亞型禽流感血凝抑制試驗(yàn)專家講座

內(nèi)容1、血凝試驗(yàn)(HA)：檢測(cè)抗原效價(jià)2、血凝抑制試驗(yàn)(HI)：檢測(cè)抗體3、注意事項(xiàng)亞型禽流感血凝抑制試驗(yàn)專家講座第1頁(yè)材料

1、90°96孔微量反應(yīng)板、單道及多道微量移液器、吸頭、加樣槽、燒杯、吸管、量杯、微量振蕩器；

2、H7亞型禽流感抗原、陰陽(yáng)性血清、稀釋液（PBS）；

亞型禽流感血凝抑制試驗(yàn)專家講座第2頁(yè)亞型禽流感血凝抑制試驗(yàn)專家講座第3頁(yè)實(shí)驗(yàn)原理1、HA原理：一些病毒或病毒血凝素能選擇性地使某種動(dòng)物地紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細(xì)胞現(xiàn)象稱為血凝（HA）,也稱直接血凝反應(yīng)（紅細(xì)胞不流淌）。病毒顆粒紅細(xì)胞亞型禽流感血凝抑制試驗(yàn)專家講座第4頁(yè)2、HI原理：當(dāng)病毒懸液中加入特異性抗體，且這種抗體量足以抑制病毒顆?；蚱溲貢r(shí)，則紅細(xì)胞表面受體就不能與病毒顆?；蜓刂苯咏佑|。這時(shí)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象就被抑制，稱為紅細(xì)胞凝集抑制（HI）反應(yīng)，也稱血凝抑制反應(yīng)。Iamlate！抗體抗原亞型禽流感血凝抑制試驗(yàn)專家講座第5頁(yè)

血凝試驗(yàn)（HA)

1、血凝板上1-12孔每孔加入25ul生理鹽水2、在第1孔內(nèi)加入25ul抗原，重復(fù)吸吹3-5次使其混勻，然后從第一孔吸收25ul加入到第二孔，又重復(fù)洗吹3.5次吸收25ul加入到第三孔，依次倍比稀釋至第11孔，最終從11孔棄去25ul3、每孔再次加入生理鹽水25ul4、每孔加入1％雞紅細(xì)胞懸液25ul5、在振蕩器上振蕩均勻后，放于室溫（20-25°C）下靜置30分鐘，或2-8℃45-60分鐘，紅細(xì)胞對(duì)照孔呈紐扣狀時(shí)判定結(jié)果。6、結(jié)果判定。將反應(yīng)板傾斜60°，觀察紅細(xì)胞有沒(méi)有淚滴狀流淌，完全凝集無(wú)淚珠狀流淌（100%）最高稀釋倍數(shù)為抗原血凝價(jià)。亞型禽流感血凝抑制試驗(yàn)專家講座第6頁(yè)1234567891011122×4×8×16×32×64×128×256×512×1024×2048×紅細(xì)胞對(duì)照生理鹽水252525252525252525252525抗原生理鹽水25252525252525252525252525252525252525252525棄2525紅細(xì)胞252525252525252525252525結(jié)果＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋+＋＋＋+＋＋＋++++++－－（紅細(xì)胞沉積在底部）抗原效價(jià)測(cè)定亞型禽流感血凝抑制試驗(yàn)專家講座第7頁(yè)抗原效價(jià)29亞型禽流感血凝抑制試驗(yàn)專家講座第8頁(yè)4個(gè)單位抗原配制比如：抗原效價(jià)最高稀釋倍數(shù)為28（1：256），則4個(gè)單位抗原為26，256÷4=1:64，即在63毫升PBS液中加入1毫升抗原即可。亞型禽流感血凝抑制試驗(yàn)專家講座第9頁(yè)血凝抑制試驗(yàn)1、在血凝板上1－12孔內(nèi)各加入25ul生理鹽水；2、在第1孔內(nèi)加入被檢血清25ul，然后倍比稀釋至第10孔，最終從第10孔中吸收25ul棄掉；3、第1－11孔內(nèi)加入4單位抗原25ul（第11孔為抗原對(duì)照第）4、振蕩混勻，放于室溫中靜置30分鐘或2-8°50分鐘；5、1-12孔每孔加入1％雞紅細(xì)胞懸液25ul（12孔為紅細(xì)胞對(duì)照）；6、振蕩，放于室溫靜置30分鐘，或2-8℃45-60分鐘；7、結(jié)果判定。以完全抑制4個(gè)單位抗原最高稀釋倍數(shù)為該血清HI效價(jià)。滴度≤23為陰性，≥24為陽(yáng)性。8、見(jiàn)下列圖亞型禽流感血凝抑制試驗(yàn)專家講座第10頁(yè)下列圖中抗體效價(jià)依次為28、20、25、28亞型禽流感血凝抑制試驗(yàn)專家講座第11頁(yè)抗體滴度：9、1、6、0、5、0、0；陽(yáng)性對(duì)照：9亞型禽流感血凝抑制試驗(yàn)專家講座第12頁(yè)下列圖中抗體效價(jià)均為陰性，紅細(xì)胞對(duì)照12孔成立（流淌），11孔抗原對(duì)照不流淌。亞型禽流感血凝抑制試驗(yàn)專家講座第13頁(yè)1%紅細(xì)胞懸液制備

采集2-3只健康成年公雞或無(wú)禽流感和新城疫等抗體健康公雞血液與等體積阿氏保護(hù)液（3.8%抗凝劑）混合，用PBS液（生理鹽水代替）洗滌3次，吸掉血漿和白細(xì)胞膜，每次以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心3-5分鐘，洗至上清液由淡黃色變?yōu)橥该魃Ｗ罱K用移液器或者刻度吸管吸收壓積紅細(xì)胞泥，用PBS配制成1%懸液，于4℃保留備用。（1份紅細(xì)胞泥+9份生理鹽水）亞型禽流感血凝抑制試驗(yàn)專家講座第14頁(yè)阿氏保護(hù)液配制：葡萄糖2.05克，檸檬酸鈉0.8克，檸檬酸（枸櫞酸）0.055克，氯化鈉0.42克，加蒸餾水至100毫升，加熱溶解后調(diào)PH值至6.1，然后高壓滅菌15分鐘，2-8°保留備用3.8%抗凝劑配制：枸櫞酸鈉3.8克，加入蒸餾水100毫升。PBS液：用臨床用生理鹽水代替。配策略。亞型禽流感血凝抑制試驗(yàn)專家講座第15頁(yè)正確操作校準(zhǔn)儀器優(yōu)質(zhì)試劑標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范充分準(zhǔn)備?。?！檢測(cè)質(zhì)量控制辦法注意亞型禽流感血凝抑制試驗(yàn)專家講座第16頁(yè)注意事項(xiàng)

1、四個(gè)單位抗原，紅細(xì)胞懸液使用過(guò)程中要輕輕搖勻；2、移液器吸頭在重復(fù)洗吹時(shí)要插入液面以下但不可過(guò)深，防止使用中速度過(guò)快產(chǎn)生過(guò)多氣泡造成移液量降低，每孔混勻完成要將吸頭內(nèi)液體排盡。亞型禽流感血凝抑制試驗(yàn)專家講座第17頁(yè)注意事項(xiàng)3、移液器使用時(shí)要用力均勻不可過(guò)力，吸頭要安裝牢靠，預(yù)防使用過(guò)程中漏氣或者掉落。吸頭盡可能使用一次性，若重復(fù)使用要清洗潔凈，最好用超聲波清洗機(jī)清洗，高壓滅菌后使用，假如發(fā)覺(jué)吸頭堵住不能吸到液體或者彎曲及時(shí)淘汰。4、移液器在滴加液體，尤其是在加抗原和紅細(xì)胞懸液時(shí)一定不要深入液面中造成交叉污染，影響濃度造成結(jié)果較大誤差，能夠嘗試懸空垂直加樣。亞型禽流感血凝抑制試驗(yàn)專家講座第18頁(yè)注意事項(xiàng)

5、4個(gè)單位抗原配置一定要準(zhǔn)確，假如配置抗原效價(jià)高，那么抗體滴度就會(huì)低，反之抗體滴度會(huì)高，普通現(xiàn)用現(xiàn)配?；貧w試驗(yàn)來(lái)判定效價(jià)測(cè)定正確是否。做法：做四排，每排1-4孔加入生理鹽水50UL，取配好四個(gè)單位抗原50UL與第一孔做倍比稀釋至最終一孔并棄掉50UL，最終每孔加入50UL紅細(xì)胞懸液，震蕩，靜置20分鐘觀察結(jié)果。假如第一和第二孔完全凝集不流淌，第三和第四孔不凝集流淌，則說(shuō)明四個(gè)單位抗原配制正確。6、紅細(xì)胞懸液在洗滌過(guò)程中一定要把白細(xì)胞膜吸收潔凈，顏色為鮮紅色，假如是暗紅色很有可能發(fā)生了溶血。假如采集紅細(xì)胞免疫過(guò)禽流感，那么能夠多洗滌幾遍。紅細(xì)胞懸液普通情況下能夠存放3天，假如要保持一周左右就要在無(wú)菌情況下存放在阿氏保護(hù)液中。

亞型禽流感血凝抑制試驗(yàn)專家講座第19頁(yè)注意事項(xiàng)

7、環(huán)境溫度一定要重視，普通要求在室溫下20-25°進(jìn)行，假如低于15°反應(yīng)結(jié)果就出現(xiàn)慢；假如高于30°結(jié)果會(huì)出現(xiàn)快；假如低于4°會(huì)發(fā)生紅細(xì)胞自凝現(xiàn)在。所以，觀察時(shí)間能夠適當(dāng)依據(jù)反應(yīng)情況縮短，所以試驗(yàn)室要裝有空調(diào)和溫度計(jì)。

8、微量反應(yīng)版假如是有機(jī)玻璃一定要清洗潔凈，孔底要透亮，無(wú)磨損毛糙無(wú)劃痕和有殘留物。不潔凈反應(yīng)板在試驗(yàn)中會(huì)出現(xiàn)自凝現(xiàn)象。使用正規(guī)廠家生產(chǎn)一次性微量板就可杜絕這種情況。

亞型禽流感血凝抑制試驗(yàn)專家講座第20頁(yè)注意事項(xiàng)9、整板無(wú)紅細(xì)胞凝集（流淌）現(xiàn)象，給人誤認(rèn)為抗體效價(jià)均為12。原因分析：1、4個(gè)單位抗原配制過(guò)低不足以凝集紅細(xì)胞；2、環(huán)境溫度過(guò)高；3、