HJ 1000-2018 水質(zhì) 細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定 平皿計(jì)數(shù)法（正式版）

中華人民共和國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)水質(zhì)細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定平皿計(jì)數(shù)法2018-12-26發(fā)布 1適用范圍 12規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 14方法原理 15干擾和消除 16試劑和材料 17儀器和設(shè)備 28樣品 29分析步驟 310結(jié)果計(jì)算與表示 311精密度和準(zhǔn)確度 412質(zhì)量保證和質(zhì)量控制 513廢物處理 5附錄A(資料性附錄)細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)記錄及報(bào)告推薦格式 6為貫徹《中華人民共和國(guó)環(huán)境保護(hù)法》和《中華人民共和國(guó)水污染防治法》,保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保障人體健康，規(guī)范水中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定方法，制定本標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測(cè)定地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中細(xì)菌總數(shù)的平皿計(jì)數(shù)法。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)為首次發(fā)布。本標(biāo)準(zhǔn)由生態(tài)環(huán)境部生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)司、法規(guī)與標(biāo)準(zhǔn)司組織制訂。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省環(huán)境監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)中心。本標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證單位：大連市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、丹東市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站、錦州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站、遼陽市環(huán)境監(jiān)測(cè)站、沈陽市疾病預(yù)防控制中心和遼寧北方環(huán)境檢測(cè)技術(shù)有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)生態(tài)環(huán)境部2018年12月26日批準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)自2019年6月1日起實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由生態(tài)環(huán)境部解釋。水質(zhì)細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定平皿計(jì)數(shù)法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測(cè)定水中細(xì)菌總數(shù)的平皿計(jì)數(shù)法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件本標(biāo)準(zhǔn)引用了下列文件或其中的條款。凡是未注明日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T14581水質(zhì)湖泊和水庫采樣技術(shù)指導(dǎo)HJ494水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)HJ/T91地表水和污水監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義36℃培養(yǎng)48h,樣品在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上所生長(zhǎng)的需氧菌和兼性厭氧菌菌落總數(shù)。菌落形成單位colony-formingunits(CFU)單位體積樣品中的細(xì)菌群落總數(shù)。4方法原理將樣品接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，在特定的物理?xiàng)l件下(36℃培養(yǎng)48h)培養(yǎng)，生長(zhǎng)的需氧菌和兼性厭氧菌總數(shù)即為樣品中細(xì)菌菌落的總數(shù)。5.1活性氯具有氧化性，能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可在樣品采集(8.1)時(shí)加入硫代硫酸鈉溶液(6.5)消除干擾。5.2重金屬離子具有細(xì)胞毒性，能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可在樣品采集(8.1)時(shí)加入乙二胺四乙酸二鈉溶液(6.6)消除干擾。除非另有說明，分析時(shí)均使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純?cè)噭┗蛏镌噭?，?shí)驗(yàn)用水為蒸餾水或去離2子水。6.1營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。蛋白胨牛肉膏氯化鈉瓊脂將上述成分或含有上述成分的市售成品溶解于1000ml水中，調(diào)節(jié)pH至7.4～7.6,分裝于玻璃容器中，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min,儲(chǔ)存于冷暗處備用。避光、干燥保存，必要時(shí)在5℃±3℃冰箱中保存，不得超過1個(gè)月。配制好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基不能進(jìn)行多次融化操作，以少量勤配為宜。當(dāng)培養(yǎng)基顏色變化或脫水明顯時(shí)應(yīng)廢棄不用。6.2無菌水：取適量實(shí)驗(yàn)用水，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min,備用。6.3硫代硫酸鈉(Na?S?O?·5H?O)。6.4乙二胺四乙酸二鈉(C??H?N?O?Na?·2H?O)。6.5硫代硫酸鈉溶液：p(Na?S?O?)=0.10g/ml稱取15.7g硫代硫酸鈉(6.3),溶于適量水中，定容至100ml,臨用現(xiàn)配。6.6乙二胺四乙酸二鈉溶液：p(C?oH??N?O?Na?·2H?O)=0.15g/ml稱取15g乙二胺四乙酸二鈉(6.4),溶于適量水中，定容至100ml,此溶液可保存為30d。6.7玻璃珠：直徑3～8mm。7儀器和設(shè)備7.1采樣瓶：250ml帶螺旋帽或磨口塞的廣口玻璃瓶。7.2高壓蒸汽滅菌器：115℃、121℃可調(diào)。7.3恒溫培養(yǎng)箱：允許溫度偏差36℃±1℃。7.4恒溫水浴鍋：47℃可調(diào)。7.5pH計(jì)：準(zhǔn)確到0.1pH單位。7.6放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器。7.7一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。8.1樣品采集點(diǎn)位布設(shè)及采樣頻次按照GB/T14581、HJ/T494和HJ/T91的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。采集微生物樣品時(shí)，采樣瓶(7.1)不得用樣品洗滌，采集樣品于滅菌的采樣瓶中。采集河流、湖庫等地表水樣品時(shí)，可握住瓶子下部直接將帶塞采樣瓶插入水中，距水面10～15cm處，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使樣品灌入瓶?jī)?nèi)然后蓋上瓶塞，將采樣瓶從水中取出。如果沒有水流，可握住瓶子水平往前推。采樣量一般為采樣瓶容量的80%左右。樣品采集完畢后，迅速扎上無菌包裝紙。從龍頭裝置采集樣品時(shí)，不要選用漏水龍頭，采水前將龍頭打開至最大，放水3～5min,然后將龍頭關(guān)閉，用火焰灼燒約3min滅菌或用70%～75%的酒精對(duì)龍頭進(jìn)行消毒，開足龍頭，再放水1min,以充分除去水管中的滯留雜質(zhì)。采樣時(shí)控制水流速度，小心接入瓶?jī)?nèi)。3采集地表水、廢水樣品及一定深度的樣品時(shí)，也可使用滅菌過的專用采樣裝置采樣。在同一采樣點(diǎn)進(jìn)行分層采樣時(shí)，應(yīng)自上而下進(jìn)行，以免不同層次的攪擾。如果采集的是含有活性氯的樣品，需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液(6.5),以除去活性氯對(duì)細(xì)菌的抑制作用(每125ml容積加入0.1ml硫代硫酸鈉溶液);如果采集的是重金屬離子含量較高的樣品，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液(6.6),以消除干擾(每125ml容積加入0.3ml乙二胺四乙酸二鈉溶液)。8.2樣品保存采樣后應(yīng)在2h內(nèi)檢測(cè)，否則，應(yīng)10℃以下冷藏但不得超過6h。實(shí)驗(yàn)室接樣后，不能立即開展檢測(cè)的，將樣品于4℃以下冷藏并在2h內(nèi)檢測(cè)。9分析步驟9.1樣品稀釋將樣品用力振搖20～25次，使可能存在的細(xì)菌凝團(tuán)分散。根據(jù)樣品污染程度確定稀釋倍數(shù)。以無菌操作方式吸取10ml充分混勻的樣品，注入盛有90ml無菌水(6.2)的三角燒瓶中(可放適量的玻璃珠),混勻成1:10稀釋樣品。吸取1:10的稀釋樣品10ml注入盛有90ml無菌水的三角燒瓶中，混勻成1:100稀釋樣品。按同法依次稀釋成1:1000、1:10000稀釋樣品。每個(gè)樣品至少應(yīng)稀釋3個(gè)適宜濃度。9.2接種以無菌操作方式用1ml滅菌的移液管吸取充分混勻的樣品或稀釋樣品1ml,注入滅菌平皿中，傾注15～20ml冷卻到44～47℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(6.1),并立即旋搖平皿，使樣品或稀釋樣品與培養(yǎng)基充分混勻。每個(gè)樣品或稀釋樣品傾注2個(gè)平皿。9.3培養(yǎng)待平皿內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基冷卻凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，使底面向上(避免因表面水分凝結(jié)而影響細(xì)菌均勻生長(zhǎng)),在36℃±1℃條件下，恒溫培養(yǎng)箱(7.3)內(nèi)培養(yǎng)48h±2h后觀察結(jié)果。9.4空白試驗(yàn)用無菌水做實(shí)驗(yàn)室空白測(cè)定，培養(yǎng)后平皿上不得有菌落生長(zhǎng)，否則，該次樣品測(cè)定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測(cè)定。10結(jié)果計(jì)算與表示10.1結(jié)果判讀平皿上有較大片狀菌落且超過平皿的一半時(shí)，該平皿不參加計(jì)數(shù)。片狀菌落不到平皿的一半，而其余一半菌落分布又很均勻時(shí)，將此分布均勻的菌落計(jì)數(shù)，并乘以2代表全皿菌落總數(shù)。4外觀(形態(tài)或顏色)相似、距離相近卻不相接觸的菌落，只要它們之間的距離不小于最小菌落的直徑，予以計(jì)數(shù)。緊密接觸而外觀相異的菌落，予以計(jì)數(shù)。10.2結(jié)果計(jì)算以每個(gè)平皿菌落的總數(shù)或平均數(shù)(同一稀釋倍數(shù)兩個(gè)重復(fù)平皿的平均數(shù))乘以稀釋倍數(shù)來計(jì)算1ml樣品中的細(xì)菌總數(shù)。各種不同情況的計(jì)算方法如下：優(yōu)先選擇平均菌落數(shù)在30～300之間的平皿進(jìn)行計(jì)數(shù)，當(dāng)只有一個(gè)稀釋倍數(shù)的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，以該平均菌落數(shù)乘以其稀釋倍數(shù)為細(xì)菌總數(shù)測(cè)定值(見表1例1)。若有兩個(gè)稀釋倍數(shù)平均菌落數(shù)在30～300之間，計(jì)算二者的比值(二者分別乘以其稀釋倍數(shù)后，較大值與較小值之比)。若其比值小于2,以兩者的平均數(shù)為細(xì)菌總數(shù)測(cè)定值；若大于或等于2,則以稀釋倍數(shù)較小的菌落總數(shù)為細(xì)菌總數(shù)測(cè)定值(見表1例2、例3、例4)。若所有稀釋倍數(shù)的平均菌落數(shù)均大于300,則以稀釋倍數(shù)最大的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)為細(xì)菌總數(shù)測(cè)定值(見表1例5)。若所有稀釋倍數(shù)的平均菌落數(shù)均小于30,則以稀釋倍數(shù)最小的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)為細(xì)菌總數(shù)測(cè)定值(見表1例6)。若所有稀釋倍數(shù)的平均菌落數(shù)均不在30～300之間，則以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)為細(xì)菌總數(shù)測(cè)定值(見表1例7)。表1稀釋倍數(shù)選擇及菌落總數(shù)測(cè)定值示例菌落數(shù)之比23482565710.3結(jié)果表示測(cè)定結(jié)果保留至整數(shù)位，最多保留兩位有效數(shù)字，當(dāng)測(cè)定結(jié)果≥100CFU/ml時(shí)，以科學(xué)計(jì)數(shù)法表示；若未稀釋的原液的平皿上無菌落生長(zhǎng)，則以“未檢出”或“<1CFU/ml”表示。細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)記錄及報(bào)告推薦格式參見附錄A。11精密度和準(zhǔn)確度6個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別對(duì)低濃度(地下水，濃度均值為39CFU/ml)、中濃度(地表水，濃度均值為2.5×103CFU/ml)和高濃度(生活污水，濃度均值為1.3×10?CFU/ml)三個(gè)不同濃度細(xì)菌總數(shù)的樣品及有證標(biāo)準(zhǔn)樣品(濃度為95MPN/ml,可接受范圍為22～168MPN/ml)進(jìn)行了6次重復(fù)測(cè)定：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為2.4%～6.2%、0.6%～1.8%、0.3%～1.3%和1.7%～5.6%;實(shí)驗(yàn)室間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為18%、4.7%、2.4%和3.7%;實(shí)驗(yàn)室間95%置信區(qū)間見表2。5表2實(shí)驗(yàn)室間95%置信區(qū)間低濃度/(CFU/ml)中濃度/(CFU/ml)高濃度/(CFU/ml)有證標(biāo)準(zhǔn)樣品/(CFU/ml)95%置信區(qū)間95%置信區(qū)間95%置信區(qū)間95%置信區(qū)間1.7×103~3.6×1039.8×10?~1.8×10?11.2準(zhǔn)確度6個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)含細(xì)菌總數(shù)濃度為95MPN/ml的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行了6次重復(fù)測(cè)定：相對(duì)誤差范圍為-13%～-4.6%;相對(duì)誤差最終值為-8.7%±6.5%。12質(zhì)量保證和質(zhì)量控制12.1培養(yǎng)基檢驗(yàn)更換不同批次培養(yǎng)基時(shí)要進(jìn)行陽性菌株檢驗(yàn)，以確保其符合要求。常用的陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株有大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)等。將上述標(biāo)準(zhǔn)菌株配成濃度為30～300CFU/ml的菌懸液，充分混勻后取1ml菌懸液按接種(9.2)和培養(yǎng)(9.3)進(jìn)行操作，平皿內(nèi)均勻地產(chǎn)生30～300個(gè)菌落，表明該批次培養(yǎng)基合格。12.2空白試驗(yàn)每次試驗(yàn)都要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室空白測(cè)定(9.4),檢查稀釋水、玻璃器皿和其他器具的無菌性。