因型基因型）為12/12；陰性符合率（基因型/9/910ng/μL時檢測12份陽性參3份陽性參考品各重復檢測次結果均符合要求。—28—4.臨床檢測性能臨床試驗結果與疾病臨床診斷進行對比分析，本試劑盒靈敏度為98.33%，特異性99.84%，總符合率98.79%，和臨床診斷結果的一致性好。采用本試劑盒與參比試劑盒進行臨床試驗驗證，總符合率為100.00%，兩種試劑間檢測結果一致性好?！咀⒁馐马棥?.受檢者所有樣本均應視為潛在的傳染源，檢測完畢的樣本、試劑、耗材均須作為醫(yī)療廢物處理，避免污染環(huán)境。2.可能有感染的風險。3.X綜合征的輔助診斷，檢測結果僅供臨床參考。對患者的臨床診斷應結合其癥狀、體征、其它實驗室檢查及治療反應等情況結合考慮。4.在處理具有潛在感染性的樣品，如肝炎、HIV等時，操作應按實驗室安全管理條例執(zhí)行。5.進行過骨髓移植或者近期接受過外源性輸血的患者，不應使用本試劑盒進行輔助診斷。6.本試劑盒僅限經(jīng)過專業(yè)培訓或具有專業(yè)資質的人員使用。7.使用前應詳細閱讀說明書，充分了解風險，并嚴格執(zhí)行說明書規(guī)定進行操作，否則可能造成錯誤結果?！?9—【參考文獻】[1]中國醫(yī)師協(xié)會醫(yī)學遺傳醫(yī)師分會臨床遺傳學組,中華醫(yī)學會醫(yī)學遺傳學分會臨床遺傳學組,中華預防醫(yī)學會出生缺陷預防與控制專業(yè)委員會遺傳病防控學組,等.脆性X綜合征的臨床實踐指南[J].中華醫(yī)學遺傳學雜志[2]SongFJ,BartonSleightholmeGL,Fry-SmithScreeningforfragileXsyndrome:aliteraturereviewandmodellingHealthAssess.2003;7(16):1-106.[3]GarberKB,J,FragileXsyndrome.EurJHumGenet.2008Jun;16(6):666-72.[4]DevysLutzRouyerBellocqMandelJL.TheFMR-1proteiniscytoplasmic,abundantinneuronsandappearsnormalcarriersofafragileXpremutation.NatGenet.Aug;4(4):335-40.[5]C,BakkerdeKeμLemansJ,R,AJ,GaljaardReuserAJ,HoogeveenOostraBA