《分子生物學實驗指導》第4章 PCR技術(shù)

PAGEPAGE73第四章PCR技術(shù)PCR（polymeasechainreaction）技術(shù)是20世紀80年代中期發(fā)展起來的一種DNA體外擴增新技術(shù)，它是現(xiàn)代分子生物學和分子遺傳學研究的重要方法。它是將提取的總DNA(或cDNA)變性后使之成為單鏈，變性后的DNA將作為DNA聚合酶鏈式反應的模板。首先設計并合成與待擴增的雙鏈DNA片段兩條鏈的3’端互補的寡聚核苷酸引物(一般每個引物多于15個核苷酸)，然后在50～60℃的溫度下將過量的引物加入到少量的DNA樣品，這時DNA保持單鏈狀態(tài)，而合成的特異性引物能夠與其互補序列配對復性，這些雜交上的寡聚核苷酸將作為引物，參與模板DNA互補鏈的合成。加入dNTP和耐熱的TaqDNA聚合酶后，DNA合成反應開始，TaqDNA聚合酶能在高達72℃的條件下進行反應。當反應完成時，將反應混合物加熱到95℃使新合成的DNA雙鏈變性，當溫度下降以后，由于過量引物的存在，另一輪的反應又可以進行。這種合成—變性—退火—合成的循環(huán)可以重復多次，使所需要的DNA片段得到特異性的擴增，在理想的條件下，每一次循環(huán)使兩個引物位點之間的DNA序列增加一倍。這項技術(shù)從開始誕生到現(xiàn)在，不斷發(fā)展和簡化，現(xiàn)已完全實現(xiàn)了自動化。目前已生產(chǎn)出各種型號的PCR儀，由于引物的長短和堿基的組成不同，所需的復性溫度和時間存在差異。現(xiàn)已衍生了許多相關(guān)的方法，如RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)，AP-PCR(arbibaryprimed－PCR)，DAF(DNAamplificationfingerprint)，AFLP(amplifiedfragmentpolymorphism)等。實驗一PCR技術(shù)與分析一、原理和用途PCR擴增是一種特定區(qū)段DNA的復制，這仍然遵守DNA生物合成的基本規(guī)律，其復制方式是以半保留形式進行的。PCR法擴增DNA，必須有DNA模板、DNA聚合酶、DNA引物和四種dNTPs。特異性DNA片段的擴增需要2個寡核苷酸序列互不相同的引物，它們與模板DNA兩條鏈上各一段序列互補，一個是上游引物，一個是下游引物，擴增的片段長度正好是兩個引物之間的長度加上兩個引物的長度。引物1和引物2這段DNA的序列是已知的，這是PCR擴增的必要條件，而它們之間的序列未必清楚。引物1和引物2序列的長度一般為15～30個堿基，可以用DNA合成儀合成二個引物。PCR擴增系統(tǒng)中模板DNA經(jīng)過高溫變性后，分解為二條單鏈。然后，系統(tǒng)溫度降低到退火溫度（38～65℃），引物與其互補的模板DNA結(jié)合，形成局部雙鏈，這是DNA復制的固定起點，即延伸的固定起點。PCR擴增過程中，鏈的延伸是有方向性的。以引物為固定起點，延伸才能進行。目前使用的DNA聚合酶，合成DNA的方向都是從5'端到3'端。當PCR擴增系統(tǒng)溫度升至60～72℃時，已經(jīng)與引物退火的單鏈，由固定的延伸起點在聚合酶的作用下4種dNTPs會迅速地以舊鏈為模板，合成新鏈。若以Ａ'和B'引物而言，合成的方向都是從5'端到3'端的方向進行。PCR擴增片段的長度正好是兩個引物之間的長度加上兩個引物的長度。其范圍從數(shù)百個至數(shù)千個堿基，使用長片段擴增的Taq聚合酶，可達20kb以上。利用PCR技術(shù)能夠從復雜的DNA分子群體中選擇性地復制一段特異的序列，使某一DNA片段得到特異性的擴增。其基本原理就是仿照生物體內(nèi)DNA變性一復性一DNA鏈延長的周期循環(huán)過程（見前述）。模板DNA經(jīng)過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段的循環(huán)過程。前一輪擴增產(chǎn)物又是下一輪擴增的模板，每循環(huán)一次，模板DNA的拷貝數(shù)加倍。第一次循環(huán)，由一條模板雙鏈DNA變成二條；第二次循環(huán)，則變成４條；第三次循環(huán)，就變成８條；以幾何級數(shù)擴增下去。循環(huán)n次，理論上可得到2n個分子。一般的擴增循環(huán)是30～35次，最后形成特定的DNA片段。PCR擴增DNA特定區(qū)段，是由人工合成的二條寡核苷酸引物決定的，引物是PCR擴增的關(guān)鍵。目前PCR技術(shù)已用于生物科學的許多領(lǐng)域，已在基因擴增、基因的克隆、DNA分子多樣性分析、疾病診斷、突變檢測、基因表達分析等方面得到了廣泛的應用。對于PCR技術(shù)，由于所用的DNA量很少，因此除了分離的DNA可用于PCR外，還有其它的DNA微量分離法，甚至微量細胞用開水煮一下都可以用于PCR。為了加入PCR精確的DNA量，同樣必須測定DNA的濃度，再根據(jù)其濃度計算出所需DNA量的體積。二、實驗材料DNA樣品溶液。三、溶液與緩沖液TaqDNA聚合酶dNTP10×PCR緩沖液上游引物，下游引物25mmol/LMgCl210×TBE緩沖液：900mmol/LTris900mmol/L硼酸100mmol/LEDTApH調(diào)至8.0，高壓滅菌，用時可稀釋為0.5×或1×TBE緩沖液用。8．10mg/mL溴化乙啶染色液9．溴酚藍電泳加樣緩沖液：0.25％溴酚藍0.25％二甲苯青FF40％（W/V）蔗糖水溶液10．DNAMarker：pBR322／MSP。四、儀器設備及耗材PCR儀，小型高速離心機，旋渦振蕩器，電泳儀，電泳槽，凝膠板槽，膠梳子，微波爐，電子天平，凝膠成像儀或紫外透射議，離心管架，吸頭盒，2μ、10μ、100μ移液器，10μ、200μ吸頭，0.2mL離心管，膠帶紙等。五、實驗方法PCR反應物的組成：在一個0.2mL的PCR離心管中2.5μ10×PCR緩沖液2.5μ2mmol/LdNTP2.5μ25mmol/LMg++1.0μ12.5pmol/μ上游引物1.0μ12.5pmol/μ下游引物1.0μ100～200ng/μ模板DNA0.5UTaqDNA聚合酶加水到25μ將以上溶液放在冰上，按以上順序?qū)⒁陨先芤阂来渭尤氲揭粋€滅過菌的0.2mLPCR管中。振蕩混勻，短時離心。將帶有樣品的PCR離心管插在PCR儀中，按下列的程序運行：PCR特異性擴增的程序：95℃預變性5min，35個循環(huán)（94℃變性30s后，60℃退火60s，72℃延伸2min），72℃延長10min。注意：退火溫度60℃不是固定的，可根據(jù)引物堿基的長度和組成而改變。電泳：方法同上(第三章實驗一：核酸(DNA或RNA)的瓊脂糖凝膠電泳)，但用1.4%～2.0%瓊脂糖凝膠電泳，電泳60V2～3h。5．電泳結(jié)束后，在凝膠成像儀上觀察和照相，分析。正常情況下這種擴增產(chǎn)物只有一條已知長度的DNA擴增帶。六、作業(yè)與思考題PCR技術(shù)的原理是什么？DNA的擴增循環(huán)是無限的嗎？在特異性擴增中，引物有何要求？實驗二RAPD指紋技術(shù)一、原理和用途RAPD技術(shù)是PCR技術(shù)的一種擴展，一般指的是利用一個9～10堿基的隨機引物擴增生物的整個基因組，與上述方法的區(qū)別在于RAPD技術(shù)只用一個引物。在合適引物的情況下其擴增引物可產(chǎn)生豐富的多態(tài)DNA帶譜。一般退火溫度為38℃，擴增45個循環(huán)，模板30～300ng。PCR擴增后，擴增產(chǎn)物用凝膠電泳分離而產(chǎn)生不同個體多態(tài)DNA片段。RAPD技術(shù)所用的引物是隨機的，但對某一特定序列的引物來說，如果該引物序列在模板DNA上有兩個或兩個以上不同鏈上的互補序列，且這些位置之間的距離適當就可擴增出DNA片段(圖4-1)。如果引物互補位點發(fā)生堿基突變，導致互補位點減少；出現(xiàn)新的互補位點；互補位點之間的DNA發(fā)生插入或缺失，使擴增產(chǎn)物長度發(fā)生變化；或插入片段過大，導致不能擴增，均可檢測出DNA在這些區(qū)域的多態(tài)性。不同引物由于其在模板DNA上互補位置及數(shù)目不同，擴增產(chǎn)物片段的大小及數(shù)量也會不同，同一種引物可能只能檢測到模板基因組DNA的部分區(qū)域上的多態(tài)，但一系列引物圖4-1RAPD-PCR圖4-1RAPD-PCR的反應原理二、實驗材料DNA樣品溶液。三、溶液與緩沖液TaqDNA聚合酶dNTP10×PCR緩沖液隨機引物：9～10堿基的隨機引物25mmol/LMgCl27．10×TBE緩沖液：900mmol/LTris900mmol/L硼酸100mmol/LEDTApH調(diào)至8.0，高壓滅菌。用時可稀釋為0.5×或1×TBE緩沖液用。8．10mg/mL溴化乙啶染色液9．溴酚藍電泳加樣緩沖液：0.25％溴酚藍0.25％二甲苯青FF40％（W/V）蔗糖水溶液10．DNAMarker：pBR322／MSP。四、儀器設備及耗材PCR儀，小型高速離心機，旋渦振蕩器，電泳儀，電泳槽，凝膠板槽，膠梳子，微波爐，電子天平，凝膠成像儀或紫外透射議，離心管架，吸頭盒，2μL、10μL、100μL移液器，10μL、200μL吸頭，0.2mL離心管，膠帶紙等。五、實驗方法1．下列溶液被加到一個0.2mL的PCR離心管中，終體積為25μL。10×PCR緩沖液2.5μ2mmol/LdNTP2.5μ10μmol/L引物2.5μ25mmol/LMg++2.5μ200ng/μ模板DNA1.0μ0.5U/μTaqDNA聚合酶1.0μ加水到25μ將以上溶液放在冰上，按以上順序?qū)⒁陨先芤阂来渭尤氲揭粋€滅過菌的0.2mLPCR管中。2．振蕩混勻，短時離心。3．將帶有樣品的PCR離心管插在PCR儀中，按下列的程序運行：94℃1.5min變性后，45個循環(huán)（變性94℃30s,復性36～42℃1min，鏈延長72℃2min），最后一步延長72℃10min。注意：退火溫度可根據(jù)引物堿基的長度和組成而改變。4．電泳：方法同上(第三章實驗四：瓊脂糖凝膠制作與電泳)，但用1.4%～2.0%瓊脂糖凝膠電泳，電泳60V3.5h。5．在凝膠成像儀上觀察和照相、分析。在合適的引物擴增下可產(chǎn)生豐富的多態(tài)性帶紋。六、作業(yè)與思考題RAPD技術(shù)的原理是什么？哪些因素都影響RAPD的擴增結(jié)果？實驗三PCR-SSCP技術(shù)一、原理和用途SSCP（singlestrandconformationpolymorphism）叫單鏈構(gòu)像多態(tài)性。其原理為：生物大分子在單鏈旋轉(zhuǎn)時由取代基團形成不同的立體結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生不同的構(gòu)像，這種結(jié)構(gòu)的改變不涉及共價鍵的破壞。DNA片段由雙鏈變成單鏈后，在非變性的條件下會折疊成不同的空間構(gòu)像，單鏈的這種空間構(gòu)像會因為個別核苷酸的置換而改變，長度相同或相近的單鏈在電泳時由于構(gòu)像不同而具有不同的遷移率，從而顯示多態(tài)性。在進行SSCP分析時，應先將擴增后的DNA片段變性為單鏈，然后在非變性的聚丙烯酰胺凝膠中電泳。所以，PCR-SSCP技術(shù)在檢測生物DNA分子遺傳多樣性方面具有重要作用。二、實驗材料DNA樣品溶液。三、溶液與緩沖液TaqDNA聚合酶DNTPs10×PCR緩沖液上游引物與下游引物25mmol/LMgCl210×TBE緩沖液：用時可稀釋為0.5×或1×TBE緩沖液。50%丙烯酰胺凝膠溶液：49g丙烯酰胺+N，N′亞甲基雙丙烯酰胺1g加水至100mL，37℃溶解，置于棕色瓶中4℃保存。溴酚藍電泳加樣緩沖液10%過硫酸胺（APS）TEMED（N,N,N′,N′-四甲基乙二胺）銀染溶液的配制：固定液：10%乙醇氧化液：1%硝酸染色液：0.1%AgNO3顯色液：2%Na2CO3。無水碳酸鈉6g，硫代硫酸鈉0.3mg，溶于300mL純水中，用時加入37%甲醛0.4mL。終止液：4%醋酸13．SSCP分析變性緩沖液：10mL95%甲酰胺，200μ0.5mol/LEDTA（pH8.0），0.25％二甲苯青FF，0.25％溴酚藍。14．DMSO（二甲基亞砜）15．DNAMarker：100LadderDNAMarker四、儀器設備及耗材PCR儀，小型高速離心機，電泳儀，垂直電泳槽，脫色搖床，水浴振蕩器，膠梳子，微波爐，電子天平，凝膠成像儀，離心管架，吸頭盒，10μ微量加樣器，2μ10μ、100μ移液器，10μ、200μ吸頭，0.2mLPCR管，1.5mL離心管，膠帶紙等。五、實驗方法1．下列溶液被加到一個0.2mL的PCR管中，終體積為25μ。0.5U/μTaqDNA聚合酶25mmol/LMgCl210×Buffer2.5mmol/LdNTPsDMSO上游引物(10pmol)下游引物(10pmol)DNA模板純水總體積2.0μ2.0μ2.5μ1.5μ1.5μ0.5μ0.5μ2.0μ12.5μ25.0μ2．PCR-SSCP的PCR反應程序95℃4min×30個循環(huán)×30×30×30個循環(huán)×30×30X℃30s72℃2min72℃10min 注：X℃退火溫度因引物堿基組成和長度不同而有差異。3．PCR-SSCP的PCR產(chǎn)物電泳：PCR擴增完成后，從每個反應管中，取8μ擴增產(chǎn)物加1μL溴酚藍電泳加樣緩沖液；混勻加樣于2%的瓊脂糖凝膠上，另在一樣品孔中加2μL100LadderDNAMarker作參照,EB染色，10V/cm電泳1h左右。電泳結(jié)束后，紫外透射儀上檢測。4．PCR-SSCP的PCR產(chǎn)物變性：（1）取PCR擴增產(chǎn)物8μL于一滅菌離心管中，加入等體積的變性緩沖液中，封好離心管。（2）95℃水浴中變性5～10min后，立即冰浴5min以上，直至上樣時取出。5．PCR-SSCP的PCR產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳（1）電泳裝置的準備：將聚丙烯酰胺垂直電泳槽中的凝膠玻璃板充分洗凈，涼干后小心裝入膠框，再裝在垂直電泳槽中，將螺絲擰緊，然后用1%瓊脂糖凝膠封住膠框的下邊以防漏膠。（2）聚丙烯酰胺凝膠的制作：（8%PAGE）50%丙烯酰胺4.8mL（避光4℃保存）5×TBE6mL5％甘油1.5mL純水17.5mL10%APS210μLTEMED18μL合計30mL注意：根據(jù)垂直電泳槽的大小確定聚丙烯酰胺凝膠的體積。（3膠的制作、灌膠、點樣方法：將膠混勻后快速倒入玻璃板夾層中，插入梳子，待膠凝固后（1h以上），拔掉梳子，用水沖洗加樣孔，然后用移液器或吸水紙吸取水分（目的是防止電泳后帶不整齊），再點樣。（4）電泳：在膠槽中倒入電泳緩沖液（0.5×TBE），在室溫下，5V/cm電泳至溴酚藍電泳加樣緩沖液適當位置時（電泳12～14h），停止電泳。（5）回收垂直電泳槽中的電泳緩沖液，卸下玻璃板，將其置于染色缸內(nèi)用薄鋼勺或刀片小心地將上面的玻璃板從一角撬起，將上面的玻璃板平穩(wěn)的拿開。有時候凝膠仍附著在下面的玻璃板上，可連同玻璃板進行染色，很快凝膠即從玻璃板上脫落。6．聚丙烯酰胺凝膠中DNA的染色常用的染色方法兩種，一種為溴化乙錠染色法，另一種為硝酸銀溶液染色法。本實驗介紹常規(guī)的硝酸銀溶液染色法。（1）將染缸中的凝膠，先用蒸餾水沖洗一遍。（2）固定：加入10%乙醇固定10min，棄去固定液。（3）氧化：加入1%硝酸，3min，棄去氧化液。用水漂洗2次，每次10s。（4）染色：加入0.1%AgNO3，放在脫色搖床上15～30min后，將硝酸銀倒掉，用水沖洗15s。（5）顯色：用2%Na2CO3顯色，待條帶清晰后將溶液倒掉，然后加入4%的乙酸溶液停止顯色?；厥找宜崛芤捍笥谩Ｄz浸泡水中至照相。7．用凝膠成像儀照相，然后判斷SSCP的基因型。六、作業(yè)與思考題1．為什么在95℃水浴中變性5～10min后要立即冰浴？2．比較特異性擴增和RAPD擴增和微衛(wèi)星擴增以及SSCP擴增的引物和程序有何異同？3．比較微衛(wèi)星電泳和SSCP電泳有何不同之處和相似之處？實驗四PCR-SSR技術(shù)一、原理和用途在真核生物基因組中，除了基因的編碼序列和調(diào)控序列外，還有許多未知功能的重復序列。微衛(wèi)星又稱為短串聯(lián)重復序列(STR)。這是一類由1～6個核苷酸為重復單位組成的串聯(lián)重復序列，重復次數(shù)為10～20次。由于重復的次數(shù)不同以及重復程度的不完全造成了每個微衛(wèi)星位點的多態(tài)性。大量研究表明，微衛(wèi)星標記在基因組中廣泛且均勻分布，數(shù)目巨大，多態(tài)含量豐富；遵循孟德爾遺傳規(guī)律；等位基因間呈共顯性遺傳；側(cè)翼序列保守，據(jù)此可設計引物擴增出多態(tài)的DNA片斷。微衛(wèi)星可用于跨物種擴增；檢測方便，重復性好，適合自動化和半自動化分析等特點，已廣泛應用于遺傳圖譜構(gòu)建、數(shù)量性狀基因定位、標記輔助選擇、親子鑒定及生物多樣性研究。二、實驗材料DNA溶液樣品。三、溶液與緩沖液TaqDNA聚合酶dNTPs10×PCR緩沖液上游和下游微衛(wèi)星引物25mmol/LMgCl230%丙烯酰胺凝膠液：29g丙烯酰胺＋N，N’亞甲基雙丙烯酰胺1g加水至100mL，37℃溶解，置于棕色瓶中保存。酚藍電泳加樣緩沖液：0.25％溴酞藍0.25％二甲苯青青FF40％(W/V)蔗糖水溶液10×TBE緩沖液：900mmol/LTris900mmol/L硼酸100mmol/LEDTA注意：pH值調(diào)至8.0后高壓滅菌；用時可稀釋為0.5×或1×1BE緩沖液。10％過硫酸胺(APS)TEMED(N，N,N’，N’-四甲基乙二胺)DNAMarker：pBR322／MSP。銀染溶液：固定液：10％乙醇；氧化液：1％硝酸；染色液：0.1％AgN03；顯色液：2％Na2C03，即無水碳酸鈉6g，硫代硫酸鈉0.3mg，溶于300mL純水中，用時加入37％甲醛0.4mL；終止液：4％醋酸四、儀器設備及耗材PCR儀，小型高速離心機，電泳儀，垂直電泳槽，脫色搖床，膠梳子，微波爐，電子天平，凝膠成像儀，離心管架，吸頭盒，10μL微量注射器，2μL、10μL、100μL移液器，10μL、200μL吸頭，0.2mL離心管，膠帶紙等。五、實驗方法1．微衛(wèi)星擴增體系的制備組成如下：10×PCR緩沖液2.5mmol/LdNTP25mmol/LMg++微衛(wèi)星上游引物(10pmol/μL)微衛(wèi)星下游引物(10pmol/μL)DNA(50ng/μL)0.5U/μLTaqDNA聚合酶H2O合計1.20μ0.75μ1.50μ1.00μ1.00μL2.00μL1.00μ3.55μ12.00μ將以上溶液放在冰上，按以上順序?qū)⒁陨先芤阂来渭尤氲揭粋€滅過菌的0.2mLPCR管中，終體積為12μL。2．擴增程序微衛(wèi)星擴增的程序：95℃預變性2.0min，35個循環(huán)（94℃變性30s后，60℃退火30s，72℃延伸45s），72℃延長10min。注意：退火溫度不是固定的，可根據(jù)引物堿基的長度和組成而改變。3．聚丙烯酰胺凝辟的制備、電泳與染色（1）電泳裝置的準備：將玻璃板充分洗凈，涼于后小心裝入膠框；裝在垂直電泳槽上，將螺絲擰緊，然后用1％瓊脂糖凝膠封住膠框的下邊以防漏膠。（2）聚丙烯酰胺凝膠的制作：(8％PAGE)30％丙烯酰胺5×TBE加水至10％APSTEMED合計9.5mL(避光4℃保存)6mL30mL210μ18μ30mL（3）灌膠、點樣：將膠混勻后快速到人玻璃板夾層中，插入梳子，待膠凝固后(1h以上)，拔掉梳子后用水沖洗加樣孔，然后用移液器或吸水紙吸取水分(目的是防止電泳后帶不整齊)，然后點樣。Marker為pBR322／MSP。（4）電泳：向膠槽中倒人電泳緩沖液(1×TBE)，200～300V電泳3h。（5）染色：電泳結(jié)束后，將膠轉(zhuǎn)入染缸中，先用蒸餾水沖洗一遍。（6）固定：加入10％乙醇固定10min，棄去固定液。（7）氧化：加入1％硝酸，3min，棄去氧化液。用水漂洗2次，每次10s。（8）染色：加入0.1％AgNO3，放在脫色搖床上15~30min后，將硝酸銀倒掉，用水沖洗15s。（9）顯色：用2％Na2C03顯色，待條帶清晰后將溶液倒掉，然后加入4％的乙酸溶液停止顯色?；厥找宜崛芤捍笥?。膠浸泡水中至照相。4．圖像分析用凝膠成像儀照相并根據(jù)圖像判斷微衛(wèi)星DNA的基因型。六、作業(yè)與思考題什么是微衛(wèi)星DNA？為什么微衛(wèi)星DNA擴增產(chǎn)物通常要用聚丙烯酰胺凝膠電泳？實驗五PCR-ISSR技術(shù)一、原理和用途在真核生物的基因組中廣泛存在著一類長度很短、串聯(lián)分布的簡單重復序列（simplesequencerepeats，SSR），它的基本單位是1-6個核苷酸，如（AT）n、（CTT）n、（ATGT）n等，n表示基本單位串聯(lián)重復的數(shù)目，它在同一物種的不同基因型之間是可變的，且呈現(xiàn)高度的多態(tài)性。若根據(jù)SSR兩側(cè)的保守序列設計引物，然后對串聯(lián)重復的SSR序列進行PCR擴增，不同基因型材料的擴增產(chǎn)物之間的長度差異就可以反映出它們在SSR序列拷貝數(shù)上的差異（如本章實驗四），因此SSR可作為一種分子遺傳標記加以利用。但由于SSR兩側(cè)序列具有物種特異性，造成實驗中引物設計的難度比較大。近幾年來人們又在SSR的基礎上發(fā)展出了另外一種新的稱為簡單重復序列區(qū)間（inter-simplesequencerepeats，ISSR）的分子標記技術(shù)，其基本原理是在SSR的3’端或5’端加錨1-4個簡并性核苷酸，以此加錨SSR寡聚核苷酸為引物進行PCR所獲得的擴增產(chǎn)物是兩側(cè)具有反向排列SSR的一段DNA序列，而不是SSR序列本身。ISSR在引物設計上比SSR簡單，不需知道DNA序列即可用引物進行擴增，且重復性和穩(wěn)定性比較好，現(xiàn)已廣泛應用于遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性、進化、系統(tǒng)發(fā)育等方面的研究中，其實驗方法與PCR－SSR技術(shù)類似。二、實驗材料DNA樣品溶液：預先用無菌超純水或TE（pH8.0）稀釋至20ng/μ。三、溶液與緩沖液1．TaqDNA聚合酶2．10×PCR緩沖液3．上樣緩沖液（含0.025%溴酚蘭）。4．25mmol/LMgCl2溶液5．dNTPMix（含dATP、dCTP、dTTP和dGTP各10mmol/L），6．ISSR引物（稀釋至25ng/μ）7．1×TAE緩沖液8．瓊脂糖9．溴乙錠10．滅菌超純水11．蒸餾水四、儀器設備及耗材PCR擴增儀，水平瓊脂糖凝膠電泳槽，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，膠模及梳齒，紫外透射儀，微波爐，100mL量筒，250mL三角瓶，20μ、200μ、1mL移液器各一支，10μ100μ、1000μL吸頭，0.2mLPCR管、1.5mL離心管，臺式離心機，分析天平，500mL燒杯等。五、實驗方法1．ISSR-PCR擴增（1）在每個0.2mLPCR管中分別加入下列成分：10×PCR緩沖液3.0μL25mmol/LMgCl21.8μL10mmol/LdNTP0.4μLISSR引物2.0μLTaqDNA酶1.0UDNA1.0μL超純水至30μL若DNA樣品數(shù)較多，為了消除加樣帶來的誤差和減少加樣時間，可以先將除DNA之外的其它試劑按需擴增的總管數(shù)混樣，然后平均分裝到各擴增管中，最后再加入DNA模板。（2）將擴增管中的混合液瞬間離心至管底，若PCR儀有熱蓋則不需要加礦物油，否則還需要往每管中滴加1~2滴礦物油覆蓋在樣品表面，防止樣品在擴增過程中蒸發(fā)。（3）將擴增管整齊地排列于PCR儀的樣品槽中，蓋緊蓋子，然后設置和運行PCR程序，ISSR通常的PCR反應條件為：94℃變性5min；94℃變性30s，46~56℃退火45s，72℃延伸1.5min，反應35個循環(huán)；72℃延伸7min后終止反應。退火溫度的高低依賴于所使用引物的Tm值。2．瓊脂糖凝膠的制備（1）根據(jù)樣品數(shù)的多少選擇適當大小的膠槽，將膠槽兩端密封住后水平放置，并插上梳齒。（2）按制備1.5%凝膠濃度稱取一定量的瓊脂糖，倒入一個干凈的250mL三角瓶內(nèi)，然后用量筒量取適量的TAE倒入三角瓶內(nèi)（考慮到煮膠時會蒸發(fā)部分水，可預先多倒入約5mL的蒸餾水），搖勻。（3）在微波爐內(nèi)煮膠至沸騰，取出后小心地搖勻，再重復煮1~2次，直至對光觀察看不到有透明的懸浮物方可達到要求。（4）待膠液冷卻至50~60℃左右時加入濃度為10mg/mL的溴乙錠溶液（4~5μL/100mL膠液），充分搖勻，注意搖動過程中要防止產(chǎn)生大量的氣泡；（5）靜置片刻后，將膠液倒入預先準備好的膠模中，若在倒膠過程中出現(xiàn)氣泡，可用一根注射針頭小心地將氣泡趕除。（6）待凝膠自然冷卻至完全凝固后即可開始準備電泳。3．ISSR擴增產(chǎn)物的電泳分離（1）給每個擴增管中加入5μL上樣緩沖液，混合均勻。（2）在水平電泳槽中倒入一定體積的1×TAE緩沖液，將膠槽兩端的封堵物撤去后連同凝膠浸入電泳槽內(nèi)的TAE緩沖液中，小心拔下梳齒。（3）上樣：用移液器從每個擴增管中吸取15～20μL擴增產(chǎn)物，小心地逐個加到凝膠的上樣孔中。（4）接通電源進行電泳，電壓為3～4V/cm，待溴酚蘭指示帶移動至距凝膠底端2/5位置時，停止電泳。（5）將凝膠從膠模中取出，放置在凝膠成像儀上觀察、照相。4．試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與處理ISSR主要為顯性標記，表現(xiàn)為每一個基因型材料的PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠的同一位置上擴增帶的有或無，有帶則計為1，無帶計為0，并記入表4－1中；利用統(tǒng)計分析軟件（Statistics）對數(shù)據(jù)進行分析整理，計算出各不同基因型個體之間的遺傳系數(shù)，并畫出聚類分析樹狀圖。表4-1ISSR試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計表ISSR引物編號：樣品編號擴增帶位置及擴增結(jié)果12345678910111213六、作業(yè)與思考題1．試比較ISSR和SSR、RAPD有什么異同點？2．影響ISSR分析結(jié)果準確性的主要因素有哪些？實驗六RT-PCR技術(shù)一、原理和用途RT-PCR也叫反轉(zhuǎn)錄PCR。它是將mRNA首先反轉(zhuǎn)錄為第一條cDNA，再經(jīng)特異的基因引物進行PCR擴增，以達到所需要量的目的。這種技術(shù)已廣泛應用于cDNA文庫的構(gòu)建，基因克隆及基因表達方面的研究等。二、實驗材料總RNA或mRNA溶液。三、溶液與緩沖液Oligo(dT)15RNasinRNA酶抑制劑10反轉(zhuǎn)錄緩沖液反轉(zhuǎn)錄酶：AMVReverseTranscriptaseTaqDNA聚合酶特定基因上游引物與下游引物25mmol/LMgCl2DEPC-H2O(0.1%)四、儀器設備及耗材PCR儀，小型高速離心機，干燥培養(yǎng)恒溫器，恒溫水浴箱，旋渦