質譜技術與質譜儀

質譜技術與質譜儀蛋白質組學技術平臺第2頁,共133頁，2024年2月25日，星期天一、概述1、質譜儀的發(fā)展史

1912年: 世界第一臺質譜裝置

40年代: 質譜儀用于同位素測定

50年代： 分析石油

60年代： 研究GC-MS聯(lián)用技術

70年代： 計算機引入

80年代： 研究LC-MS聯(lián)用技術

90年代： 研究蛋白質分析技術第3頁,共133頁，2024年2月25日，星期天2、質譜的概念質譜分析法（MassSpectroscope,MS）是將化合物形成離子或碎片離子，按質荷比(m/e)的不同進行測定，從而進行成分分析和結構分析的一種方法。質譜（massspectrum，MS）是將帶電原子、分子或分子碎片按其質量或質荷比（m/e）大小順序排列而成的圖譜。第4頁,共133頁，2024年2月25日，星期天質譜儀（massspectrometer）是將待測物樣品在一定條件下轉化成氣態(tài)離子并通過質量分析器，按其質量或m/e大小順序進行分離、記錄的分析儀器。第5頁,共133頁，2024年2月25日，星期天3、質譜的特點信息量大，應用范圍廣，是研究分子結構的有力工具。由于分子離子峰可以提供樣品分子的相對分子量的信息，所以質譜法也是測定分子量的常用方法。分析速度快、靈敏度高、高分辨率的質譜儀可以提供分子或離子的精密測定。質譜儀器較為精密，價格昂貴，工作環(huán)境要求較高。第6頁,共133頁，2024年2月25日，星期天二、質譜技術的基本原理1、進樣化合物通過汽化引入離子化室；2、離子化在離子化室，組分分子被一束加速電子碰撞（能量約70eV），撞擊使分子電離形成正離子；M——M++e或與電子結合，形成負離子M+e——M—第7頁,共133頁，2024年2月25日，星期天3、離子也可因撞擊強烈而形成碎片離子：4、荷電離子被加速電壓加速，產生一定的速度v，與質量m、電荷e及加速電壓V有關，其動能與加速電壓及電荷遵循第8頁,共133頁，2024年2月25日，星期天5、加速離子進入一個強度為H的磁場，發(fā)生偏轉，半徑為：將（1）（2）合并：因此，當r為儀器設置不變時，改變加速電壓或磁場強度，則不同m/e的離子依次通過狹縫到達檢測器，形成質量譜，簡稱質譜。第9頁,共133頁，2024年2月25日，星期天二、質譜儀的基本結構質譜儀的分類第10頁,共133頁，2024年2月25日，星期天質譜的結構第11頁,共133頁，2024年2月25日，星期天（一）真空系統(tǒng)為了保證離子源中燈絲的正常工作，保證離子在離子源和分析器正常運行，消減不必要的離子碰撞，散射效應，復合反應和離子-分子反應，減小本底與記憶效應,因此，質譜儀的離子源和分析器都必須處在高真空中才能工作，一般應在10-5～10-6Pa。一般真空系統(tǒng)由機械真空泵和擴散泵或渦輪分子泵組成。第12頁,共133頁，2024年2月25日，星期天（二）進樣系統(tǒng)要求：高效重復的將樣品引入到離子源中并且不能造成真空度的降低，而樣品導入離子源的方式決定于樣品的物理性質。方式：

1.間歇式進樣系統(tǒng)

2.直接進樣系統(tǒng)

3.色譜進樣系統(tǒng)（從HPLC、GC及CE）第13頁,共133頁，2024年2月25日，星期天1.間歇式進樣系統(tǒng)可用于氣體、液體和中等蒸汽壓的固體樣品進樣，通過可拆卸式的試樣管將少量固體或液體試樣引入試樣儲存器中。由于進樣系統(tǒng)的低壓強及儲存器的加熱裝置，使試樣保持氣態(tài)。加之進樣系統(tǒng)的壓強比離子源的壓強大，樣品分子或離子可以通過分子漏隙以分子流的形式滲透進高真空的離子源。第14頁,共133頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共133頁，2024年2月25日，星期天2.直接進樣系統(tǒng)對那些在間歇式進樣系統(tǒng)的條件下無法變成氣體的固體、熱敏性固體及非揮發(fā)性液體試樣，可直接引入到離子源中。通常將試樣放入小杯中，通過真空閉鎖裝置將其引入離子源，可以對樣品杯進行冷卻或加熱處理。第16頁,共133頁，2024年2月25日，星期天3.色譜進樣系統(tǒng)氣相色譜-質譜聯(lián)用儀

從毛細管氣相色譜柱流出的成分可直接引入質譜儀的離子化室。第17頁,共133頁，2024年2月25日，星期天液相色譜-質譜聯(lián)用儀

采用離子噴霧及電噴霧技術除去流動相使樣品離子進入質譜分析儀。第18頁,共133頁，2024年2月25日，星期天對于蒸汽壓低的樣品進行衍生化后進樣例如：葡萄糖變成三甲基硅醚的衍生物OCH2OHOHOHHOHOOCH2OSiMe3OSiMe3OSiMe3Me3SiOMe3SiOMe3SiCl第19頁,共133頁，2024年2月25日，星期天（三）離子源質譜儀中產生離子的裝置稱為離子源，其功能是將進樣系統(tǒng)引入的氣態(tài)樣品分子轉化成離子。不同的分子離子化所需要的能量不同，因此，應選擇不同的離解方式：

硬電離：能給予樣品較大能量的電離方法。軟電離：給予較小能量的電離方法，適用于易破裂或易電離的樣品。第20頁,共133頁，2024年2月25日，星期天質譜研究中的幾種離子源名稱簡稱類型離子化試劑應用年代電子轟擊離子化

（ElextronBombIonization）EI氣相高能電子1920化學電離

（ChemicalIonization）CI氣相試劑離子1965場電離

（FieldIonization）FI氣相高電勢電極1970場解吸

（FieldDesorption）FD解吸高電勢電極1969快原子轟擊

（FastAtomBombandment）FAB解吸高能電子1981二次離子質譜

（SecondaryIonMS）SIMS解吸高能離子1977激光解析

（LaserDesorption）LD解吸激光束1978電流體效應離子化(離子噴霧)

（ElectrohydrodynamicIonization）EH解吸附高場1978

熱噴霧離子化

（ThermosprayIonization）ES

荷電微粒能量1985第21頁,共133頁，2024年2月25日，星期天1.電子轟擊離子化（EI）電子轟擊源是質譜通用型的電離源，硬電離方法，由此產生的圖譜稱為EI-MS。燈絲與接收極之間的電壓為70伏，發(fā)射出能量為70eV的高能電子束，撞擊來自進樣系統(tǒng)的以氣體形式進入離子源的樣品分子，使樣品分子電離，產生正離子，獲得加速，經過狹縫進一步準直后進入質量分析器?？稍谄叫须娮邮姆较蚋郊右蝗醮艌?，使電子沿螺旋軌道前進，增加碰撞機會，提高靈敏度。第22頁,共133頁，2024年2月25日，星期天當電離源有足夠的能量使帶有較大內能時，可能進一步發(fā)生鍵的斷裂，形成大量的各種低質量數(shù)的碎片正離子和自由基或中性分子。由分子離子可以確定化合物分子量,由碎片離子可以得到化合物的結構。第23頁,共133頁，2024年2月25日，星期天在電子轟擊下，樣品分子可能有四種不同途徑形成離子：（1）樣品分子被打掉一個電子形成分子離子；（2）分子離子進一步發(fā)生化學鍵斷裂形成碎片離子；（3）分子離子發(fā)生結構重排形成重排離子；（4）通過分子離子反應生成加合離子；（5）同位素離子第24頁,共133頁，2024年2月25日，星期天特點：

碎片離子多，結構信息豐富，有標準化合物質譜庫；不能汽化的樣品不能分析，主要用于揮發(fā)性和分子量較小樣品的電離；有些樣品得不到分子離子。第25頁,共133頁，2024年2月25日，星期天2.化學電離（CI）結構與EI同，但是在離子化室充CH4，電子首先將CH4離解，其電離過程如下：CH4+eCH4+

+2eCH4+

+CH4CH5++CH3生成的氣體離子再與樣品分子M反應：CH5++

MCH4+MH+通過離子-分子反應的軟離子化技術。第26頁,共133頁，2024年2月25日，星期天特點：得到一系列準分子離子（M+1）+，（M-1）+，（M+2）+等等；CI源的的碎片離子峰少，圖譜簡單，易于解釋；不適于難揮發(fā)成分的分析。第27頁,共133頁，2024年2月25日，星期天3.場電離（FI）FI是利用強電場誘發(fā)樣品分子的電離，屬于軟電離。最重要的部件是電極，正負極間施加高達10KV的電壓差，兩極的電壓梯度可達107～108V·cm-1。若具有較大偶極矩或高極化率的樣品分子通過兩極間時，受到極大的電壓梯度的作用（量子隧道效應）而發(fā)生電離。第28頁,共133頁，2024年2月25日，星期天特點：分子離子峰（或準分子離子峰）強度較大，而碎片離子峰很少；圖譜較簡單。++氣體分子試樣分子+準分子離子電子(M+1)+、(M+17)+、(M+29)+第29頁,共133頁，2024年2月25日，星期天4.場解吸電離法（FD）與FI類似的有場解吸源，它把樣品溶液置于陽極發(fā)射器的表面，并將溶劑蒸發(fā)除去，在強電場中，樣品離子直接從固體表面解吸并奔向陰極。FD是一種軟電離技術。第30頁,共133頁，2024年2月25日，星期天特點：一般只產生分子離子峰和準分子離子峰，碎片離子峰極少，圖譜很簡單；特別適用于熱不穩(wěn)定性和非揮發(fā)性化合物的質譜分析。第31頁,共133頁，2024年2月25日，星期天5.快原子轟擊電離法（FAB）為了獲得高動能，首先讓稀有氣體原子電離，并通過電場加速，然后再與熱的氣體原子碰撞而導致電荷和能量的轉移，獲得快速運動的原子，它們撞擊涂有樣品的金屬極，通過能量轉移而使樣品分子電離，生成二次離子。通常將樣品溶于惰性的非揮發(fā)性溶劑，并以單分子層覆蓋于探針表面，以提高電離效率，而懸浮樣品不適用。屬于軟電離，一般用作磁式質譜的離子源。第32頁,共133頁，2024年2月25日，星期天特點：分子離子或準分子離子峰強；碎片離子也豐富；適合于熱不穩(wěn)定、難揮發(fā)的樣品，如肽類；其缺點是溶解樣品的溶劑也會被電離而使圖譜復雜化。第33頁,共133頁，2024年2月25日，星期天（四）質量分析器質譜儀的質量分析器位于離子源和檢測器之間，依據(jù)不同的方式將樣品離子按質荷比分開。1單聚焦分析器（singlefocusingmassanalyzer）2雙聚焦分析器（doublefocusingmassanalyzer）3飛行時間分析器(timeofflight）4四極桿濾質器(quadrupolemassfilter)5離子阱分析器(Iontrap)第34頁,共133頁，2024年2月25日，星期天1.單聚焦質量分析器結構：扇形磁場（可以是180°90°60°等）。離子束經加速后飛入磁極間的彎曲后區(qū)，飛行軌道在磁場的作用下發(fā)生偏轉，分離開的離子信號由檢測器檢出。第35頁,共133頁，2024年2月25日，星期天設質量為m，帶有電荷為e的正離子，若其初始能量為0，在離子室中受到加速電壓V的作用，到達離子室的出口狹縫——即分析器的進口狹縫S1，離子具有的動能為:

當離子進入分析器的磁場后，受到洛倫茲力的作用而作半徑為R的圓周運動，圓周運動的離心力要與洛倫茲力平衡，即：合并以上兩式，得到:

式中H為磁分析器的磁場強度

正離子的電荷數(shù)用Z表示，的相對質量單位數(shù)用M表示，H的單位為高斯（1高斯=10-4特），V的單位為伏特，R的單位為cmV第36頁,共133頁，2024年2月25日，星期天可見，R取決與M/Z、H、V，若儀器的H、V一定，則，Z一般為1，所以，表明磁分析器可以把不同質量的離子分離開，這叫做質量色散，而對于相同質量、以不同方向進入扇形磁分析器的離子有會聚作用，起到了方向聚焦的作用，而且僅有方向聚焦，故稱為單聚焦質量分析器。對于一定的質譜儀器來說，離子源的出口狹縫S1及分析器出口狹縫S2的位置是固定的，離子收集器（檢測器）的位置也是固定的，表明R是一定的。進行質譜分析是可以用固定的加速電壓V而連續(xù)改變磁場強度H或固定H連續(xù)改變V，使不同的離子依次通過S2到達檢測器，而獲得質譜圖。前者稱為磁場掃描，后者稱為電壓掃描。第37頁,共133頁，2024年2月25日，星期天特點單聚焦分析結構簡單，操作方便但其分辨率很低。不能滿足有機物分析要求，目前只用于同位素質譜儀和氣體質譜儀。單聚集質譜儀分辨率低的主要原因在于它不能克服離子初始能量分散對分辨率造成的影響。第38頁,共133頁，2024年2月25日，星期天2.雙聚焦質量分析器在單聚焦分析器中，離子源產生的離子在進入加速電場之前，其初始能量并不為零，且各不相同，表明離子源中的離子有一定的能量分散。第39頁,共133頁，2024年2月25日，星期天為了消除離子能量分散對分辨率的影響，通常在扇形磁場前加一扇形電場。質量相同而能量不同的離子經過靜電電場后會彼此分開。即靜電場有能量色散作用。如果設法使靜電場的能量色散作用和磁場的能量色散作用大小相等方向相反，就可以消除能量分散對分辨率的影響。只要是質量相同的離子，經過電場和磁場后可以會聚在一起。另外質量的離子會聚在另一點。改變離子加速電壓可以實現(xiàn)質量掃描。這種由電場和磁場共同實現(xiàn)質量分離的分析器，同時具有方向聚焦和能量聚焦作用，叫雙聚焦質量分析器。第40頁,共133頁，2024年2月25日，星期天離子通過靜電場分析器時，由于受此電場力的作用，會改變運動方向成曲線運動，其離心力等于電場作用力，即：式中Rc為離子在電場分析器的運動曲率半徑，E為分析器的電場強度。則離子運動的軌道半徑可以通過外加靜電場加以控制。只有能動相同的離子才能通過中間狹縫，實現(xiàn)能量聚焦，然后再進行方向聚焦。第41頁,共133頁，2024年2月25日，星期天特點雙聚焦質量分析器的最大優(yōu)點是大大提高了儀器的分辨率。但儀器昂貴，調整、操作、維護均較為困難。第42頁,共133頁，2024年2月25日，星期天3.飛行時間質量分析器（TOF）TOF是一種無磁動態(tài)質量分析器，根據(jù)不同質荷比的離子在無場分離區(qū)中的速度不同，引起漂移時間的差異而實現(xiàn)分離。TOF有直線型或反射型等不同方式。第43頁,共133頁，2024年2月25日，星期天

TOF的主要部分是一個離子漂移管。樣品受到陰極燈絲發(fā)出的電子轟擊后變成離子，柵極G1上的負脈沖將離子引出離子室，G1，G2間的直流電壓差使離子受到加速并進入無場漂移管，最終按質荷比值不同先后到達離子接收極。1-電離室；2-電子接收極；3-陰極；4-離子接收極第44頁,共133頁，2024年2月25日，星期天離子在加速電壓V作用下得到動能，則有：

1/2mv2=eV或v=(2eV/m)1/2離子以速度v進入自由空間（漂移區(qū)），假定離子在漂移區(qū)飛行的時間為T，漂移區(qū)長度為L，則：

T=L/v=L(m/2eV)1/2

對于具有不同m/e的離子，在飛行管中的飛行時間差為：

第45頁,共133頁，2024年2月25日，星期天可見?t取決于不同離子的m/e平方根之差，對于能量相同的離子，離子的質量越大，達到接收器所用的時間越長，質量越小，所用時間越短，根據(jù)這一原理，可以把不同質量的離子分開。適當增加漂移管的長度可以增加分辨率。第46頁,共133頁，2024年2月25日，星期天分子離子第47頁,共133頁，2024年2月25日，星期天目前，采用離子延遲引出技術和離子反射技術，可以在很大程度上克服上述3個原因造成的分辨率下降。第48頁,共133頁，2024年2月25日，星期天通過離子反射技術，質量相同能量不同的離子進入反射器后，能量大的離子速度快，但走的距離遠，能量小的離子速度慢，但走的距離近，經過反射后，二者同時到達檢測器，這樣就消除了由于能量分散造成的分辨率降低。TOF-MS第49頁,共133頁，2024年2月25日，星期天特點儀器結構簡單,不需要磁場、電場等；掃描速度快，可在10-5s內觀察到整段圖譜；無聚焦狹縫，靈敏度很高；可用于大分子的分析（幾十萬原子量單位），在生命科學中用途很廣。第50頁,共133頁，2024年2月25日，星期天4.四極桿濾質器也稱四級桿質量分析器，是一種非磁性結構的動態(tài)質量分析器。由四根截面為雙曲面或圓形的棒狀電極組成，兩組電極間施加一定的直流電壓和頻率為射頻范圍的交流電壓。第51頁,共133頁，2024年2月25日，星期天相對兩根電極間加有電壓（Vdc+Vrf），另外兩根電極間加有-（Vdc+Vrf）（直流電壓Vdc，射頻電壓Vrf或V0cosωt），即加在兩對極桿之間的總電壓為（Vdc+Vrf）。在四極之間的空間處于射頻調制的直流電壓的兩種力作用下的射頻場中，離子進入此射頻場時，只有合適的離子才能通過穩(wěn)定的振蕩穿過電極間隙而進入檢測器。在一定的（Vdc/Vrf)下，改變Vrf可實現(xiàn)掃描。第52頁,共133頁，2024年2月25日，星期天特點無磁分析器；體積小，重量輕；操作方便，掃描速度快；分辨率較高；適用于色譜—質譜聯(lián)用儀器；準確度和精密度低于磁偏轉型質量分析器。第53頁,共133頁，2024年2月25日，星期天5.離子阱檢測器（ITD）ITD是一種通過電場或磁場將氣相離子控制并貯存一段時間的裝置。離子阱的主體是一個環(huán)電極和上下兩端蓋電極，環(huán)電極和上下兩端蓋電極都是繞Z軸旋轉的雙曲面，并滿足r02=2Z02。直流電壓U和射頻電壓Vrf加在環(huán)電極和端蓋電極之間，兩端蓋電極都處于地電位。第54頁,共133頁，2024年2月25日，星期天在穩(wěn)定區(qū)內的離子，軌道振幅保持一定大小，可以長時間留在阱內，不穩(wěn)定區(qū)的離子振幅很快增長，撞擊到電極而消失。對于一定質量的離子，在一定的U和Vrf下，可以處在穩(wěn)定區(qū)。改變U或Vrf的值，離子可能處于非穩(wěn)定區(qū)。如果在引出電極上加負電壓，可以將離子從阱內引出，由電子倍增器檢測。因此，離子阱的質量掃描方式與四極桿類似，是在恒定的U/Vrf下，掃描Vrf獲取質譜。第55頁,共133頁，2024年2月25日，星期天特點結構小巧，質量輕；靈敏度高；而且還有多級質譜功能；它可以用于GC-MS，也可以用于LC-MS。第56頁,共133頁，2024年2月25日，星期天（五）檢測與記錄電子倍增器是現(xiàn)代質譜儀廣泛使用的檢測裝置。一般具有10～20個電極（鈹銅合金或其他材料）。第57頁,共133頁，2024年2月25日，星期天電子倍增器響應快，靈敏度高。隨著使用時間的延長，電極會老化，增益會降低，具有一定的壽命。近代質譜儀中常采用隧道電子倍增器，其工作原理與電子倍增器相似，因為體積小，多個隧道電子倍增器可以串列起來，用于同時檢測多個m/z不同的離子，從而大大提高分析效率。質譜儀常用的檢測器還有閃爍檢測器、法拉第杯和照相底板等。第58頁,共133頁，2024年2月25日，星期天記錄對信號的記錄可采用一組檢流計檢出，或用紫外記錄儀記錄到光敏記錄紙上?，F(xiàn)代質譜儀一般都配有高性能計算機，應用功能強大的操作軟件，設置儀器工作參數(shù)，采集和處理數(shù)據(jù)，打印出報告。第59頁,共133頁，2024年2月25日，星期天四、質譜儀主要性能指標靈敏度(sensitivity)分辨率(resolution)質量范圍(massrange)第60頁,共133頁，2024年2月25日，星期天質量范圍質譜儀的質量測量范圍表示質譜儀所能夠進行分析的樣品的相對原子質量（或相對分子質量）范圍，通常采用以12C來定義的原子質量單位來量度。在非精確測定質量的場合中，常采用原子核中所含質子和中子的總數(shù)即“質量數(shù)”來表示質量的大小，其數(shù)值等于相對質量數(shù)的整數(shù)。氣體質譜儀：2—100u，有機質譜儀：幾十—幾千

第61頁,共133頁，2024年2月25日，星期天分辨率指質譜儀能分辨相鄰兩個最小質量差的質譜峰的能力，常用R表示。一般定義是：對兩個相等強度的相鄰峰，當兩峰間的峰谷不大于其峰高10%時，則認為兩峰已經分開，其分辨率：其中m1、、m2為質量數(shù)，故在兩峰質量較小時，要求儀器分辨率越大。第62頁,共133頁，2024年2月25日，星期天靈敏度質譜儀的靈敏度有絕對靈敏度、相對靈敏度和分析靈敏度等幾種表示方法。絕對靈敏度是指儀器可以檢測到的最小樣品量；相對靈敏度是指儀器可以同時檢測的大組分與小組分含量之比；分析靈敏度則是指輸入儀器的樣品量與儀器輸出的信號之比。第63頁,共133頁，2024年2月25日，星期天五、質譜圖及其判讀（一）質譜的表示法質譜表：將質荷比和其相對強度以表的形式表示，以多巴胺的質譜表為例第64頁,共133頁，2024年2月25日，星期天質譜圖：橫坐標為質荷比；縱坐標為離子的相對豐度，又稱相對強度。質譜中的最強峰的高度定為100%，其它峰的強度就以該峰為基準。這個最強峰又稱基峰。第65頁,共133頁，2024年2月25日，星期天（二）質譜峰類型質譜信號十分豐富。分子在離子源中可以產生各種電離，即同一種分子可以產生多種離子峰，其中比較主要的有分子離子峰、同位素離子峰、碎片離子峰、重排離子峰、亞穩(wěn)離子峰等。1.分子離子峰試樣分子在高能電子撞擊下產生正離子，即：

M＋e→M+＋2e

M+稱為分子離子或母離子(parrention）。第66頁,共133頁，2024年2月25日，星期天分子離子是分子失去一個電子所得到的離子，所以其數(shù)值等于化合物的相對分子量，是所有離子峰中m/e最大的（除了同位素離子峰外），所以若質譜圖中如有分子離子峰出現(xiàn)，必位于譜的最右邊，這在譜圖中具有特殊意義。同時分子離子必然符合“氮律”。分子量“氮律”：分子中若含有偶數(shù)個氮原子，則相對分子質量將是偶數(shù)；反之，將是奇數(shù)。第67頁,共133頁，2024年2月25日，星期天第68頁,共133頁，2024年2月25日，星期天2.碎片離子分子離子產生后可能具有較高的能量，將會通過進一步碎裂或重然而釋放能量，碎裂后產生的離子形成的峰稱為碎片離子峰。通過各種碎片離子相對峰高的分析，有可能獲得整個分子結構的信息。（1）游離基引發(fā)的斷裂（α斷裂）（2）正電荷引發(fā)的斷裂（誘導斷裂或i斷裂）（3）σ斷裂第69頁,共133頁，2024年2月25日，星期天與碎片離子相關的符號和縮寫第70頁,共133頁，2024年2月25日，星期天游離基引發(fā)的斷裂（α斷裂）在奇電子離子中，定域的自由基位置（即游離基中心）由于有強烈的電子配對傾向，它即提供了孤電子與毗鄰（α位）的原子形成新的鍵，導致α-原子另一端的鍵斷裂。這種斷裂通常稱為α斷裂。該鍵斷裂時，兩個碎片各得一個電子，因此是均裂，產生一個偶電子離子和一個自由基。其通式可表達為：

.第71頁,共133頁，2024年2月25日，星期天烯烴：電離時失去一個π電子，則π鍵上的自由基中心引發(fā)α斷裂。如果是端烯則發(fā)生烯丙基斷裂，形成穩(wěn)定的典型烯丙基離子含飽和官能團的化合物：如胺、醇、醚、硫醇、硫醚、鹵代物等。電離后構成雜原子上的自由基中心，引發(fā)了α斷裂。第72頁,共133頁，2024年2月25日，星期天舉例第73頁,共133頁，2024年2月25日，星期天正電荷引發(fā)的斷裂（誘導斷裂或i斷裂）

在奇電子（OE）或偶電子（EE）離子中，由于正電荷的誘導效應，吸引了鄰鍵上的一對成鍵電子而導致該鍵的斷裂，稱為誘導斷裂。此時，斷裂鍵的一對電子同時轉移到一個碎片上，因此屬于“異裂”，可表達為：第74頁,共133頁，2024年2月25日，星期天

一般情況下，電負性強的元素誘導力也強。在有些情況下，誘導斷裂和α斷裂同時存在，由于i斷裂需要電荷轉移，因此，i斷裂不如α斷裂容易進行。表現(xiàn)在質譜中，相應α斷裂的離子峰強，i斷裂產生的離子峰較弱。例如乙醚的斷裂：第75頁,共133頁，2024年2月25日，星期天σ斷裂如果化合物分子中具有σ鍵，如烴類化合物，則會發(fā)生σ鍵斷裂。σ鍵斷裂需要的能量大，當化合物中沒有π電子和n電子時，σ鍵的斷裂才可能成為主要的斷裂方式。斷裂后形成的產物越穩(wěn)定，這樣的斷裂就越容易進行，陽碳離子的穩(wěn)定性順序為叔>仲>伯，因此，碳氫化合物最容易在分支處發(fā)生鍵的斷裂。并且，失去最大烷基的斷裂最容易進行。例如：第76頁,共133頁，2024年2月25日，星期天正己烷第77頁,共133頁，2024年2月25日，星期天3.同位素離子大多數(shù)元素都是由具有一定自然豐度的同位素組成。這些元素形成化合物后,其同位素就以一定的豐度出現(xiàn)在化合物中。化合物質譜中就會有不同同位素形成的離子峰,通常把由重同位素形成的離子峰叫同位素離子峰。在同位素離子中，可能是單一個同位素原子的離子，也可能是多種元素的同位素原子組合的離子，故其質量數(shù)可能有M、M＋1、M＋2……，M為最輕的同位素分子離子峰，其他碎片離子峰也是類似。第78頁,共133頁，2024年2月25日，星期天以甲烷(CH4)為例：在甲烷的質譜圖中可以觀察到m/z=16的分子離子峰和m/z=17、m/z=18即M+1和M+2由同位素貢獻的同位素峰，M、M+1、M+2峰構成同位素簇。同樣，碎片離子也存在同位素簇第79頁,共133頁，2024年2月25日，星期天某些常見元素的天然同位素豐度元素最大豐度同位素相對于最大豐度

同位素為100的其他同位素的豐度氫1H2H0.016碳12C13C1.08氮14N15N0.37氧

16O17O0.04

18O0.20硫

32S33S0.78

34S4.40氯35Cl37Cl32.5溴79Br81Br98.0第80頁,共133頁，2024年2月25日，星期天在一般有機分子鑒定時，可以通過同位素峰的統(tǒng)計分布來確定其元素組成，分子離子的同位素離子峰相對強度之比總是符合統(tǒng)計規(guī)律的。例如，只含C、H、O、N化合物中，重同位素的豐度都較小，同位素峰很弱。其相對強度可按經驗公式粗略估算：

僅含C、H、O的化合物第81頁,共133頁，2024年2月25日，星期天對于分子只含有同一種鹵原子時，同位素離子強度之比，可用二項式展開式各項之比表示：

(a+b)n式中：a-某元素輕同位素的豐度；b-某元素重同位素的豐度；n-同位素個數(shù)。例如，某化合物分子中含有三個氯，其分子離子的三種同位素離子強度之比，由上式計算得：則n=3、a=3、b=1(a+b)3=a3+3a2b+3ab2+b3=27+27+9+1則M:M+2:M+4:M+6≈27:27:9:1

如果知道了同位素的元素個數(shù)，可以推測各同位素離子強度之比。同樣，如果知道了各同位素離子強度之比，可以估計出元素的個數(shù)。同位素離子峰的強度比在推斷化合物分子式時很有用處。第82頁,共133頁，2024年2月25日，星期天4.重排離子在分子離子的裂解過程中，伴隨著化學鍵斷裂，還可能出現(xiàn)原子或原子團的重排，產生比較穩(wěn)定的重排離子，因此在質譜圖上出現(xiàn)重排離子峰。第83頁,共133頁，2024年2月25日，星期天麥氏重排具有不飽和官能團C=X（X為O、S、N、C等）及其γ-H原子結構的化合物，γ-H原子可以通過六元環(huán)空間排列的過渡態(tài)，向缺電子的部位轉移，發(fā)生γ-H的斷裂，同時伴隨C=X的β鍵斷裂（屬于均裂），這種斷裂稱為麥克拉弗梯重排，簡稱麥氏重排，通式為：第84頁,共133頁，2024年2月25日，星期天5.亞穩(wěn)離子質量為m1的離子在離開離子源受電場加速后，在進入質量分析器之前，由于碰撞等原因很容易進一步分裂失去中性碎片而形成質量為m2的離子，即m1→m2+?m，由于一部分能量被中性碎片帶走，此時的m2離子比在離子源中形成的m1離子能量小，故將在磁場中產生更大偏轉，觀察到的m/z較小。則把這種在飛行中發(fā)生裂解的母離子稱為亞穩(wěn)離子，由它形成的質譜峰為亞穩(wěn)峰，此峰可看成m1和m2的“混合峰”，因此形成“寬峰”，極易識別。第85頁,共133頁，2024年2月25日，星期天質荷比一般不是整數(shù)，與母離子和子離子有如下關系：通過亞穩(wěn)離子峰可以獲得有關裂解信息，通過對m*峰觀察和測量，可找到相關母離子的質量m1與子離子的質量m2，從而確定裂解途徑。第86頁,共133頁，2024年2月25日，星期天6.準分子離子利用CI電離法時常得到比分子質量多或少1個質量單位的離子，稱準分子離子。第87頁,共133頁，2024年2月25日，星期天（三）質譜的應用一張化合物的質譜包含著有關化合物的很豐富的信息。在很多情況下，僅依靠質譜就可以確定化合物的相對分子量、化學分子式和分子結構。而且，質譜分析的樣品用量極微，因此，質譜法是進行有機物鑒定的有力工具。當然，對于復雜的有機化合物的定性，還要借助于紅外光譜，紫外光譜，核磁共振等分析方法。第88頁,共133頁，2024年2月25日，星期天1.相對分子質量根據(jù)分子離子峰質荷比可確定相對分子量，通常分子離子峰位于質譜圖最右邊，但由于分子離子的穩(wěn)定性及重排等，質譜圖上質荷比最大的峰并不一定是分子離子峰。如何辯認分子離子峰呢？1）原則上除同位素峰外，分子離子峰是最高質量的峰。但要注意“醚、胺、脂的(M+H)+峰”及“芳醛、醇等的(M-H)+峰”。2）分子離子峰應符合“氮律”。在C、H、O組成的化合物中，分子離子峰的質量數(shù)一定是偶數(shù)；在含C、H、O、N化合物中，含偶數(shù)個N的分子量為偶數(shù)，含奇數(shù)個N的分子量為奇數(shù)。3）分子離子峰與鄰近峰的質量差是否合理。有機分子失去碎片大小是有規(guī)律的：如失去H、CH3、H2O、C2H5…….，因而質譜圖中可看到M-1，M-15，M-18，M-28等峰，而不可能出現(xiàn)M-3，M-14，M-24等峰，如出現(xiàn)這樣的峰，則該峰一定不是分子離子峰。4）EI源中，當電子轟擊電壓降低，強度不增加的峰不是分子離子峰。第89頁,共133頁，2024年2月25日，星期天2.化學分子式a）高分辨質譜：可分辨質荷比相差很小的分子離子或碎片離子。如CO和N2分子離子的m/z均為28，但其準確質荷比分別為28.0040和27.9949，高分辨質譜可以識別它們。b)低分辨質譜則不能分辨m/z相差很小的碎片離子，如CO和N2。通常通過同位素相對豐度法來確定分子的化學式。第90頁,共133頁，2024年2月25日，星期天對于化合物CwHxNyOz，其同位素離子峰(M+1)+和(M+2)+與分子離子峰的強度比分別為：第91頁,共133頁，2024年2月25日，星期天3.結構鑒定在一定的實驗條件下，各種分子都有自己特征的裂解模式和途徑，產生各具特征的離子峰，包括其分子離子峰、同位素離子峰及各種碎片離子峰。根據(jù)這些峰的質量及強度信息，可以推斷化合物的結構。如果從單一的質譜信息還不足以確定化合物的結構或需進一步確證的話，可借助于其他的手段，如紅外光譜法、核磁共振波譜法、紫外－可見吸收光譜法等。第92頁,共133頁，2024年2月25日，星期天六、生物質譜技術簡介生物質譜主要用于解決兩個生物大分子的分析問題：其一是精確測定生物大分子，如蛋白質、核苷酸和糖類等的分子量，并提供它們的分子結構信息；其二是對存在于生命復雜體系中的相互作用。按離子源的類型：電噴霧電離（ESI）和基質輔助激光解吸電離（MALDI）第93頁,共133頁，2024年2月25日，星期天（一）生物質譜的軟電離技術第94頁,共133頁，2024年2月25日，星期天1.電噴霧電離（ESI）ESI是在毛細管的出口處施加一高電壓，所產生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相。第95頁,共133頁，2024年2月25日，星期天第96頁,共133頁，2024年2月25日，星期天特點是一種軟電離方式；是產生高電荷離子而不是碎片離子，使質量電荷比（m/z）降低到多數(shù)質量分析儀器都可以檢測的范圍，因而大大擴展了分子量的分析范圍；它適合于分析極性強的大分子有機化合物，如蛋白質、肽、糖等；可以方便地與多種分離技術聯(lián)合使用，如液質聯(lián)用（LC－MS）。第97頁,共133頁，2024年2月25日，星期天2.基質輔助激光解吸電離（MALDI）基質輔助激光解吸電離工作原理MALDI引入了固體基質，使樣品液與基質液混合，滴于靶面，在真空中快速干燥，制成極細的混晶。當激光束照射在涂有樣品和基質混晶的靶面上時，基質的有機分子在固態(tài)混晶中共振吸收能量，并將能量傳遞到基質有機物晶體的晶格中，使晶格受到瞬時強烈擾動而解吸出離子或中性分子，并通過這些離子或分子將吸收的能量傳遞給生物大分子而使其電離。第98頁,共133頁，2024年2月25日，星期天MALDIMatrix應具有的特性能夠嵌入樣品分子間并能起到隔離樣品分子之間的相互作用(如形成共結晶);能溶解于可溶解樣品分子的溶劑;在真空狀態(tài)下是穩(wěn)定的;可吸收激光,既與激光形成共振吸收;可激發(fā)樣品分子離子化.第99頁,共133頁，2024年2月25日，星期天常用基質第100頁,共133頁，2024年2月25日，星期天特點基質輔助激光解吸離子化中，激光的能量大量消耗于晶格擾動中，并不是直接作用與生物大分子使之裂解，因此是一種軟電離方式；激光采用N2激光源，波長為337nm，為脈沖式工作方式；基質輔助激光解吸電離源與飛行時間質量分析儀所構成的質譜儀，得到的質譜信息主要是分子離子、準分子離子，而碎片離子和多電荷離子較少。第101頁,共133頁，2024年2月25日，星期天通常用飛行時間檢測器作為質量分析器，構成基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜。可用于生物大分子物質分子量的測定；蛋白質高通量鑒定；有機小分子化合物分子量測定；寡核苷酸的分析；基因的單核苷酸多態(tài)性的分析等。第102頁,共133頁，2024年2月25日，星期天MALDI-TOFMS抗高鹽和非揮發(fā)性雜質干擾高通量第103頁,共133頁，2024年2月25日，星期天飛行時間質譜儀的源后裂解離子在飛行過程中如果發(fā)生裂解，新產生的離子仍然以母離子速度飛行。因此在直線型漂移管中觀測不到新生成的離子。如果采用帶有反射器的漂移管，因為新生成的離子與其母離子動能不同，可在反射器中被分開。這種操作方式稱為源后裂解(Postsourcedecomposition，PSD)。通過PSD操作可以得到結構信息。因此，可以認為反射型TOFMS也具有MS-MS功能。利用PSD譜圖，結合數(shù)據(jù)庫檢索可以迅速、高特異性地鑒定蛋白質。第104頁,共133頁，2024年2月25日，星期天（二）質譜聯(lián)用技術串聯(lián)質譜第105頁,共133頁，2024年2月25日，星期天1.色質聯(lián)用A、氣相色譜－質譜(GC-MS)B、液相色譜－質譜(LC-MS)C、毛細管電泳－質譜(CE-MS)

GC-MS聯(lián)用應用十分廣泛，從環(huán)境污染分析、食品香料分析鑒定到醫(yī)療檢驗分析、藥物代謝研究等。而且GC-MS聯(lián)用是國際奧委會進行興奮劑藥檢的有力工具之一。對于熱穩(wěn)定性差、不易汽化的樣品，GS-MS聯(lián)用有一定的困難，因此，近年來又發(fā)展了LC-MS聯(lián)用技術。CE-MS是色質聯(lián)用中新的發(fā)展方向。第106頁,共133頁，2024年2月25日，星期天LC-MS第107頁,共133頁，2024年2月25日，星期天2.串聯(lián)質譜樣品酶解酶解片斷一級質譜PMF肽指紋圖譜串聯(lián)質譜對庫檢索序列數(shù)據(jù)庫成功鑒定PSMs及后篩選序列分析未知蛋白肽譜鑒定流程第108頁,共133頁，2024年2月25日，星期天一級質譜蛋白質經過酶解后，送入質譜儀，得到一級質譜。目前來說，由MALDI-TOF質譜儀產生的質譜圖精度較高，而由ESI質譜儀產生的質譜圖精度相對較低。第109頁,共133頁，2024年2月25日，星期天二級質譜在一級質譜圖中，選擇其中的一個峰，對其進行CID過程，就得到一張二級質譜圖。從一級質譜圖里選出部分峰做二級質譜一級質譜圖二級質譜圖第110頁,共133頁，2024年2月25日，星期天裂解方式碰撞誘導分解（CollisionInduceddissociation，CID）源后衰減（Postsourcedecay，PSD）第111頁,共133頁，2024年2月25日，星期天三級四極質譜儀（ESI-Q-Q-QMS）第112頁,共133頁，2024年2月25日，星期天三級四極質譜儀有三組四極桿，第一組四級桿用于質量分離(MS1)，第二組四極桿用于碰撞活化(CID)，第三組四極桿用于質量分離(MS2)。在串聯(lián)質譜中采用碰撞活化解離(Collisionactivateddissociation,CAD)技術把離子“打碎”。碰撞活化分解也稱為碰撞誘導解離(CollisionInduceddissociation,CID)，在碰撞室內進行，帶有一定能量的離子進入碰撞室后，與室內惰性氣體的分子或原子（也可以是空氣）發(fā)生碰撞，離子發(fā)生碎裂。第113頁,共133頁，2024年2月25日，星期天掃描方式子離子掃描方式：由MS1選定質量，CID碎裂之后，由MS2掃描得子離子譜。母離子掃描方式：由MS2選定一個子離子，MS1掃描，檢測器得到的是能產生選定子離子的那些離子，即母離子譜。中性丟失譜掃描方式：MS1和MS2同時掃描。只是二者始終保持一定固定的質量差(即中性丟失質量)，只有滿足相差固定質量的離子才得到檢測。多離子反應監(jiān)測方式：由MS1選擇一個或幾個特定離子，經碰撞碎裂之后，由其子離子中選出一特定離子，只有同時滿足MS1和MS2選定的一對離子時,才有信號產生。用這種掃描方式的好處是增加了選擇性，即便是兩個質量相同的離子同時通過了MS1，但仍可以依靠其子離子的不同將其分開。第114頁,共133頁，2024年2月25日，星期天電噴霧離子化－四極桿－時間飛行質譜

ESI-Q-TOFMS與LC聯(lián)用脫鹽質量范圍大可從頭測序第115頁,共133頁，2024年2月25日，星期天MALDI-TOF/TOF-MS/MSIonSource#2IonSource#1PrecursorIonSelector(TIS)CollisionCellMassAnalyzer#2DetectorMassAnalyzer

#1GeneratesandAcceleratesIonsTOF1SeparatesIonsInducesCIDFragmentationofPrecursorRe-AcceleratesFragmentsTOF2withMirrorSeparatesFragmentsSelectsIons抗高鹽干擾高通量質量范圍大可從頭測序第116頁,共133頁，2024年2月25日，星期天（三）應用舉例一、生物質譜在蛋白質和多肽研究中的應用二、生物質譜在多糖結構測定中的應用三、生物質譜在核酸分析中的應用第117頁,共133頁，2024年2月25日，星期天生物質譜在蛋白質和多肽研究中的應用1.相對分子質量測定2.肽譜測定3.肽序列測定4.蛋白質翻譯后修飾第118頁,共133頁，2024年2月25日，星期天1.相對分子質量測定MALDI-TOF