降血糖藥物篩選方法

降血糖藥物篩選方法2010年11月5日5/9/20241降血糖藥物篩選方法.導(dǎo)論動(dòng)物水平篩選細(xì)胞水平篩選酶和受體水平篩選總結(jié)和思考5/9/20242降血糖藥物篩選方法.糖尿?。―M,DiabetesMellitus）糖尿病為一種多病因的代謝疾病，特點(diǎn)是慢性高血糖，伴隨因胰島素分泌及/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂。指標(biāo)：餐后2h血糖高于11.1mmol/L空腹血糖高于7.0mmol/L

5/9/20243降血糖藥物篩選方法.發(fā)病率全球糖尿病患者人數(shù)已超過1.77億，預(yù)計(jì)到2025年將達(dá)到3.7億，成為繼心血管和腫瘤之后第三位“健康殺手”（WHO）。中國糖尿病發(fā)病率達(dá)5%，全國糖尿病患者人數(shù)已在3000萬以上，糖尿病患者的人數(shù)僅次于印度居世界第二位。5/9/20244降血糖藥物篩選方法.世界糖尿病日紀(jì)念胰島素的發(fā)現(xiàn)者班廷的誕辰，世界衛(wèi)生組織（WHO）和國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）將班廷醫(yī)生的生日11月14日定為世界糖尿病日（WDD）。班廷，Banting，加拿大生理學(xué)家（1891-1941）控制糖尿病，刻不容緩！（Let's

take

control

of

diabetes.

Now?。?/9/20245降血糖藥物篩選方法.糖尿病的事實(shí)全球每30秒就有一人因糖尿病而截肢。每年死于糖尿病的人遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于死于艾滋病的人。2005年，全球約290萬人死于糖尿病。每年患糖尿病的人數(shù)增加700萬，而且多數(shù)集中在亞洲。每10秒中，就有人死于糖尿病相關(guān)性疾??；同時(shí)，就有2例新病例被診斷．在發(fā)達(dá)國家，糖尿病是成年人失明和視力障礙的主要原因。2型糖尿病占糖尿病患者的90％以上。肥胖是2型糖尿病的主要危險(xiǎn)因素。5/9/20246降血糖藥物篩選方法.并發(fā)癥

糖尿病可導(dǎo)致失明、心腦血管疾病、腎功能衰竭、神經(jīng)病變、肢體壞疽以致截肢、昏迷等多種并發(fā)癥。5/9/20247降血糖藥物篩選方法.治療藥物磺脲類：

格列本脲（優(yōu)降糖）格列齊特（達(dá)美康）格列吡嗪（美吡達(dá)）格列喹酮（糖適平格列美脲（亞莫利）雙胍類：

苯乙雙胍（降糖靈）二甲雙胍（美迪康）

α糖苷酶抑制劑：

阿卡波糖（拜糖平）伏格列波糖（倍欣）

胰島素增敏劑：羅格列酮（文迪雅）

胰島素：

諾和靈、優(yōu)泌林5/9/20248降血糖藥物篩選方法.二、動(dòng)物水平篩選2.1I型糖尿病動(dòng)物模型

造模方法：采用化學(xué)試劑破壞胰島細(xì)胞造模或因?yàn)檫z傳因素，胰島細(xì)胞受到自身免疫性破壞而產(chǎn)生的。

1）化學(xué)試劑誘導(dǎo)的高血糖動(dòng)物模型鏈脲霉素（四氧嘧啶）誘導(dǎo)的高血糖動(dòng)物模型5/9/20249降血糖藥物篩選方法.

鏈脲霉素誘導(dǎo)的高血壓動(dòng)物模型原理：含亞硝基的化合物特異性破壞胰島β細(xì)胞誘導(dǎo)NO大量合成激活自身免疫過程

STZ量決定細(xì)胞損傷程度：

凋亡（低劑量）高劑量（壞死）鏈脲霉素結(jié)構(gòu)

5/9/202410降血糖藥物篩選方法.方法：一次性大劑量靜脈或腹腔注射STZ

大鼠（60-80mg/kg）

小鼠（100-200mg/kg）注意：

STZ水溶液不穩(wěn)定，生物半衰期5min，造模時(shí)新鮮配置、快速注射。結(jié)果：注射72小時(shí)后，血糖穩(wěn)定升高，動(dòng)物出現(xiàn)三多癥狀（多食、多飲、多尿）。

優(yōu)缺點(diǎn)：造模快速、模型穩(wěn)定、組織毒性??；但價(jià)格昂貴5/9/202411降血糖藥物篩選方法.2）自發(fā)性糖尿病大鼠（BB大鼠）

渥太華Biobreeding實(shí)驗(yàn)室培育出來的自發(fā)遺傳I型糖尿病大鼠。發(fā)病機(jī)制：自身免疫性破壞胰腺β細(xì)胞引發(fā)胰腺炎發(fā)病特征：于出生后60日發(fā)病，體重減輕，糖尿，低胰島素，胰腺炎、胰島細(xì)胞減少，須胰島素治療才能生存。5/9/202412降血糖藥物篩選方法.2.2II型糖尿病動(dòng)物模型II型糖尿病動(dòng)物模型的病理生理改變胰島素抵抗增加基礎(chǔ)肝糖輸出率增加，空腹高血糖胰島細(xì)胞功能減退

胰島素抵抗的出現(xiàn)，為維持血糖穩(wěn)定，胰島細(xì)胞分泌胰島素代償性增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞分泌功能障礙，發(fā)展為糖尿病。5/9/202413降血糖藥物篩選方法.1）高糖高脂飲食誘發(fā)II型糖尿病動(dòng)物模型方法：采用占熱量61%高脂飲食（飽和脂肪酸的動(dòng)物脂肪，蛋白質(zhì)19%，碳水化合物20%，脂肪61%），飼養(yǎng)3-6周。指標(biāo)：血糖升高，胰島素水平升高，出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗。優(yōu)缺點(diǎn)：模擬人類高糖高脂膳食誘發(fā)糖尿病模型；但造模時(shí)間較長，成本高，不穩(wěn)定。5/9/202414降血糖藥物篩選方法.2）自發(fā)性糖尿病大鼠（PO大鼠）PO大鼠又稱嗜沙肥鼠發(fā)病特征：

出生兩周后，90%PO大鼠出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗癥狀。發(fā)病階段：

起始階段，血清及胰島素水平正常胰島素水平升高，血糖正常高胰島素水平，高血糖水平胰島細(xì)胞受損，導(dǎo)致低胰島素和高血糖5/9/202415降血糖藥物篩選方法.3）肥胖高血糖小鼠（ob/ob小鼠）發(fā)病特征：體型極胖，早期有高血糖和糖尿，血清胰島素水平高，有明顯的胰島素抗性。胰島肥大增生，胰島素含量增加。用途：胰島素增敏劑的研究4）糖尿病小鼠（db/db小鼠）發(fā)病特征：體型極胖，脂肪沉淀，早期有高血糖和糖尿，高胰島素血癥，晚期可見胰島細(xì)胞壞死。5/9/202416降血糖藥物篩選方法.2.3降糖藥物體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)方法利用糖尿病動(dòng)物模型評(píng)價(jià)藥效，主要以空腹血糖、糖耐量及胰島素敏感性為指標(biāo)。a）空腹血糖測(cè)定取材：動(dòng)物禁食過夜，次日眼眶采血，測(cè)定血糖濃度。方法：葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法以及血糖儀。5/9/202417降血糖藥物篩選方法.葡萄糖氧化酶法（國內(nèi)推薦方法）葡萄糖+O2葡萄糖氧化酶葡萄糖酸+H2O2H2O2+4-氨基安替吡啉+酚過氧化物酶醌亞胺+H2O

醌亞胺在480-550nm有最大吸收峰，醌亞胺與葡萄糖的量成正比，比色法測(cè)定醌亞胺的量，即可得到葡萄糖濃度。原理：方法：葡萄糖氧化酶過氧化物酶磷酸緩沖液酚4-氨基安替吡啉孵育15min505nm測(cè)定吸光度OD5/9/202418降血糖藥物篩選方法.結(jié)果：局限：還原性物質(zhì)如尿酸、維

C

、膽紅素等，可與色原性物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)過氧化氫，從而消耗反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的過氧化氫，使測(cè)定結(jié)果偏低舉例：葡萄糖濃度=A樣品-A空白A標(biāo)準(zhǔn)-A空白X標(biāo)準(zhǔn)濃度（mM）樣品OD葡萄糖濃度（mM）空白0.050標(biāo)準(zhǔn)品0.955.0樣品A0.5?樣品B0.35?5/9/202419降血糖藥物篩選方法.血糖儀方法：

手指采集1ul血樣，將試紙頂端輕靠血樣，試紙就可以自動(dòng)吸收血樣，插入血糖儀，只需5秒快速顯示測(cè)試結(jié)果特點(diǎn)：

方便、快速、簡(jiǎn)單，主要用于糖尿病患者日常監(jiān)控血糖，但準(zhǔn)確度稍差。5/9/202420降血糖藥物篩選方法.b）糖耐量試驗(yàn)口服糖耐量試驗(yàn)：糖尿病診斷主要指標(biāo)，也是降糖藥物藥效評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)。原理：口服葡萄糖后，血糖迅速上升，刺激胰島素分泌，肝糖元合成增加，血糖持續(xù)下降。正常人服用葡萄糖30-60min，血糖達(dá)到最高峰，之后迅速下降，在2h左右，血糖降至正常。糖尿病時(shí)，耐糖功能下降，服糖后血糖峰值超過正常，且2h不能下降到正常。5/9/202421降血糖藥物篩選方法.方法：

實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物過夜禁食，灌胃給葡萄糖或蔗糖（2.5g/kg），或淀粉（3-5g/kg）。測(cè)定給糖后0h，0.5h，1h，2h血漿血糖濃度，并繪制血糖變化曲線。結(jié)果：哪一個(gè)樣本是糖尿病鼠？哪個(gè)是降糖藥治療后樣本？5/9/202422降血糖藥物篩選方法.c)胰島素釋放試驗(yàn)?zāi)康模簷z查胰島功能和胰島素分泌水平原理：I型糖尿病，空腹胰島素水平很低；

II型糖尿病，空腹胰島素水平正常或偏高，葡萄糖刺激后，胰島素分泌增加；部分藥物可促進(jìn)胰島素分泌，提高胰島素水平方法：灌胃給葡萄糖或蔗糖（2.5g/kg），或淀粉（3-5g/kg）.測(cè)定給糖后0h，0.5h，1h，2h

血漿胰島素濃度，并繪制胰島素變化曲線。5/9/202423降血糖藥物篩選方法.胰島素測(cè)定方法（ELISA）：原理：預(yù)先包被胰島素抗體在ELISA板上，加入樣品后，樣品中的胰島素與包被抗體結(jié)合，再加入生物素標(biāo)記的抗胰島素單克隆抗體，結(jié)合已俘獲胰島素的另一端，最后加入過氧化酶標(biāo)記的抗生物素，生物素與抗生物素結(jié)合。通過過氧化物酶底物顯色來定量測(cè)定樣品中的胰島素。5/9/202424降血糖藥物篩選方法.方法：胰島素測(cè)定試劑盒（wako）組成：抗胰島素包被板；胰島素標(biāo)準(zhǔn)溶液；生物素標(biāo)記的抗胰島素抗體；HRP標(biāo)記的鏈酶親和素；顯色底物；終止液；洗滌液

試驗(yàn)操作：參見試劑盒說明結(jié)果：胰島素標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品OD胰島素水平10.85ng/ml20.10.3ng/ml31.58.5ng/ml5/9/202425降血糖藥物篩選方法.圖１哪個(gè)樣品為正常，I型或II型病人？圖２哪個(gè)為治療前或治療后？圖３哪個(gè)為治療前或治療后？圖１圖２圖３5/9/202426降血糖藥物篩選方法.d)葡糖鉗技術(shù)(glucoseclamptechnique)葡糖鉗技術(shù)是美國耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院于1979年創(chuàng)立的一種臨床測(cè)定胰島素分泌或胰島素敏感性的定量技術(shù)。

正糖鉗：對(duì)胰島素的敏感性的定量分析，是國際上公認(rèn)的評(píng)估胰島素敏感性和β細(xì)胞功能的“金標(biāo)準(zhǔn)”。正糖鉗技術(shù)原理：靜脈注射胰島素使其維持高水平；同時(shí)靜脈注射葡萄糖使血糖維持在基礎(chǔ)血糖水平上。高胰島素水平代謝葡萄糖，為維持血糖需不斷注射葡萄糖，當(dāng)葡萄糖注射速率平衡時(shí)，此時(shí)的速率相當(dāng)于體內(nèi)代謝葡萄糖的速率。1983發(fā)展大鼠正糖鉗試驗(yàn)。Dr.JimLiebau5/9/202427降血糖藥物篩選方法.方法：大鼠麻醉頸靜脈插管接三通管，兩個(gè)進(jìn)口端一側(cè)輸入10%葡萄糖，一側(cè)輸入胰島素，出口端接靜脈插管手術(shù)完畢，輸入4mU/kg/min胰島素，同時(shí)輸入10%葡萄糖每隔10min測(cè)定血糖血糖輸入速率至穩(wěn)態(tài)后，記錄連續(xù)60min葡萄糖輸注速率穩(wěn)態(tài)下6次葡萄糖輸注速率平均值為GIR，6次血糖平均值為BG5/9/202428降血糖藥物篩選方法.結(jié)果：穩(wěn)態(tài)葡萄糖注射速率GIR值11.56mg/kg/min血糖平均值BG值4.13mM哪個(gè)樣品胰島素敏感度高？哪個(gè)樣品是來自藥物治療后大鼠？

5/9/202429降血糖藥物篩選方法.三、細(xì)胞水平降糖藥物篩選

脂肪細(xì)胞（肝細(xì)胞）-葡萄糖消耗葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)

5/9/202430降血糖藥物篩選方法.1.3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)脂肪細(xì)胞11mM葡萄糖含藥培養(yǎng)液培養(yǎng)24或48h檢測(cè)培養(yǎng)液中葡萄糖消耗量葡萄糖氧化酶法計(jì)算葡萄糖消耗量陽性藥物可選擇二甲雙胍糖消耗量(mM)=11mM-培養(yǎng)基葡萄糖濃度(mM)5/9/202431降血糖藥物篩選方法.2.3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)脂肪細(xì)胞加藥培養(yǎng)24h0.5uCi/ml2-deoxy-[H]-D-glucose3孵育10min

加NaOH裂解細(xì)胞細(xì)胞裂解液KRP緩沖液清洗3次[H]含量同位素測(cè)定儀KRP緩沖液組成：131.2mMNaCl，4.7mMKCl，2.47mMCaCl2，1.24mMMgSO4,2.48mMNaH2PO4,10mMHEPES35/9/202432降血糖藥物篩選方法.

b-細(xì)胞損傷模型H2O2鏈脲霉素四氧嘧啶

b-細(xì)胞胰島素分泌模型

b-細(xì)胞ATP敏感鉀通道阻斷劑

5/9/202433降血糖藥物篩選方法.四、分子水平降糖藥物篩選4.1a-糖苷酶抑制劑篩選原理：

飲食中淀粉和蔗糖(雙糖)不能直接被腸壁細(xì)胞吸收，需要在小腸絨毛上的多種α-葡糖苷酶的作用下生成單糖(葡萄糖及果糖)后才能被吸收。

α-糖苷酶上具有與寡糖及雙糖相結(jié)合的位點(diǎn)，藥物與這個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，能可逆性地抑制小腸絨毛上的多種α-葡糖苷酶的活性。5/9/202434降血糖藥物篩選方法.α-糖苷酶有多種，包括：蔗糖酶；葡萄糖淀粉酶；麥芽糖酶；糊精酶。阿卡波糖阿卡波糖與α-蔗糖酶結(jié)合位點(diǎn)5/9/202435降血糖藥物篩選方法.方法：p-NPG(底物)磷酸緩沖液0.2U/mla-糖苷酶一定濃度藥物保溫30minNa2CO3終止反應(yīng)405nm測(cè)定釋放p-NP量p-NPG為對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（無色）p-NP為對(duì)硝基苯酚（黃色）5/9/202436降血糖藥物篩選方法.4.2蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶-1B(PT