大腸桿菌的分離和培養(yǎng)

關(guān)于大腸桿菌的分離和培養(yǎng)指結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,形體微小的單細(xì)胞、多細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低等生物。

一、微生物90%以上的微生物是對(duì)人類(lèi)有利的。微生物的類(lèi)群病毒

細(xì)菌

藍(lán)細(xì)菌

放線菌

酵母

霉菌

原生動(dòng)物病毒原核生物真菌原生動(dòng)物第2頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天

細(xì)菌細(xì)胞由外向里依次有:

鞭毛和菌（纖）毛

莢膜

細(xì)胞壁

細(xì)胞膜

細(xì)胞質(zhì)

擬核區(qū)(類(lèi)核區(qū))1、細(xì)菌的構(gòu)造圖1-3細(xì)菌的結(jié)構(gòu)繁殖方式：分裂繁殖（20min分裂一次）第3頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、菌落：?jiǎn)蝹€(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，就會(huì)形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。第4頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天菌落細(xì)菌的菌落特征因種而異第5頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天碳源氮源生長(zhǎng)因子無(wú)機(jī)鹽水微生物需要的五大類(lèi)營(yíng)養(yǎng)要素物質(zhì)3、培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是人工方法配制而成的，是微生物生存的環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。第6頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天1）培養(yǎng)基的成分（a）細(xì)菌培養(yǎng)基：特殊成分：蛋白胨、酵母提取液、氯化鈉酸堿度：中性偏堿（b）霉菌培養(yǎng)基：特殊成分：無(wú)機(jī)物或添加蔗糖的豆芽汁酸堿度：中性偏酸第7頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天2）培養(yǎng)基的種類(lèi)（1）按物理性質(zhì)分:

a.固體培養(yǎng)基通常加瓊脂，作為凝固劑

（凝固劑的要求：不被微生物利用，又可使培養(yǎng)基固化，且不影響培養(yǎng)基中的其他營(yíng)養(yǎng)物被細(xì)菌吸收）作用：分離（純化）細(xì)菌、計(jì)數(shù)、保留菌種等

b.液體培養(yǎng)基不加瓊脂等凝固劑其它成分與固體培養(yǎng)基相同作用：培養(yǎng)細(xì)菌第8頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天液體培養(yǎng)基：表面生長(zhǎng)均勻混濁生長(zhǎng)沉淀生長(zhǎng)第9頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天固體培養(yǎng)基：菌落第10頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）根據(jù)化學(xué)成分分合成培養(yǎng)基——成分明確天然培養(yǎng)基——成分不明確第11頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）按培養(yǎng)基的用途分類(lèi)a．基礎(chǔ)培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）:含有一般細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖需要的基本的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。最常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是上面提及的天然培養(yǎng)基中的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。b．營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（加富培養(yǎng)基）:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如血液、血清或生長(zhǎng)因子等。用以培養(yǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求高的微生物。第12頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天c、選擇培養(yǎng)基——在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì),以抑制不需要的微生物的生長(zhǎng),促進(jìn)所需要的微生物的生長(zhǎng),如尿素固體培養(yǎng)基可以分離以尿素為氮源的微生物。d、鑒別培養(yǎng)基——在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品,用以鑒別不同種類(lèi)的微生物,如伊紅和美藍(lán),和大腸桿菌的代謝產(chǎn)物結(jié)合,使菌落呈深紫色,并帶有金屬光澤,可以用來(lái)鑒別大腸桿菌第13頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、無(wú)菌操作技術(shù)1、概念

無(wú)菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。無(wú)論是隨后將要學(xué)到的倒平板、平板劃線操作，還是平板稀釋涂布法，其操作中的每一步都需要做到“無(wú)菌”，即防止雜菌污染。只有熟練、規(guī)范地進(jìn)行無(wú)菌操作，才可能成功地培養(yǎng)微生物。第14頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、無(wú)菌技術(shù)包括：（1）對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒；（2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌；（3）為避免周?chē)⑸镂廴?，?shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行；（4）避免已滅菌處理的材料用具與周?chē)锲废嘟佑|。第15頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天

（1）消毒定義：利用化學(xué)或物理方法，殺死大部份致病微生物的過(guò)程。3、消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別

（2）滅菌的定義：

以化學(xué)或物理方法消滅所有微生物，包括所有細(xì)菌的繁殖體、芽孢、霉菌及病毒，而達(dá)到完全無(wú)菌的過(guò)程。

滅菌與消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工作中最普通也是最重要的技術(shù)。第16頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）具體無(wú)菌處理方法：

（a）消毒：1）對(duì)接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)先用紫外線

進(jìn)行物理消毒，然后用酒精

增強(qiáng)消毒效果。

2）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手使用酒精進(jìn)行消毒。3）日常生活經(jīng)常用到的是煮沸消毒法。4）對(duì)一些不耐高溫的液體，則使用巴氏消毒法。第17頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天巴氏消毒法是法國(guó)科學(xué)家巴斯德創(chuàng)建的一種食品保鮮方法，最早是為了延長(zhǎng)法國(guó)葡萄酒的保質(zhì)期。這是一種能將絕大多數(shù)的細(xì)菌殺死的低溫消毒方法。牛奶消毒也用巴氏消毒法。具體措施：牛奶在62.8攝氏度下30分鐘。

優(yōu)點(diǎn)：最大限度地保持了牛奶的品質(zhì)，顏色，味道和營(yíng)養(yǎng)。

第18頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天(b)滅菌：1）灼燒滅菌

接種環(huán)、玻璃刮刀

試管口2）高壓蒸氣滅菌：

1kg/cm2壓力、121℃、15min培養(yǎng)皿、試管、三角瓶、取樣器的頭、移液管、三角刮刀、接種環(huán)、鑷子、無(wú)菌水、培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌不會(huì)破壞培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分。第19頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、分離細(xì)菌方法1、劃線分離法（P20）（視頻）

1）灼燒接種環(huán)；

2）接種環(huán)冷卻后，蘸取帶菌培養(yǎng)物

3）在近火焰處，讓帶菌接種環(huán)在固體培養(yǎng)

基上劃線。劃線的方法很多，但無(wú)論采用那種方法，其目的都是通過(guò)劃線將樣品在平板上進(jìn)行稀釋，使之形成單個(gè)菌落。第20頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天第21頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天第22頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、涂布分離法1)稀釋菌液（10-5~10-7倍）用無(wú)菌吸管吸取1ml細(xì)菌培養(yǎng)液加入另一個(gè)盛有9ml無(wú)菌水的試管中，混合均勻，以此制成10-1倍的稀釋液。……3)涂布用無(wú)菌吸管取0.1ml稀釋度不同的菌液，加在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上。再將玻璃刮刀放在酒精燈火焰上灼燒，待刮刀冷卻后，在酒精燈旁打開(kāi)培養(yǎng)皿，將菌液涂布到整個(gè)平面上。4)培養(yǎng)

將培養(yǎng)皿倒置，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24~48h。第23頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天第24頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天第25頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.無(wú)菌技術(shù)除了用來(lái)防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來(lái)微生物污染外，還有什么目的？2.請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手答：無(wú)菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。思考第26頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、大腸桿菌的培養(yǎng)和分離1、大腸桿菌（1）特性：革蘭氏陰性、兼性厭氧的腸道桿菌（2）用途：基因工程技術(shù)中被廣泛采用的工具2、培養(yǎng)：LB液體培養(yǎng)基——擴(kuò)大培養(yǎng)

LB固體培養(yǎng)基——分離第27頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、分離培養(yǎng)基滅菌制作平板擴(kuò)大培養(yǎng)劃線分離菌種保存將LB液體和固體培養(yǎng)基及培養(yǎng)皿高壓蒸汽滅菌將滅菌后冷卻到60℃的LB固體培養(yǎng)基倒入滅菌過(guò)的培養(yǎng)皿中，制作平面培養(yǎng)基.將大腸桿菌從斜面接種到LB液體培養(yǎng)基中，然后在37℃搖床中震蕩培養(yǎng)12h。用接種環(huán)取震蕩培養(yǎng)后的菌液，并在固體培養(yǎng)基上劃線，然后將劃線后的培養(yǎng)皿倒置與37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12~24h，觀察劃線末端的菌落生長(zhǎng)情況.用接種環(huán)取單菌落，用劃線法接種于斜面上，在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，再放入4℃的冰箱中保存。第28頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天倒平板技術(shù)第29頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天微生物的恒溫培養(yǎng)微生物的恒溫培養(yǎng)第30頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天微生物的恒溫培養(yǎng)第31頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天菌種的保存接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長(zhǎng)成后置于4℃冰箱保存。第32頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60℃左右時(shí)，才能用來(lái)倒平板。你用什么辦法來(lái)估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？思考可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺(jué)錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可進(jìn)行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰？通過(guò)灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。第33頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.在倒平板的過(guò)程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？為什么？空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。第34頁(yè),共36頁(yè)，2024年2月25日，星期天問(wèn)題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

操作的第一步灼燒