腫瘤個體化分子病理檢測及其臨床應(yīng)用

腫瘤個體化分子病理檢測及其臨床應(yīng)用腫瘤個體化分子病理檢測及臨床應(yīng)用一、開展腫瘤個體化分子病理檢測的意義二、分子病理檢測的標(biāo)本選擇三、分子病理檢測的方法四、分子病理檢測的項(xiàng)目第2頁,共30頁，2024年2月25日，星期天一.開展腫瘤個體化分子檢測的意義--個體化分子診斷是個體化治療的基石。--靶向治療是為攻擊特異性靶分子而設(shè)計(jì)，所以用藥前，必需檢測患者是否存在對應(yīng)的靶點(diǎn)，才能發(fā)揮其療效。第3頁,共30頁，2024年2月25日，星期天衛(wèi)生部原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2011)-------IV期肺癌在開始治療前，建議先獲取腫瘤組織進(jìn)行表皮生長因子受體(EGFR)是否突變的檢測，根據(jù)EGFR突變狀況制定相應(yīng)的治療策略。第4頁,共30頁，2024年2月25日，星期天中國腫瘤界正在致力于推動腫瘤個體化分子病理診斷的規(guī)范化，同時也希望臨床能夠與病理科緊密配合，共同實(shí)現(xiàn)規(guī)范化診斷、規(guī)范化治療的目標(biāo)，以造?；颊?。第5頁,共30頁，2024年2月25日，星期天外科手術(shù)標(biāo)本(石蠟切片）

10umX2

切片活檢標(biāo)本（石蠟切片）

10umX4

切片穿刺標(biāo)本（新鮮組織）至少芝麻粒大小胸腹水標(biāo)本不少于10mL。二.分子病理檢測的標(biāo)本選擇第6頁,共30頁，2024年2月25日，星期天--盡量避開腫瘤間質(zhì)、出血灶、壞死物質(zhì)等--腫瘤細(xì)胞所占的比例也是必須要考慮的因素。--目前尚不清楚滿足分子學(xué)檢測需要的最低限度腫瘤細(xì)胞的數(shù)量。第7頁,共30頁，2024年2月25日，星期天--獲得質(zhì)、量俱佳的腫瘤標(biāo)本是EGFR檢測的重要前提條件，涉及到從臨床標(biāo)本采集到完成最終檢測實(shí)驗(yàn)等多個環(huán)節(jié)。--離體后及時（30分鐘內(nèi)）固定于10%中性緩沖福爾馬林液中。--固定時間：小標(biāo)本6-12h，大標(biāo)本6-48h。第8頁,共30頁，2024年2月25日，星期天腫瘤組織標(biāo)本病理學(xué)評估組織切片非小細(xì)胞性肺癌診斷及病理類型足夠的腫瘤細(xì)胞比例：測序法，至少50%腫瘤細(xì)胞；ARMS法，至少2%的腫瘤細(xì)胞(不考慮遺傳異質(zhì)性)足夠多的腫瘤細(xì)胞總數(shù)：>200個腫瘤細(xì)胞標(biāo)識腫瘤豐富的區(qū)域富集腫瘤細(xì)胞取一張切片H&E染色用于病理評估其余白片用于提取DNA建議切片數(shù)量：

—手術(shù)標(biāo)本，5μm×5

—小活檢標(biāo)本，5μm×10固定包埋組織手術(shù)標(biāo)本：可得足量腫瘤DNA，但DNA片段化小活檢標(biāo)本：可得腫瘤DNA量少且片段化新鮮/冰凍組織手術(shù)標(biāo)本：最好標(biāo)本，可得高質(zhì)量腫瘤DNA小活檢標(biāo)本：量少，但腫瘤DNA質(zhì)量仍好腫瘤組織樣本的采集及病理評估PirkerR,etal.JThoracOncol2010;5(10):1706-1713.第9頁,共30頁，2024年2月25日，星期天1.Dataonfile.2.KimuraH,etal.BritishJournalofCancer2006;95(10):1390-1395.3.ZhangX,etal.LungCancer2008;60(2):175-182.4.SohJ,etal.IntJCancer2006;119(10):2353-2358.胸水標(biāo)本處理流程收集胸水50-500ml室溫1000轉(zhuǎn)離心10分鐘，吸去上清沉淀物-80℃保存沉淀物均勻涂玻片室溫晾干涂片涂片區(qū)域滴加75%酒精室溫晾干涂片常溫運(yùn)輸涂片沉淀物用棉絮紙包裹0.1%水性伊紅漂染1秒10%中性福爾馬林固定24-48小時后續(xù)處理與組織標(biāo)本相同低溫保存酒精固定涂片福爾馬林固定切片第10頁,共30頁，2024年2月25日，星期天三.分子病理檢測的方法基因試劑盒價格適中、靈敏度，特異性高、所需時間短。PCR通用設(shè)備平臺基因芯片特定設(shè)備，價格高測序法檢測

PCR通用設(shè)備平臺，靈敏度，特異性低、所需時間長。價格便宜第11頁,共30頁，2024年2月25日，星期天

（一）技術(shù)簡介腫瘤個體化治療是指實(shí)施治療前根據(jù)患者的個體差異（基因差異），“量體裁衣”（基因檢測）地制定某個患者的治療方案，即檢查某種靶向藥物對患者是否有效或是在多種化療藥物中篩選最有效的藥物?；焸€體化可顯著提高治療效果，有效緩解疾病，避免藥物的毒副作用，提高患者的生活質(zhì)量，避免因反復(fù)嘗試不同藥物帶來的身體損害、錯過最佳治療時間以及浪費(fèi)金錢。使用靶向藥物前必須基因檢測，從而判斷該藥是否適用該患者。

第12頁,共30頁，2024年2月25日，星期天熒光定量PCR與基因測序法檢測基因突變的比較

第13頁,共30頁，2024年2月25日，星期天熒光定量PCR與基因測序法檢測基因突變的比較

熒光定量PCR檢測

DNA測序法技術(shù)原理特異雙環(huán)引物探針Sanger雙脫氧鏈終止法靈敏度、特異性可準(zhǔn)確檢測出含量<1%的突變DNA，特異性高突變DNA含量低于20%易產(chǎn)生誤差成功率成功率高達(dá)100%對石蠟樣本檢測成功率為70-75%擴(kuò)增片段長度～100bp≧200bp所需時間模板完成后僅需要90分鐘至少1個工作日結(jié)果判讀簡單，只需觀察擴(kuò)增曲線即可需要通過DNA序列分析軟件第14頁,共30頁，2024年2月25日，星期天基因檢測過程示意圖第15頁,共30頁，2024年2月25日，星期天標(biāo)本采集與運(yùn)輸要求檢驗(yàn)標(biāo)本標(biāo)本采集與保存標(biāo)本運(yùn)輸全血5ml,EDTA抗凝管（紫蓋），充分混勻，保存低溫運(yùn)輸，24小時送達(dá)

血漿新鮮全血5ml,EDTA抗凝管（紫蓋），室溫直立靜置30分鐘，8000rpm離心5分鐘，取上清于無菌EP管中，凍存低溫運(yùn)輸，24小時送達(dá)石蠟包埋組織蠟塊或5-10張白片，厚度在5-10um;加同一蠟塊HE染色片1張常溫運(yùn)輸（20）新鮮組織組織切除后用生理鹽水沖洗，無菌管中凍存低溫運(yùn)輸，24小時送達(dá)新鮮組織組織切除后用生理鹽水沖洗，放入福爾馬林固定保存常溫運(yùn)輸（20）體液腦脊液3-5ml,無菌管保存；胸腹水10ml,注入含106mmol/L酸鈉抗凝劑的無菌管（淺藍(lán)色蓋），抗凝劑與標(biāo)本比例1:9低溫運(yùn)輸，24小時送達(dá)骨髓3-5ml骨髓，EDTA抗凝管（紫蓋）低溫運(yùn)輸，48小時送達(dá)第16頁,共30頁，2024年2月25日，星期天基因突變檢測方法

----國際肺癌協(xié)會共識第17頁,共30頁，2024年2月25日，星期天測序法與ARMS法比較測序法ARMS敏感度20-30%1%FFPE標(biāo)本成功率低高檢測流程復(fù)雜慢長簡單快速數(shù)據(jù)分析要求高低假陽性機(jī)會(交叉污染)多少假陰性機(jī)會多少儀器成本高低商用試劑盒無有試劑成本低略高第18頁,共30頁，2024年2月25日，星期天測序法和ARMS法在不同標(biāo)本類型中突變率的比較

ARMS法更適合用于小標(biāo)本檢測第19頁,共30頁，2024年2月25日，星期天四.分子病理檢測的項(xiàng)目分子靶向治療基因檢測：●藥物敏感基因檢測：□ERCC1基因表達(dá)EGFR（29種、4種）□P53基因突變（6種突變）KRAS（7種突變）□BRCA1基因表達(dá)BRAF基因突變（V600E突變）□RRM1基因表達(dá)Jak2基因突變（V617F突變）□TYMS基因表達(dá)PIK3CA基因突變（5種熱點(diǎn)突變）□DPD基因表達(dá)C-KIT基因突變（D816V突變）□STMN1基因表達(dá)RET基因突變（M918T突變）□TYMP基因表達(dá)PDGFRA基因突變（D842V突變）□BRCA1基因表達(dá)BCR-ABL基因突變（T315I突變）□TOP2A基因表達(dá)EML4-ALK融合基因（RT-PCR法)□TUBB3基因表達(dá)

第20頁,共30頁，2024年2月25日，星期天（一）分子靶向藥物作用靶點(diǎn)基因檢測臨床應(yīng)用

癌癥種類靶向藥物（主要基于NCCN2010版）檢測基因檢測結(jié)果檢測靶點(diǎn)非小細(xì)胞肺癌易瑞沙、特羅凱EGFRKRASBRAF突變型野生型野生型DNA突變結(jié)直腸癌西妥昔單抗、帕尼單抗KRASBRAFEGFR野生型野生型突變型DNA突變胰腺癌厄羅替尼EGFRKRAS突變性野生型DNA突變頭頸部癌西妥西單抗KRASBRAF野生型野生型DNA突變黑色素瘤PLX4032,PLX4720BRAF突變型DNA突變胃腸道間質(zhì)瘤伊馬替尼（格列衛(wèi)）C-kit突變型DNA突變二、分子靶向藥物作用靶點(diǎn)檢測和耐藥基因檢測臨床應(yīng)用第21頁,共30頁，2024年2月25日，星期天（二）化療藥物對應(yīng)的基因檢測項(xiàng)目臨床應(yīng)用

癌癥種類化療藥物（主要基NCCN2010版）檢測基因檢測結(jié)果檢測靶點(diǎn)結(jié)直腸癌氟類藥（如5-氟尿嘧啶、卡培他濱等）TYMSDPD低表達(dá)低表達(dá)mRNA表達(dá)水平鉑類藥物（如奧沙利鉑）ERCC1BRCA1RAP80低表達(dá)低表達(dá)低表達(dá)伊利替康EGFR高表達(dá)肝癌鉑類藥物（如順鉑、奧沙利鉑）ERCC1BRCA1低表達(dá)低表達(dá)mRNA表達(dá)水平吉西他濱RRM1低表達(dá)氟類藥（如5-氟尿嘧啶、卡培他濱等）TYMSDPD低表達(dá)低表達(dá)蒽環(huán)類（如多柔比星）TOP2A高表達(dá)mRNA表達(dá)水平膽管\膽囊癌鉑類藥物（如順鉑、奧沙利鉑）ERCC1BRCA1低表達(dá)低表達(dá)mRNA表達(dá)水平氟類藥（如5-氟尿嘧啶）TYMSDPD低表達(dá)低表達(dá)吉西他濱RRM1低表達(dá)第22頁,共30頁，2024年2月25日，星期天

癌癥種類化療藥物（主要基NCCN2010版）檢測基因檢測結(jié)果檢測靶點(diǎn)胰腺癌鉑類藥物（如順鉑、奧沙利鉑）ERCC1BRCA1低表達(dá)低表達(dá)mRNA表達(dá)水平氟類藥（如5-氟尿嘧啶、卡培他濱等）TYMS低表達(dá)吉西他濱RRM1低表達(dá)腎癌吉西他濱RRM1低表達(dá)mRNA表達(dá)水平氟類藥（如5-氟尿嘧啶、卡培他濱等）TYMS低表達(dá)蒽環(huán)類（如多柔比星）TOP2A高表達(dá)mRNA表達(dá)水平前列腺癌鉑類藥物（如順鉑、卡鉑）ERCC1BRCA1低表達(dá)低表達(dá)mRNA表達(dá)水平抗微管類如多西紫杉醇）TUBB3BRCA1低表達(dá)高表達(dá)依托泊苷TOP2A高表達(dá)第23頁,共30頁，2024年2月25日，星期天

癌癥種類化療藥物（主要基NCCN2010版）檢測基因檢測結(jié)果檢測靶點(diǎn)膀胱癌鉑類藥物（如順鉑、卡鉑）ERCC1BRCA1低表達(dá)低表達(dá)mRNA表達(dá)水平吉西他濱RRM1低表達(dá)抗微管類（如紫杉醇、多西紫杉醇、長春花堿等）TUBB3BRCA1低表達(dá)高表達(dá)氟類藥（如5-氟尿嘧啶等）、培美曲塞TYMS低表達(dá)蒽環(huán)類（如多柔比星）TOP2A高表達(dá)mRNA表達(dá)水平乳腺癌鉑類藥物（如順鉑、卡鉑）ERCC1BRCA1低表達(dá)低表達(dá)mRNA表達(dá)水平抗微管類（如紫杉醇、多西紫杉醇、長春花堿、長春瑞濱等）TUBB3BRCA1低表達(dá)高表達(dá)氟類藥（如5-氟尿嘧啶等）TYMSDPD低表達(dá)低表達(dá)吉西他濱RRM1低表達(dá)依托泊苷TOP2A高表達(dá)蒽環(huán)類（如多柔比星、表柔比星）TOP2A高表達(dá)mRNA表達(dá)水平第24頁,共30頁，2024年2月25日，星期天

癌癥種類化療藥物（主要基NCCN2010版）檢測基因檢測結(jié)果檢測靶點(diǎn)宮頸癌鉑類藥物（如順鉑、卡鉑）ERCC1BRCA1低表達(dá)低表達(dá)mRNA表達(dá)水平抗微管類（如紫杉醇、多西紫杉醇、長春花堿、長春瑞濱等）TUBB3BRCA1低表達(dá)高表達(dá)吉西他濱RRM1低表達(dá)氟類藥（如5-氟尿嘧啶等）TYMSDPD低表達(dá)低表達(dá)蒽環(huán)類（如多柔比星、表柔比星）TOP2A高表達(dá)mRNA表達(dá)水平卵巢癌鉑類藥物（如順鉑、卡鉑）ERCC1BRCA1低表達(dá)低表達(dá)mRNA表達(dá)水平抗微管類（如紫杉醇、多西紫杉醇、長春花堿、長春瑞濱等）TUBB3BRCA1低表達(dá)高表達(dá)吉西他濱RRM1低表達(dá)卡培他濱、培美曲塞TYMS低表達(dá)依托泊苷TOP2A高表達(dá)蒽環(huán)類（如多柔比星）TOP2A高表達(dá)mRNA表達(dá)水平第25頁,共30頁，2024年2月25日，星期天

癌癥種類化療藥物（主要基NCCN2010版）檢測基因檢測結(jié)果檢測靶點(diǎn)頭頸部癌鉑類藥物（如順鉑、卡鉑）ERCC1BRCA1低表達(dá)低表達(dá)mRNA表達(dá)水平抗微管類（如紫杉醇、多西紫杉醇等）TUBB3BRCA1低表達(dá)高表達(dá)氟類藥（如5-氟尿嘧啶等）TYMSDPD低表達(dá)低表達(dá)吉西他濱RRM1低表達(dá)黑色素瘤鉑類藥物（如順鉑、卡鉑）ERCC1BRCA1低表達(dá)低表達(dá)mRNA表達(dá)水平抗微管類（如紫杉醇、長春花堿、長春瑞濱）TUBB3BRCA1低表達(dá)低表達(dá)吉西他濱RRM1低表達(dá)第26頁,共30頁，2024年2月25日，星期天擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)(Amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)又稱等位基因特異性擴(kuò)增（Allele-specificamplification，ASA）。利用PCR引物的3’端末位堿基必須與其模板DNA互補(bǔ)才能有效擴(kuò)增的原理，設(shè)計(jì)等位基因特異性PCR擴(kuò)增引物，在嚴(yán)格的條件下，只有在引物3’堿基與模板配對時才能出現(xiàn)PCR擴(kuò)增帶，從而檢測出突變。該法省去了探針雜交操作，通過設(shè)計(jì)兩個5’端引物，一個與正常DNA互補(bǔ)，一個與突變DNA互補(bǔ)，對于純和性突變，分別加入兩種引物及3’端引物進(jìn)行兩個平行的PCR，結(jié)合有與突變DNA完全互補(bǔ)的引物才可以延伸并得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。第27頁,共30頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮，染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂，形成50~300kbp長的DNA大片段，或180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段，在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜（DNAladder）。細(xì)胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA,進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的DNAladder.如果細(xì)胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）使D