分子克隆常用工具酶

關(guān)于分子克隆常用工具酶植物基因工程

每一單鏈具有5’-3’極性兩條單鏈間以氫鍵連接兩條單鏈，極性相反，反向平行以中心為軸，向右盤旋StructureandfeaturesDNA的基本結(jié)構(gòu)第2頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程第3頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程Replication第4頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程分子克隆操作過程：

克隆目的基因→將目的基因與載體用限制性內(nèi)切酶切割和連接，制成重組DNA→導(dǎo)入宿主細(xì)胞→篩選、鑒定→擴(kuò)增和表達(dá)。第5頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程工具酶是指能用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、反轉(zhuǎn)錄等有關(guān)的各種酶系統(tǒng)稱為工具酶。要把不同基因的DNA線形分子片段準(zhǔn)確地切出來，需要各種限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）；要把不同片段連接起來，需要DNA連接酶（ligase）；要合成基因或其中的一個片段，需要DNA聚合酶（polymerase）等。因此，酶是DNA重組技術(shù)中必不可少的工具。第6頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程核酸水解酶類核酸合成酶類核酸修飾酶類核酸內(nèi)切酶核酸外切酶DNA聚合酶RNA聚合酶DNA連接酶磷酸酶核苷酸激酶核苷酸轉(zhuǎn)移酶甲基化酶第7頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶用于核酸操作的常用工具酶第8頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程工具酶名稱

主要功能限制性內(nèi)切核酸酶Restrictionendonucleases在DNA分子內(nèi)部的特異性的堿基序列內(nèi)部進(jìn)行切割DNA連接酶DNAligase將兩條以上的線性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯鍵連接成一個整體DNA聚合酶IDNApolymeraseI通過向3‘端逐一增加核苷酸以填補(bǔ)雙鏈DNA分子上的單鏈裂口，即5’→3‘DNA聚合酶活性與3'→5'及5'→3'-外切酶活性多核苷酸激酶DNApolymerasekinease催化將把一個磷酸分子加到多核苷酸鏈的5'-OH末端上反轉(zhuǎn)錄酶Reversetranscriptase以RNA分子為模板合成互補(bǔ)的cDNA鏈DNA末端轉(zhuǎn)移酶DNAterminaltransferase將同聚物尾巴加到線性雙鏈或單鏈DNA分子的3'-OH末端或DNA的3'-末端標(biāo)記dNTP降解酶S1nucleaseS1降解單鏈DNA或RNA，產(chǎn)生帶5'磷酸的單核苷酸或寡聚核苷酸，同時也可切割雙鏈核酸分子的單鏈TaqDNA聚合酶TaqDNApolymerase能在高溫（72℃）下的單鏈DNA為模板，從5'→3'方向合成新生的互補(bǔ)鏈常用的工具酶性質(zhì)及功能第9頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程第一節(jié)分子克隆最常用兩個工具酶“分子剪刀”

⒈限制性核酸內(nèi)切酶——在DNA上核苷酸的特定連接處以特定的方式把DNA雙鏈切開。如EcoRI,HpaI“分子膠”⒉DNA連接酶——促使具有互補(bǔ)粘性末端或平頭末端的載體和供體DNA片段連接，形成重組DNA分子。第10頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程限制性內(nèi)切酶

Restrictionenzymes“分子剪刀”

⒈限制性核酸內(nèi)切酶——在DNA上核苷酸的特定連接處以特定的方式把DNA雙鏈切開。如EcoRI,HpaI第11頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程限制性內(nèi)切酶是一種能識別DNA上特定堿基組成的序列并在這些序列位點(diǎn)上切斷DNA分子水解磷酸二酯鍵的一種內(nèi)切核酸酶。第12頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程一、限制性核酸內(nèi)切酶的分類第13頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程二、限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則

名屬種株序菌株來源稱名名名號EcoRⅠEcoRⅠEscherichiacoliR

HindⅢHindⅢHaemophilusinfluenzaed

HindⅡHindⅡHaemophilusinfluenzaed

HpaⅠHpa/ⅠHaemophilusparainfluenzaea

HindⅢ代表從流感噬血桿菌(Haemophilusinfluenzae)d株中分離到的第3個限制酶。第14頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程

一般分子量為60kd，單鏈多肽，最適pH為6～8 NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巰基有保護(hù)作用 對熱不穩(wěn)定，通常貯存于–20℃環(huán)境。為避免反復(fù)凍溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用時添加相應(yīng)的緩沖液稀釋，降低反應(yīng)液中甘油的濃度。三、限制性核酸內(nèi)切酶學(xué)特性第15頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程每一種酶都有各自特異識別位點(diǎn)它對底物要求有特異的序列，通常的識別序列是4bp～6bp，有些則為7bp～8bp，甚或多于8bp。多數(shù)限制酶的識別序列為回文結(jié)構(gòu)，在識別序列內(nèi)或其附近水解DNA鏈中的磷酸二酯鍵。第16頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程第17頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程第18頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程不同限制性內(nèi)切酶切割的三種結(jié)果第19頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程第20頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程第21頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程5`---GGATCC---3`3`---CCTAGG---5`5`---GGATCC---3`3`---CCTAGG---5`5`---AGATCT---3`3`---TCTAGA---5`5`---AGATCT---3`3`---TCTAGA---5`BglIIBamHⅠ同尾酶第22頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程第23頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程①溫度：一般37℃ ②鹽離子濃度：Na＋，Mg2＋ ③緩沖體系：具有穩(wěn)定pH環(huán)境的Tris-HCl緩沖體系DTT用于保持酶

穩(wěn)定性和活性 ④反應(yīng)體積和甘油濃度：商品化的限制性內(nèi)切核酸酶均加50％甘油作為保護(hù)劑，一般在-20℃保存。酶切反應(yīng)時，加酶的體積一般不超過總反應(yīng)的10％，否則甘油濃度過高，影響酶切反應(yīng)⑤反應(yīng)時間：通常為1h；進(jìn)行大量DNA酶切反應(yīng)時一般讓酶解過夜⑥D(zhuǎn)NA純度和結(jié)構(gòu)DNA樣品中所含的蛋白質(zhì)、有機(jī)溶劑、RNA等雜質(zhì)會影響酶切反應(yīng)的速度和完全程度酶切的底物一般為雙鏈DNA，DNA的甲基化位置會影響酶切反應(yīng)。四、影響酶切反應(yīng)的條件*第24頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)體系第25頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程“星”活性Staractivity

“星”活性：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端ppH值等，會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性所謂的現(xiàn)象。

在名稱右上角加一個星號(*)表示,如EcoRⅠ*：AATT；EcoRⅠ：GAATTC必須采用規(guī)范的實(shí)驗(yàn)步驟,應(yīng)用推薦的反應(yīng)條件。 第26頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程位點(diǎn)偏愛（sitepreference）某些限制性內(nèi)切酶對不同位置的同一個識別序列表現(xiàn)出不同的切割效率。第27頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程第二節(jié)DNA連接酶DNALigase第28頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程定義：催化DNA上裂口兩側(cè)(相鄰)核苷酸裸露的3＇羥基和5＇磷酸之間形成共價結(jié)合的磷酸二酯鍵，使斷開的DNA裂口連接起來功能：具有修復(fù)單鏈或雙鏈的能力,在DNA重組、復(fù)制和損傷后的修復(fù)中都起關(guān)鍵作用。一、DNA連接酶性質(zhì)第29頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程第30頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程T4DNAligaseE.coliDNAligase來源T4噬菌體大腸桿菌分子量6000075000輔助因子ATPNAD+底物雙鏈DNA分子的粘、平端RNA-DNA雜合體，RNA鏈缺口、雙鏈DNA分子中的單鏈缺口同源互補(bǔ)粘端雙鏈分子中的單鏈缺口應(yīng)用范圍廣泛、效率高窄兩種DNA連接酶比較二、常用連接酶第31頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程連接反應(yīng)的溫度是影響轉(zhuǎn)化效率的最重要參數(shù)。多數(shù)內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘性末端的Tm值在15℃以下，然而保持連接酶活性的最佳反應(yīng)溫度卻是37℃ 但在該溫度下，粘性末端之間的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的，因此最適溫度是粘性末端的Tm值和連接酶最適溫度的折衷，所以連接反應(yīng)一般采用16℃過夜。三、DNA連接酶的反應(yīng)條件第32頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程DNA濃度：外源片段濃度比載體DNA濃度高5-10倍由于平末端的連接效率比粘性末端要低得多，故在平末端連接反應(yīng)中，T4DNA連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要求較高。防止環(huán)化：堿性磷酸酶預(yù)先處理質(zhì)粒載體時間：過夜最好第33頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程1）粘性末端DNA片段的連接第34頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程直接用T4DNA連接酶連接：效率不高，較少采用。同聚物加尾連接平末端DNA片段：先用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，給平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA連接酶進(jìn)行連接用銜接物連接平末端DNA分子：目的是在平末端分子上構(gòu)建限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，經(jīng)酶切后產(chǎn)生特異的粘性末端，從而與具有互補(bǔ)末端的DNA連接2)平末端DNA片段的連接第35頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程應(yīng)用互補(bǔ)同聚物加尾法連接DNA片段第36頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程用銜接物分子連接平末端的DNA片段銜接物：指用化學(xué)方法合成的一段由若干個核苷酸組成的、具有一個或數(shù)個限制酶識別位點(diǎn)的寡核苷酸片段第37頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程四、重組DNA實(shí)驗(yàn)的一般程序選用一種對載體DNA只具唯一限制識別位點(diǎn)的限制酶（如EcoRI）作位點(diǎn)特異的切割，形成全長的具粘性末端的線性DNA分子再將外源DNA片段也用同一種酶作相同的消化?；旌希尤隓NA連接酶。由于具有相同的（如EcoRI）粘性末端，能退火形成雙鏈結(jié)合體。其中單鏈缺口經(jīng)DNA連接酶封閉之后，便產(chǎn)生穩(wěn)定的雜種DNA分子。第38頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程第二節(jié)其他分子克隆工具酶第39頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程一、DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶IK1enow片段T4DNA聚合酶TaqDNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶：依賴于RNA的DNA聚合酶RNA聚合酶依賴于DNA的DNA聚合酶第40頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程用途：DNA缺口平移中標(biāo)記DNA探針大腸桿菌DNA聚合酶I

以一條DNA為模板通過聚合作用把脫氧核苷酸加到雙鏈DNA分子的3’-OH端而合成新的DNA.第41頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程基本用途第42頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程

大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(Klenowfragment)

大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理,獲得N端三分之二的大肽段,即Klenow酶。Klenow酶仍擁有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性。第43頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程第44頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程第45頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3’的DNA聚合酶活性。在無dNTP時，可以從任何3’-OH端外切

T4DNA聚合酶(T4phageDNApolymerase)第46頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程基本用途第47頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程第48頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程TaqDNA聚合酶是從棲熱水生菌(Thermusaquaticus)中分離純化的依賴DNA的DNA聚合酶，最適溫度75℃-80℃需要Mg2+(10mmol／L)，在低濃度Mn2+(2mmol/L)中有低活性，Ca2+使其完全失活，一價陽離子高至0.1moI／L對活性無影響，而最適濃度NaCl為40mmol/L，KCl為60mmol/L最適pH7.8(Tris-HCl)，與大腸桿菌DNA聚合酶相比，其最大特性是耐高溫和無核酸酶活性TaqDNA聚合酶第49頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程催化RNA體外合成反應(yīng)依賴DNA的RNA聚合酶不依賴DNA的RNA聚合酶

RNA聚合酶第50頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)

反轉(zhuǎn)錄酶具有5′→3′的DNA聚合酶活性，以RNA為模板聚合cDNA鏈,同時又具有3′

→5′和5′

→3′的RNA外切核酸酶活性。AMV和MLV。主要用途：轉(zhuǎn)錄mRNA成為cDNA制備基因片段第51頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈第52頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程DNA和RNA的修飾酶核酸酶SI堿性磷酸酶磷酸激酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶甲基化酶第53頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程1）單鏈核酸酶SI功能：

降解ssDNA或ssRNA形成5’-磷酸末端的單或寡核苷酸片段。第54頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程應(yīng)用：分析DNA：RNA雜交體結(jié)構(gòu)（S1mapping）。確定內(nèi)含子部位。切除DNA片段上的單鏈末端，形成平末端.

切開cDNA合成過程中形成的發(fā)夾環(huán)在限制酶位點(diǎn)上產(chǎn)生小缺失第55頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程第56頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程Rnase

和

DNaseRNase-FreeDNase是一種DNaseI（核酸內(nèi)切酶），可以降解雙鏈或單鏈DNA。RNaseH：特異性地水解雜交到DNA鏈上的RNA磷酸二酯鍵，故能分解RNA/DNA雜交體系中的RNA鏈。該酶不能消化單鏈或雙鏈DNA。RNaseA：廣泛應(yīng)用的核酸內(nèi)切酶。對RNA有水解作用，但對DNA則不起作用。Rnase酶非常穩(wěn)定，常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能使RNase完全失活。DEPC處理。第57頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程堿性磷酸酶

功能：催化去除DNA、RNA上的5’端磷酸基團(tuán),從DNA片段上除去5’磷酸以防自身連接。用途：在DNA連接之前常用它處理克隆載體以防止載體自身連接。第58頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程CalfIntestinalAlkalinePhosphatase(CIAP)第59頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程磷酸激酶T4-多核苷酸磷酸激酶第60頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程第61頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶

功能：在一定條件下，催化將一個一個的脫氧核苷酸，沿著5’到3’加到DNA鏈的3’-OH末端。該過程不需要DNA模板，對雙鏈、單鏈DNA都適用。經(jīng)常用于人工粘性末端的構(gòu)建。末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(TDT)第62頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程甲基化酶

原核生物甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護(hù)宿主DNA不被相應(yīng)的限制酶所切割。Dam甲基化酶可在GAmTC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。受其影響的酶有BccllII、MbbooII等。Dcm甲基化酶識別CCmAGG或CCmTGG序列，在第二個胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。受其影響的酶有EccooRIIII等第63頁,共72頁，2024年2月25日，星期天基因工程中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段DNA聚合酶I大片段具有完整DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性，而無53

外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基第64頁,共72頁，2024年2月25日，星期天植物基因工程思考題：載體構(gòu)建的工具酶主要有那些類型？限制性核酸內(nèi)切酶、同裂酶、同尾酶、宿主的限制與修飾。核酸內(nèi)切酶命名原則、操作注意事項(xiàng)及產(chǎn)生星活性的原因、影響其酶活性的因素。T4DNA連接酶的性質(zhì)及用途.Klenow酶的基本性質(zhì)及用途。其他工具酶的用途。第65頁,共72頁，2024年2月25日，星期天練習(xí)題第66頁,共72頁，2024年2月25日，星期天1.一種DNA分子經(jīng)三種限制酶完全酶切后得如下結(jié)果：

EcoRI5kbEcoRI/HindIII1、2、3、4kb

HindIII3kb、7kbEcoRI/PstI2、3、5kb

PstI10kbHindIII/PstI1、3、6kb

將各限制酶位點(diǎn)繪制在DNA分子上。

2.

另一DNA分子經(jīng)相同處理后得如下結(jié)果，將各限制酶位點(diǎn)標(biāo)在DNA分子上。

EcoRI1、3、6kbEcoRI/HindIII1、3kb

HindIII4、6kbEcoRI/PstI1、3、5kb

PstI2、8kbHindIII/PstI2、6kb

3.下圖中的一段DNA分子上有兩個限制酶PstI和EcoRI識別位點(diǎn)，兩位點(diǎn)相距10bp，現(xiàn)有一研究生要分析EcoRI右側(cè)500bp區(qū)域內(nèi)的功能，他需要在這一區(qū)域內(nèi)獲得各種缺失突變體以確定某功能區(qū)，他應(yīng)如何設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)？假定EcoRI—PstI間的10bp除去后并不影響任何結(jié)果分析，但PstI位點(diǎn)左側(cè)的DNA不能除去

第67頁,共72頁，2024年2月25日，星期天10bp500bp

PstIEcoRI4.假如PstI位點(diǎn)為另一限制酶HindIII，實(shí)驗(yàn)又該如何設(shè)計(jì)？

5.現(xiàn)有一研究者打算將一EcoRIDNA片段克隆到一個DNA分子的BamHI位點(diǎn)以便DNA擴(kuò)增，但擴(kuò)增后的DNA分子又可用BamHI限制酶將插入的片段回收，如何設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)。

6.一研究生要將一質(zhì)粒（pI）上的BamHI-HindIII片段取代另一質(zhì)粒（pII）上的BamHI-XbaI片段，所獲重組質(zhì)粒（pIII）上的插入片段要求能用BamHI-HindIII進(jìn)行回收，問如何設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)？10bp500bp

HindIIIEcoRI第68頁,共72頁，2024年2月25日，星期天

HXbH5kbpI1kb6kbpII.5kb6kbpIII1kb

BBB7.現(xiàn)有一重組質(zhì)粒的限制酶譜和克隆到的基因轉(zhuǎn)錄方向入圖所示：已知HindIII克隆片段中的BamHI（3kb）片段含有一完整的基因編碼區(qū)，現(xiàn)要將此3kb的BamHI片段克隆到另一表達(dá)載體pB的BamHI