(4.6)-自主實驗設計與實踐課題申請書

生物化學實驗自主實驗設計與實踐課題申請書摘要課題研究內容和意義簡介：目前關于酵母種蔗糖酶的提取的研究報告較多，本文將從各種細胞破碎方法的原理、與優(yōu)缺點、緩沖液的選擇、分級沉淀技術以及蛋白透析技術著手進行蔗糖酶提取與純化的實驗。本次專題報告，能夠為我們增加對“蔗糖酶的提取”的進一步了解，在自主實驗中更好的了解背景研究以及提供思路。關鍵詞（用分號分開，最多5個）細胞破碎；緩沖液的選擇；分級沉淀；蛋白質透析基本信息立題依據與研究內容：1、課題的立題依據。由于我們組在秋學期蔗糖酶系列實驗中對于酵母的研磨和蔗糖酶的純化所得到的結果并不是很理想，因此我們在冬學期的自主探究實驗中，決定進一步對“蛋白質的提取純化”這一主題進行研究，并決定將所了解到的關于蛋白質的提取的知識“知行合一”地融入到實踐中去，更好地吸收、理解蛋白質的提取這一方面的學識。2、課題的研究內容、研究目標,以及擬解決的關鍵問題。（1）研究內容：目前關于酵母中蔗糖酶提取純化方面的研究較多1-5，提取方法以超聲破碎法、凍融法、高速珠磨法3種不同的方法最為常見，以下將對這三種蔗糖酶的提取方法進行研究。（2）研究目標：學習三種提取方法并比較其優(yōu)缺點以及蛋白質的提取率，學習蛋白質透析方法與技術，比較其與離子交換層析純化方法的不同與優(yōu)劣。（3）擬解決關鍵問題：三種提取方法的可行性，透析技術的學習。3、擬采取的研究方案及可行性分析（1）提取超聲破碎法常?頻?于15～20KHz的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適?于微?物材料，在?強度聲能輸?下可以進?細胞破碎。其破碎機理與空化現象引起的沖擊波和剪切力有關。但是酵母細胞壁厚,單純超聲破碎酵母細胞的方法總體效率不高凍融法在冷凍過程中，低溫會促使細胞膜的疏水鍵結構破裂，從而增加細胞的親水性能；反復冷凍能夠使細胞內形成冰晶，引起細胞膨脹而破裂。由于整個提取過程保持較低溫度，酶失活率較低，因此使用凍融法提取蔗糖酶能夠更好的促進細胞破碎，保留蔗糖酶活性。物理剪切法物理剪切法中，高速珠磨法是一種有效的破碎方法，珠磨機是該法所用的設備。進入珠磨機內的細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌或研磨，珠子之間以及珠子與細胞之間的相互剪切、碰撞,使細胞破碎,釋放出內含物。（2）純化在蔗糖酶的提取純化中，一般選擇使用乙醇進行分級沉淀1，3，相較于乙醇單次沉淀具有更好的純化效果。（3）透析透析可以除去鹽、有機溶劑以及分子量小于透析袋規(guī)格的雜蛋白，充分保留所需蛋白。但為了獲得較好透析效果的同時保持蛋白質的活，性需要長時間在低溫環(huán)境下進行并且不停更換緩沖液，總體流程所需時間較長。4、課題的特色與創(chuàng)新之處相較于秋學期系列實驗，本組的自主實驗設計優(yōu)化了蔗糖酶提取方法和初步純化方法，采用了一種新的提純方法——透析法，在保留了釀酒酵母全蛋白的基礎上進行蛋白透析以確保蔗糖酶的充分保留，避免因離子交換層析純化蔗糖酶過程中較復雜步驟導致的操作失誤。同時，通過對比全蛋白直接透析與乙醇分級沉淀初步提純后透析，可以比較得出乙醇提純的效果，驗證該提純步驟對于蔗糖酶活性的影響。5、研究計劃及預期研究結果圖1實驗流程與設計圖冬學期自主實驗流程設計圖見圖1。研究計劃：由于實驗室設備與材料限制，預想使用的球磨法因沒有酸洗玻璃珠無法實行，故采用超聲波破碎法。取10g市售酵母菌，加入20mL的20mmol/LTris-HCl緩沖液（pH6.7）溶解，使用超聲波細胞破碎儀，Ⅳ檔下以60%功率，運行15s/間隔10s條件進行細胞破碎30min，處理后得到米黃色渾濁溶液，4℃、12000r/min離心15min，取1mL上清液留作樣品Ⅰ用于酵母蛋白含量測定和蔗糖酶活力測定。將留樣后的上清液均分為兩份，一份經過50℃水浴30min的熱處理后4℃下12000r/min離心15min，取上清液并留樣1mL作樣品Ⅱ；向熱處理后的上清液中加入乙醇使其質量分數達30%，4℃、12000r／min離心15min，取上清液再追加乙醇使其質量分數達50％。4℃、12000r／min離心15min，棄上清液，往沉淀中加入10mL的20mmol/LTris-HCl緩沖液將沉淀溶解，并取1mL留作樣品Ⅲ；將上述蛋白粗提液裝入透析袋（100kD，MD34，Biosharp）中進行透析，透析后取袋內液體，4℃、12000r/min離心10min，取上清液作樣品Ⅳ。另一份直接裝入透析袋中透析，袋內液體經4℃、12000r/min離心10min后取上清液作樣品Ⅴ。兩組透析操作相同，透析液均使用20mmol/LTris-HCl緩沖液，為防止袋內溶液濃度過高，液體流入較多導致透析袋撐破，每1-2日觀察情況并更換透析液，持續(xù)5-7日。第二周起對第一周實驗所得的樣品Ⅰ-Ⅴ進行蛋白含量與蔗糖酶活力測定，采用方法與秋學期所用的相同，使用Folin-酚法測定蛋白濃度與含量、DNS法測定蔗糖酶活性，此處不再贅述。第三周起對樣品進行SDS電泳，操作與秋學期相同。進行SDS電泳的目的是驗證透析操作的效果，結合第二周所得蛋白含量與蔗糖酶活性的數據對透析法的優(yōu)劣進行分析。相關分析請見下文“預期實驗結果”部分。預期研究結果：在進行實驗之前，預期實驗結果為：分析樣品Ⅰ，相較于秋學期用的研磨破碎法，超聲波破碎法對細胞的破碎較為完全，蛋白釋放率更高；分析樣品Ⅳ和Ⅴ，相較于全蛋白直接透析，經過熱處理和乙醇分級沉淀處理后透析所得的蛋白中蔗糖酶純度更高；結果SDS電泳結果表明，樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的總蛋白含量較高，雜蛋白的含量也很高，兩者根據處理步驟依次遞減，即總蛋白含量與雜蛋白比例均為：Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ；樣品Ⅳ與Ⅴ經過透析后，蔗糖酶含量幾乎不變，雜蛋白含量顯著減少，尤其是分子量100kD以下的雜蛋白幾乎完全濾出。透析法對于蔗糖酶的提純有較好的效果且操作簡單，步驟較少。經過第一周的實驗后，對于自主實驗有了新的分析。具體如下：根據相關研究3，玻璃珠破碎法（高速珠磨法）對于酵母全蛋白的釋放與提取最為理想，蛋白濃度可達0.92±0.01g/L，超聲波破碎法的效果較差，蛋白濃度為0.78±0.03g/L。是我們組秋學期采用的研磨破碎法（濕法研磨）所得樣品Ⅰ的蛋白濃度僅有11.87mg/L，相較之下無論是采用珠磨法還是使用超聲波法都可以近百倍的提升蛋白的提取率，保證后續(xù)純化實驗的順利進行。原先設想采用100kD與200kD規(guī)格的兩種透析袋分別透析并對比，但200kD規(guī)格的透析袋較少，未能購得，因此僅使用了100kD規(guī)格的透析袋進行試驗。由于蔗糖酶外酶的分子量約為270kD，內酶的分子量約為135kD，且外酶的活性較高，因此使用100kD透析袋對于保留蔗糖酶內酶的效果較好，但也會導致雜蛋白含量更高，蔗糖酶所占比例下降，活性降低。結合對于釀酒酵母全蛋白組的研究6-10，參考其對于酵母近全蛋白組的電泳結果（見圖2），大部分蛋白質的分子量集中在20-100kD區(qū)間，100kD與200kD以上的蛋白質較少，因此我認為使用100kD規(guī)格的透析袋進行透析與使用200kD規(guī)格透析袋最終所得結果相近，透析后液體所含雜蛋白增多但不會有顯著區(qū)別，不影響實驗進行。圖2酵母全蛋白的電泳結果與分析通過查閱相關文獻與專利所知，釀酒酵母內有多種蛋白水解酶（protease），已知有膠原蛋白酶11（collagenases）、Caspase蛋白酶家族、Caspase同系物Matacaspase（Mca1）12等多種蛋白酶13-17。由于細胞破碎的過程中蛋白水解酶也會被釋放出來，因此需要考慮這些蛋白水解酶在實驗過程，尤其是長時間的透析中對于提取所得蛋白的影響。蛋白水解酶的分子量一般在20kD-30kD左右，相關文獻中酵母內所含的蛋白水解酶的分子量也均未超過100kD，理論上不會在透析袋內停留太久，因此認為其影響時間較短。由于所學知識有限，僅對上述三類蛋白水解酶進行進一步分析。膠原酶能辨識并剪切Pro-X-Gly-Pro多肽序列，而此序列在胞外基質主成分-膠原蛋白中出現的頻率比一般蛋白高很多，使得膠原酶能較專一的作用在胞外基質上。因此可認為膠原酶對于蔗糖酶無降解作用，并且能夠清除酵母全蛋白提取液中膠原蛋白類的雜蛋白。Caspase家族與Mca1通常與細胞凋亡程序性細胞死亡（programmedcelldeath，PCD）的調控緊密相關，且使用酵母作為研究細胞凋亡模式生物的研究也較為成熟18，部分文獻19-22也表明Caspase與Mca1通常對細胞的壽命具有積極影響，通過參與細胞的蛋白質質控（proteinqualitycontrol，PQC）等途徑維持細胞的穩(wěn)態(tài)。在研磨和提純過程中，酵母或許會因為生存環(huán)境的變化而較多表達Caspase系列蛋白酶，但未見其對于蔗糖酶活性的直接影響。結合酵母全蛋白提取與確認的相關研究，我們認為，在透析過程中上述三類蛋白酶不會對蔗糖酶的活性造成負面影響。若實驗能夠順利完成并進行了SDS電泳，后續(xù)才能夠針對100kD以下蛋白的含量、分布及其出現的原因進行更深入的分析。參考文獻[1]李楠,莊蘇星,丁益.酵母蔗糖酶的提取方法[J].食品與生物技術學報,2007,26(4):83-87.[2]梁敏,李楠楠,鄒東恢.蔗糖酶的提取工藝及性質研究[J].湖北農業(yè)科學,2010,49(9):2218-2220.[3]方芳,趙華,咸漠,劉輝.釀酒酵母全蛋白的提取[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2014,40(09):180-184.DOI:10.13995/ki.11-1802/ts.2014.09.057.[4]吳娜.酵母蔗糖酶的分離純化[J].中國化工貿易,2015(14):271-271.[5]許培雅,邱樂泉.離子交換層析純化蔗糖酶實驗方法改進研究[J].實驗室研究與探索,2002,21(3):82-84.[6]PicottiP,Clément-ZizaM,LamH,CampbellDS,SchmidtA,DeutschEW,R?stH,SunZ,RinnerO,ReiterL,ShenQ,MichaelsonJJ,FreiA,AlbertiS,KusebauchU,WollscheidB,MoritzRL,BeyerA,AebersoldR.Acompletemass-spectrometricmapoftheyeastproteomeappliedtoquantitativetraitanalysis.Nature.2013Feb14;494(7436):266-70.doi:10.1038/nature11835.[7]GaoY,PingL,DuongD,ZhangC,DammerEB,LiY,ChenP,ChangL,GaoH,WuJ,XuP.Mass-Spectrometry-BasedNear-CompleteDraftoftheSaccharomycescerevisiaeProteome.JProteomeRes.2021Feb5;20(2):1328-1340.doi:10.1021/acs.jproteome.0c00721.[8]ZhuH,BilginM,SnyderM.Proteomics.AnnuRevBiochem.2003;72:783-812.doi:10.1146/annurev.biochem.72.121801.161511.[9]Krogan,N.,Cagney,G.,Yu,H.etal.GloballandscapeofproteincomplexesintheyeastSaccharomycescerevisiae.Nature440,637–643(2006)./10.1038/nature04670[10]RuiChen,MichaelSnyder,Yeastproteomicsandprote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