動物細胞工程制藥研究現(xiàn)狀和展望

第第10頁動物細胞工程制藥爭論現(xiàn)狀和展望：當前動物細胞工程所涉及的主要技術(shù)領(lǐng)域包括細胞融合技術(shù)、細胞器特別是細胞核移植技術(shù)、染色體改造技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動植物技術(shù)和細胞大量培育技術(shù)等方面[1].本文綜合論述了動物細胞工程制藥的進展簡史,爭論近況和制造實例,并在此根底上探討了動物細胞工程制藥的將來進展趨勢和前景.:動物細胞工程制藥;細胞融合;細胞大規(guī)模培育;核移植21世紀,生物技術(shù)制藥是制藥行業(yè)的亮點,近25年來,世界生物技術(shù)工業(yè)飛速進展,制造了35種重要的治療性生物技術(shù)藥物.中國生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)是緊跟世界產(chǎn)業(yè)同步進展的.2023年全球生物技術(shù)藥物市場銷售額已到達828億美元.基因工程、細胞工程和酶工程組成三駕馬車行駛在現(xiàn)代生物技術(shù)進展大道的前列.動物細胞工程在生物制藥的爭論和應(yīng)用中起關(guān)鍵作用,目前全世界生物技術(shù)藥物中使用動物細胞工程生產(chǎn)的已超過80%,例如蛋白質(zhì)、單克隆抗體、疫苗等.所以對動物細胞工程制藥的爭論具有重要意義.一、進展簡史開頭疫苗是動物細胞技術(shù)的開頭,在疫苗產(chǎn)業(yè)早期,往往利用動物來生產(chǎn)疫苗,如用家兔人工感染狂犬病毒生產(chǎn)狂犬疫苗,用奶牛來生產(chǎn)天花疫苗,用某些細菌接種到動物身上來生產(chǎn)抵抗該種細菌的疫苗.在1920年至1950年,已經(jīng)開發(fā)了多種病毒或細菌疫苗,如傷寒疫苗、肺結(jié)核疫苗、破傷風疫苗、1950年月,已經(jīng)能夠利用動物細胞培育技術(shù)來生產(chǎn)病毒.先在反響器中大規(guī)模培育動物細胞,待細胞長到肯定密度后,接種病毒,病毒利用培育的細胞進展復(fù)制,從而生產(chǎn)大量的病毒,這一突破是動物細胞技術(shù)或細胞工程的真正開頭.基于動物細胞技術(shù)生產(chǎn)的病包括減毒的活病毒,或是滅活的病毒.在過去的30多年時間內(nèi),用動物細胞技術(shù)生產(chǎn)的疫苗挽救了幾百萬人和動物的生命.1950年至1985年期間,細胞工程及其他技術(shù)的進步,生產(chǎn)了多種人用疫苗來預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、腮腺炎、風疹、乙肝和帶狀皰疹等,并用于生產(chǎn)多種獸用疫苗[2].但是,這段時期對細胞表達水平的爭論仍舊很低,因而用這種工藝生產(chǎn)蛋白制品產(chǎn)量低、本錢高,因此早期的動物細胞技術(shù)只用于疫苗及少量的干擾素和尿激酶的生產(chǎn).進展1970年月的兩項劃時代的科學覺察基因重組技術(shù)和雜交瘤技術(shù)大大促進了動物細胞技術(shù)的進步以及在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用,使得動物細胞大規(guī)模培育技術(shù)在生產(chǎn)疫苗,尤其在生產(chǎn)自然的用于診斷和治療疾病的生物制品中具有舉足輕重的作用.動物細胞技術(shù)還用于生產(chǎn)很多診斷和治療疾病的單克隆抗體.用于生化檢測的單抗有幾千種,而單抗用于人體疾病治療是近幾年來生物制藥的一個重要領(lǐng)域,有幾十種單抗藥物正處于臨床試驗中.從1986年FDA批準第一種單抗治療藥物用于器官移植治療、可以抑制排斥反響的抗CD3單克隆OK-T39FDA外,很多將病毒的抗原打算簇基因轉(zhuǎn)染到宿主細胞體內(nèi),用于生產(chǎn)安全性更高、療效更好的基因工程疫苗也正在開發(fā)之中.二、爭論現(xiàn)狀動物細胞工程制藥主要涉及細胞融合技術(shù)、細胞器移植尤其是核移植技術(shù)、染色體改造技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)和細胞大規(guī)模培育技術(shù)等.細胞融合是用自然或人工的方法使兩個或幾個不同細胞融合為一個細胞的過程.可用于產(chǎn)生的物種或品系及產(chǎn)生單克隆抗體等.在我國目前動物細胞工程的進展中,技術(shù)最成熟的當數(shù)細胞融合.其中淋巴細胞雜交瘤在國內(nèi)已普遍開展,并培育了很多具有很高有用價值的雜交瘤細胞株系,它們能分泌產(chǎn)生在診斷和治療病癥方面發(fā)揮重要作用的單克隆抗體.如甲肝病毒單克隆抗體[3]、抗人IgM單克隆抗體[4]、腫瘤疫苗[5]等可用于治療疾病;抗人結(jié)腸癌雜交瘤細胞系分泌的單克隆抗體[6],巨噬細胞集落刺激因子受體)胞外區(qū)的單克隆抗體等[7]則對診斷疾病具有重要價值.由于技術(shù)已趨成熟,目前很多單克隆抗體已經(jīng)進入產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)階段.細胞核移植細胞核移植就是將一個動物的細胞核,移植到卵細胞中,并發(fā)育生長.核移植技術(shù)可用于具有良好進展前景的生物反響器的制備.其中乳腺生物反響器的研制是最為看好的一個轉(zhuǎn)基因制藥方向.利用轉(zhuǎn)基因動物乳腺作為生物反響器,生產(chǎn)基因工程人類蛋白質(zhì)藥物[8],其本錢較微生物發(fā)酵、動物細胞培育生產(chǎn)基因工程藥物大大降低.但十幾年來,顯微注射技術(shù)始終是生產(chǎn)乳腺生物反響器的唯一有用手段,由于它本身固有的缺點,使得乳腺生物反響器未能有長足的步.基因打靶與核移植相結(jié)合很可能成為生產(chǎn)乳腺生物反響器更有效的途徑,它在外源基因定點整合、消退位點效應(yīng)、降低生產(chǎn)本錢、節(jié)約時間方面具有明顯的優(yōu)勢.核移植技術(shù)在我國特別是培育魚類品種方面已有多年的爭論根底.目前我國在哺乳動物細胞核移植方面的爭論也開展得很好,除了傳統(tǒng)的胚胎細胞核移植外[9],體細胞克隆也在牛、山羊、小鼠等物種上均獲得了成功.如2023年6月,西北農(nóng)林科技大學先后培育出了世界上第一只成年體細胞克隆山羊“元元“和其次只成年體細胞克隆山羊“陽陽“[10].另外,在利用轉(zhuǎn)基因動物作為生物反響器生產(chǎn)基因工程藥物方面,上海人類遺傳病爭論所、中國農(nóng)業(yè)大學、中國科學院發(fā)育所、揚州大學、疆畜牧科學院、軍事醫(yī)學科學院和軍需大學等都先后獲得了可能有潛在生產(chǎn)人用藥物蛋白價值的轉(zhuǎn)基因動物.轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因動物是指經(jīng)人的有意干預(yù),通過試驗手段將外源基因?qū)雱游锛毎胁⒎€(wěn)定地整合到動物基因組中,且能遺傳給子代的動物.讓動物成為制藥工廠、制造人類急需的生物制品,這始終是人們夢寐以求的.轉(zhuǎn)基因動物的消滅使得這一夢想正逐步成為現(xiàn)實.在21世紀制藥工業(yè)中,最具迷人前景的無疑是應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因藥物.轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物與以往的制藥技術(shù)相比,具有不行比較的優(yōu)越性.哺乳動物生物反響器好比在動物身上建藥廠.動物的乳汁或者血液可以源源不斷地為我們供給目的基因的產(chǎn)品.它的優(yōu)越性還有穩(wěn)定的生物活性.另外,作為生物反響器的轉(zhuǎn)基因動物又可無限生殖,故具有投資本錢低、藥物開發(fā)周期短和經(jīng)濟效益高等優(yōu)點.可以說轉(zhuǎn)基因動物的問世,為利用基因工程手段獲得低本錢、高活性和高表達的藥物開拓了一條重要途徑.作為生物反響器的轉(zhuǎn)基因動物,主要是利用其乳腺組織和血液組織進展定位表達,特別是用乳腺組織生產(chǎn)具有生物活性的多肽藥物和具有特別養(yǎng)分意義的蛋白質(zhì),已成為一個興的轉(zhuǎn)基因制藥業(yè).至今已在以下動物的乳汁中生產(chǎn)出一些人類蛋白質(zhì)藥物:牛奶中有抗凝血酶、纖維蛋白原、人血清白蛋白、膠原蛋白、生育激素、乳缺蛋白、糖基轉(zhuǎn)移酶、蛋白C等,山羊奶中有抗凝血酶原、抗胰蛋白酶、生育激素、血清白蛋白、組織型纖維溶原激活因子、單克隆抗體,綿羊奶中有抗胰蛋白酶、凝血因子IX、纖維蛋白原、蛋白質(zhì)C,豬奶中亦有蛋白質(zhì)CIX[11].我國在這方面的爭論也很活潑,并取得了一些成果.早在2023年黃淑幀等成功制備了5IX基因)整合的轉(zhuǎn)基因羊(32120239月產(chǎn)下小羊羔,進入泌乳期,其乳汁中含有活性的人凝血因子IX蛋白,這種凝血因子是治療血友病的貴重藥物[12].而近幾年來的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物更是如雨后春筍般的涌現(xiàn)出來,如潘玲、黃俊成和黃英等,分別在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中成功地表達了人促紅細胞生成素、人胰島素原和人血清白蛋白.轉(zhuǎn)基因動物除了可在生產(chǎn)基因工程藥物方面發(fā)揮重要作用外,還可用于建立診斷和治療人類疾病的動物模型、生產(chǎn)可用于人體器官移植的動物器官等方面.863高科技展覽中展現(xiàn)的長有“人耳“的小鼠顯示了這方面的良好前景,這將有效地解決器官異體移植的生理適應(yīng)難度大的問題和大幅度地降低器官異體移植的本錢.動物細胞培育動物細胞培育是指離散的動物活細胞在體外人工條件下的生長、增殖的過程.動物細胞培育開頭于本世紀初.1962年,其規(guī)模開頭擴大,進展至今已成為生物、醫(yī)學爭論和應(yīng)用中廣泛承受的技術(shù)方法,利用動物細胞培育生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價值的酶、生長因子、疫苗和單抗等,已成為醫(yī)藥生物高技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要局部[13].利用動物細胞培育技術(shù)生產(chǎn)的生物制品已占世界生物高技術(shù)產(chǎn)品市場份額的50%[14].大量資料說明,生物技術(shù)藥物是當前藥開發(fā)的重要領(lǐng)域,生物技術(shù)制藥工業(yè)是下一個10年制藥工業(yè)的重要門類,期間將有數(shù)百種生物技術(shù)藥上市[15].動物細胞大規(guī)模培育技術(shù)是生物技術(shù)制藥中格外重要的環(huán)節(jié).目前,動物細胞大規(guī)模培育技術(shù)水平的提高主要集中在培育規(guī)模的進一步擴大、優(yōu)化細胞培育環(huán)境、轉(zhuǎn)變細胞特性、提高產(chǎn)品的產(chǎn)率與保證其質(zhì)量上[16].三、制造實例如今,利用動物細胞生產(chǎn)的生物制品已日益增多.美國自20233325下面就幾個在動物細胞工程制藥的進展史上具有重要意義的產(chǎn)品進展介紹.類淋巴細胞干擾素類淋巴細胞干擾素是由一株從Burkitt淋巴瘤的患者獵取Namalva細胞生產(chǎn)的干擾素,它含80%左右的IFN-α,20%左右的IFN-β.該干擾素首先由英國的Wellcome公司的Fante和Finter8000L1986先在英國獲準進入市場,商品名為“Wellferon“.2023Wellferon獲美國FDA批準進入美國.該干擾素獲準生產(chǎn)在動物細胞進展技術(shù)史上是一個很重要的里程碑,由于這是第一個獲準用腫瘤細胞系生產(chǎn)的人用藥品.類淋巴細胞干擾素的生產(chǎn)工藝大致如下:先將細胞逐級放大4000L8000LRPMI164010%小牛血清.培育方式主要是攪拌式批次培育,當細胞密度達1×106/ml2nmol/L48h,接著用仙臺病毒(50HAU/ml)誘生,18h后冷卻至5~10℃,收集培育液,連續(xù)離心分別細胞,對上清液進展分別純化.類淋巴細胞干擾素已被廣泛應(yīng)用于臨床治療多種病毒性疾病,如乙型肝炎、丙型肝炎,以及多種腫瘤病的治療,如毛細血管白血病、Kaposi肉瘤等.組織型纖溶酶原激活劑據(jù)不完全統(tǒng)計,各種血栓病已成為很多國家人口死亡和致殘的第一位緣由.我國患各種血栓病的患者估量在1300萬以上.對于血栓病的治療方法多種多樣,但目前主要的療法仍是溶血栓法.組織型纖溶酶原激活劑做為其次代特異性的溶栓藥1987年被FDA批準上市.它是由美國Genetich公司用CHO細胞表達的,也是第一個用動物細胞大規(guī)模培育生產(chǎn)的基因工程產(chǎn)品.尿激酶原作為其次代的又一個特異性的溶栓藥,單鏈尿型纖溶酶原激活劑-尿激酶原目前在很多國家進展臨床Ⅲ期試驗,估量不久即可上市.在國內(nèi),南京大學是用大腸桿菌表達的,而軍事科學院生物工程爭論所則是用CHO細胞表達的,目前正和天津天士力公司一起進展試驗.尿激酶原是一種堿性蛋白,具有特異的溶血栓作用,具有很好的進展前景.促紅細胞生成素促紅細胞生成素,又稱血細胞生成素、紅細胞刺激因子,是一種酸性糖蛋白,是第一個被覺察并批準應(yīng)用于臨床的造血生長因子,也是迄今為止產(chǎn)值最高的基因工程產(chǎn)品.它主要用于多種貧血,包括慢性腎衰性貧血、惡性腫瘤放療和化療引起的貧血等.由于該藥的用量很小,因此有的單位仍承受傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝.也有單位為了到達高產(chǎn)目的,承受了固定化灌流培育的生產(chǎn)工藝.凝血因子Ⅷ由先天性缺乏凝血因子Ⅷ而引起的出血稱為甲型血友病,早期治療承受輸入全血或血漿,但由于血漿內(nèi)凝血因子Ⅷ的濃度很低,因此效果不抱負.20世紀80年月以后,承受單克隆抗體親和層析,使產(chǎn)品的純度進一步提高.尤其是由于爭論成功了一系列血漿的病毒滅菌法后,使由血漿制備的“極純“產(chǎn)品,如Monoclate乙型肝炎疫苗乙型肝炎是由乙肝病毒引起的,約占全部病毒性肝炎的40%,它可以急性發(fā)病也可以形成慢性肝炎,并進而引發(fā)肝硬化、肝癌,而其中很大的一局部人是安康的病毒攜帶者,不消滅病癥,但外表抗原陽性,常常是重要的傳染源.在我國,這樣的慢性病毒攜帶者約有一億人,是對公共衛(wèi)生的一個重要威逼.至今已被批準的乙肝工程疫苗有兩種宿主細胞的,一種是酵母表達的,另一種是CHO細胞表達的.我國病毒爭論所的任貴方等在1987年就爭論成功了用CHO細胞表達的疫苗.他們用的是NBS公司生產(chǎn)的微載體籃式生物反響器連續(xù)灌注培育CHO細胞,然后以14000r/min連續(xù)離心去除細胞殘骸提取上清,再ButylSSepharoseFastFlow-SephadexG25脫鹽-DEAESepharoseFastFlow陰離子交換柱層析-Sepharose4FastFlow[17].四、展望動物細胞工程制藥是從疫苗開頭的,迄今已有悠久的歷史.動物細胞工程制藥中目前運用的主要手段有:細胞融合、核移植、轉(zhuǎn)基因動物、細胞培育等.隨著細胞工程技術(shù)爭論的不斷深入,我們必能開發(fā)出更具有安全性,有效性的技術(shù)手段.目前已研發(fā)的細胞產(chǎn)品實例主要有類淋巴細胞干擾素,組織型纖溶酶原激活劑,尿激酶原,促紅細胞生成素,凝血因子Ⅷ,乙型肝炎疫苗.隨著連續(xù)深入的爭論,更多的不同構(gòu)造的細胞產(chǎn)品將應(yīng)用于臨床.動物細胞工程不僅可大量工業(yè)生產(chǎn)自然稀有的藥物,而且其產(chǎn)品具有高效性和對疾病鮮亮的針對性.因而,動物細胞工程藥物的進展必將給制藥工業(yè)帶來一次革命性飛躍,在人類的醫(yī)療保健中發(fā)揮越來越重要的作用.作為現(xiàn)代生物技術(shù)之一的細胞工程技術(shù)在近半個世紀來突如通過細胞融合技術(shù)形成的雜交瘤細胞生產(chǎn)的單克隆抗體已廣泛用于臨床治療,并顯示出獨特的療效,獲得了很好的社會和經(jīng)濟效益.隨著細胞工程技術(shù)爭論的不斷深入,它的前景及其產(chǎn)生的影響將會日益地顯示出來.[1]李剛,劉鵬,劉誠迅等.我國細胞工程制藥的爭論現(xiàn)狀和進展前景[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學雜志.2023,8,19(4):278.[2]胡顯文,肖成祖.細胞工程在生物制藥工業(yè)中的地位[J].生物技術(shù)通訊.2023,5,12(2):118.[3]唐祖明,鄭紀山,肖中黨等.甲肝病毒單克隆抗體的研制與應(yīng)用[J].東南大學學報(自然科學版),2023,30(5):21.[4]姚彩霞,李滬霞.抗人IgM單克隆抗體的爭論-脾內(nèi)免疫建立抗人IgM單克隆抗體雜交瘤細胞株[J].微生物學免疫學進展,2023,26(1):66.劉彥君,王皓,衛(wèi)立辛等.人肝癌細胞與自體激活B淋巴細胞融合制備腫瘤疫苗[J].其次軍醫(yī)大學學報,2023,19(6