分光光度技術(shù)

分光光度技術(shù)一．概念分光光度法〔Spectrophotograph譜來鑒別物質(zhì)或測定其含量的一項技術(shù)。長的光的吸取力量不同，因此，每種物質(zhì)都具有其特異的吸取光譜。200－1000nm紫外光區(qū)：200－400nm可見光區(qū)：400－760nm760－1000nm二．根本原理譜及其強度，對不同物質(zhì)進展定性和定量分析。吸取程度與溶液濃度及溶液厚度之間的關(guān)系。定律：當(dāng)單色光通過一吸取光的介質(zhì)時，其光強度隨吸取光介質(zhì)的厚度增加而成指數(shù)削減，即I/I=e－K1L00I：入射光強度， I：出射光強度，L：介質(zhì)的厚度自然對數(shù)的底，即2.718 K1:溶液的吸光率0ln〔I0/I〕=K1l換算成常用對數(shù)式，即log〔I0/I〕=0.4343·K1lK=0.4343·K1Kl也就是說：在溶液濃度不變時，溶液對光的吸取隨溶液厚度的增大而增大。比爾〔Beer〕定律：單色光通過一光吸取介質(zhì)時，光強度隨介質(zhì)濃度增長而成指數(shù)削減，即C：溶液濃度log〔I0/I〕=KC

I/I=e－K2L0也就是說：溶液厚度不變時，溶液對光的吸取隨溶液濃度的增大而增大。Lambert－Beer定律log〔I0/I〕=KClA=KClA為吸光度，T為透光度K〔L·mol－1·cm－1〕標(biāo)準(zhǔn)管法〔標(biāo)準(zhǔn)比較法〕用一濃度的測定物按測定管同樣處理顯色，讀出吸光度，在依據(jù)公式計算。A1=K1C1L1 A2=K2C2L2A1:濃度標(biāo)準(zhǔn)管 A2:未知濃度測定管A1/A2＝〔K1C1L1〕/〔K2C2L2〕A1/A2＝〔K1C1〕/〔K2C2〕K值一樣，即：K1＝K2所以上式可改寫為A1/A2＝C1/C2試驗中，由于比色皿本身和溶劑也會產(chǎn)生肯定的光吸取，所以設(shè)置一個空白管，消退非待測物的吸取，所測值即為待測物的光吸取。標(biāo)準(zhǔn)曲線法讀取各管吸光度三．儀器的構(gòu)造定義：對某一波長的光吸取值〔吸光度〕進展測定的儀器稱為分光光度計?！踩ǘ巍撤止夤舛扔?。構(gòu)造組成①光源：要求能供給所需波長范圍的連續(xù)光譜，穩(wěn)定而有足夠的強度。360－1000nm，用于可見光區(qū)，近紫外光區(qū)和近紅外光區(qū)氫燈或氘燈：工作范圍150－400nm，可作紫外光分光光度計的光源②分光系統(tǒng)〔單色器為色散元件，將不同波長的光分開③吸取池〔比色皿、比色池330nm④檢測器：光電池、光電管、光電倍增管組成儀器長附有自動記錄器，可自動描出記錄曲線。蛋白質(zhì)化學(xué)試驗一．雙縮脲測定蛋白含量1.原理：蛋白分子中含有很多肽鍵，與雙縮脲構(gòu)造類似，在堿性溶液中與Cu2＋520nm波長下有2.方法：承受標(biāo)準(zhǔn)曲線法①標(biāo)準(zhǔn)曲線制作6雙縮脲法操作步驟表試劑〔mL〕管號123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0.10.30.50.70.9－生理鹽水0.90.70.50.30.11.0雙縮脲試劑4.04.04.04.04.04.0520nm6坐標(biāo)，繪成曲線。0.9mL，4mL，37℃520nm100mL二．考馬斯亮蘭法測定蛋白質(zhì)含量過范德華力結(jié)合，染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色由紅色變成藍色，最大吸取峰從595nm1優(yōu)點：靈敏度高，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達1μg；測定速度快、簡便，只需一種試劑；干擾物質(zhì)少。方法：承受標(biāo)準(zhǔn)管法3考馬斯亮蘭法測定蛋白質(zhì)表試劑〔mL〕空白管標(biāo)準(zhǔn)管標(biāo)本管生理鹽水樣品0.10.10.1考馬斯亮蘭試劑5.05.05.0度值。③計算標(biāo)本/OD標(biāo)準(zhǔn)〕×50＝樣品中蛋白質(zhì)的含量μg/mL三．紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量280nm差。一般核酸在280nm260nm，因此溶液中同時存在核酸時，必需同時測定OD

OD

，通過計算消退核酸對蛋白質(zhì)的影響算出蛋白質(zhì)的含量。

260

280280nm280nm吸光度值是最常用的紫外吸取法。方法：承受標(biāo)準(zhǔn)曲線法1mg/mL。紫外吸取法標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟表試劑〔mL〕管號123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0.51.01.52.02.50生理鹽水3.53.02.52.01.54.0混勻，盛