酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第1頁(yè)試驗(yàn)九酶聯(lián)免疫吸附試

（Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第2頁(yè)試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)1.掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)原理、種類和用途。

2.學(xué)習(xí)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)雙抗體夾心法檢測(cè)乙型肝炎表面抗原（HBsAg）方法。

3.了解HBsAg陽(yáng)性意義。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第3頁(yè)試驗(yàn)原理用酶來(lái)標(biāo)識(shí)抗原或抗體免疫分析分析技術(shù)。因?yàn)槊父咝锎呋饔?，產(chǎn)生了放大作用，使得原來(lái)極其微乎其微抗原或抗體在數(shù)分鐘后就可被識(shí)別出來(lái)，這種技術(shù)被稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第4頁(yè)試驗(yàn)原理

將已知抗體（或抗原）結(jié)合在某種固相載體上，并保持其免疫活性。測(cè)定時(shí)將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體（或酶標(biāo)抗原）按不一樣時(shí)驟與固相載體表面吸附抗體（或抗原）發(fā)生反應(yīng)，用洗滌方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離物成份，然后加入底物顯色，進(jìn)行定性或定量測(cè)定。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第5頁(yè)試驗(yàn)原理ELISA基礎(chǔ)原理有三條：

（1）抗原或抗體能以物理性（疏水性）地吸附于固相載體表面，并保持其免疫學(xué)活性；（2）抗原或抗體可經(jīng)過(guò)共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；（3）酶結(jié)合物與對(duì)應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可依據(jù)加入底物顏色反應(yīng)來(lái)判定是否有免疫反應(yīng)存在，而且顏色反應(yīng)深淺是與標(biāo)本中對(duì)應(yīng)抗原或抗體量成正百分比，所以，能夠按底物顯色程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第6頁(yè)試驗(yàn)原理常見(jiàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)有間接法競(jìng)爭(zhēng)法雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第7頁(yè)ELISA-間接法此法是檢測(cè)抗體最常見(jiàn)方法。將已知抗原吸附于固相載體上，加入待測(cè)血清(抗體)與之結(jié)合，洗滌后，加酶標(biāo)抗體和底物進(jìn)行測(cè)定。其原理見(jiàn)圖。

酶標(biāo)抗體固相抗原待測(cè)抗體EEE

ELISA間接法示意圖底物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第8頁(yè)用于抗原及半抗原定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例，將特異性抗體吸附于固相載體上，加入待測(cè)抗原和一定量已知酶標(biāo)抗原，使二者競(jìng)爭(zhēng)地與固相抗體結(jié)合，經(jīng)過(guò)洗滌分離，最終結(jié)合于固相酶標(biāo)抗原與待測(cè)抗原含量呈負(fù)相關(guān)。固相抗體EEE酶標(biāo)抗原待測(cè)抗原E底物E顯色反應(yīng)（弱）固相抗體EEE酶標(biāo)抗原底物顯色反應(yīng)（強(qiáng)）EEEEEEELISA-競(jìng)爭(zhēng)法

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第9頁(yè)ELISA-雙抗體夾心法雙抗體夾心法常見(jiàn)于檢測(cè)抗原。將已知抗體吸附于固相載體，加入待測(cè)標(biāo)本(含對(duì)應(yīng)抗原)與之結(jié)合，溫育后洗滌，加入酶標(biāo)抗體及底物溶液進(jìn)行測(cè)定。酶標(biāo)抗體固相抗體待測(cè)抗原EEE

雙抗體夾心法檢測(cè)抗原酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第10頁(yè)試驗(yàn)材料1、乙型肝炎病毒表面抗原診療試劑盒定性檢測(cè)人血清或血漿中乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg。包含：HBsAg特異性抗體（一抗）已包被于酶標(biāo)板上

HBsAg陰、陽(yáng)性血清各1份、酶標(biāo)抗體（二抗）1份，顯色劑A、B各1份，終止液1份，洗滌液1份，2、待檢血清5份3、微量加樣器（10-100ul）及匹配槍頭4、廢液缸注意：有污染性。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第11頁(yè)夾心法檢測(cè)HBsAg方法

因?yàn)榭贵w1已包被在酶標(biāo)板上，故直接從加抗原開(kāi)始。1、加樣：每組2條8孔，待檢8孔，陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照各1孔。分別加75ul待測(cè)樣本和陰、陽(yáng)性對(duì)照于對(duì)應(yīng)孔內(nèi)，蓋封板膜，置37℃恒溫箱溫育60分鐘。

2、加酶標(biāo)抗體：除空白對(duì)照孔外，每孔加1滴酶標(biāo)溶液，混勻后封板，置37℃水浴箱溫育30分鐘。

3、洗滌：用洗滌液（按說(shuō)明配制）注滿各孔，靜置20秒，甩去洗滌液，重復(fù)4次，最終一次在吸水紙上拍干。

4、顯色：每孔加底物液A、B各1滴（50ul），輕拍混勻，置37℃避光顯色30分鐘，肉眼觀察。

5、終止：每孔加終止液1滴（50ul），輕拍混勻。在10分鐘內(nèi)酶標(biāo)

6、測(cè)定：用酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)450nm）測(cè)定各孔吸光度OD值。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第12頁(yè)酶：辣根過(guò)氧化物酶(HRP)底物：3,3‘,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）在辣根過(guò)氧化物酶催化下，TMB會(huì)產(chǎn)生可溶性藍(lán)色產(chǎn)物。使用2M

H2SO4終止反應(yīng)，在

450nm測(cè)定吸光度。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第13頁(yè)結(jié)果判斷

1、定性：夾心法ELSIA中，陽(yáng)性孔呈色深于陰性孔。2、P/N值≥2.1者判為HBsAg陽(yáng)性；P/N值＜2.1者判為陰性。介于中間為可疑。S：待測(cè)樣本OD值COV：cut-offvalue=NCx+0.100NCx：陰性對(duì)照OD值均值陽(yáng)性判定值=S/COV≧1.0：陽(yáng)性﹤1.0：陰性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第14頁(yè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第15頁(yè)試驗(yàn)匯報(bào)1、計(jì)算5個(gè)待測(cè)樣本S/COV，判斷結(jié)果2、本試驗(yàn)中采取酶、底物及反應(yīng)原理。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第16頁(yè)試驗(yàn)十IgG分離和純化酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第17頁(yè)試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)實(shí)踐IgG分離純化過(guò)程了解分離、純化抗體原理比較成年牛血清與新生牛血清中IgG含量（眼觀）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第18頁(yè)試驗(yàn)原理利用蛋白質(zhì)鹽析原理，分離血清中IgG:

不一樣蛋白質(zhì)在同一濃度鹽溶液中溶解度不一樣，所以，可利用不一樣濃度鹽溶液使血清中各個(gè)蛋白質(zhì)成份分別析出。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第19頁(yè)血清蛋白質(zhì)：復(fù)雜混合物。1、白蛋白、a1、a2、β球蛋白，纖維蛋白原，凝血酶原和其它凝血因子等均由肝細(xì)胞合成。2、γ球蛋白主要來(lái)自漿細(xì)胞。免疫球蛋白大多數(shù)存在于丙種球蛋白（γ-球蛋白）中。免疫球蛋白能夠分為IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五類。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第20頁(yè)普通pH7.0時(shí)，50％硫酸銨飽和度可將全部5種Ig（球蛋白）沉淀出來(lái)。33％飽和度大個(gè)別IgG可沉淀出來(lái)。意義：制備出純化IgG，可用于酶標(biāo)抗體或熒光抗體制備。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第21頁(yè)試驗(yàn)器材1．動(dòng)物抗血清：成年牛血清、新生牛血清2．硫酸銨飽和溶液、0.01mol/LPBS3．冰箱、離心機(jī)、電磁攪拌器、天平、尼龍繩等。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第22頁(yè)試驗(yàn)步驟1.取xml血清（2ml），加等量0.01mol/LPBS稀釋，攪拌下逐滴加入飽和(NH4)2SO4溶液2Xml（4ml），邊加邊攪拌，4℃靜置30分鐘以上，使其充分沉淀。2.離心：3000～4000r/min離心20min，棄上清。3.以0.01mol/LPBS溶解沉淀至Xml（5ml），再逐滴加入飽和(NH4)2SO4X/2ml（2.5ml)。置4℃，30～60分鐘。4.再離心：3000r～4000r/min離心20min，棄上清。5.重復(fù)上述第3、4步驟1－2次，可得到