pcr基因擴(kuò)增專業(yè)知識(shí)講座

pcr基因擴(kuò)增專業(yè)知識(shí)講座pcr基因擴(kuò)增專業(yè)知識(shí)講座第1頁試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)經(jīng)過本試驗(yàn)學(xué)習(xí)PCR反應(yīng)基礎(chǔ)原理與試驗(yàn)技術(shù)。pcr基因擴(kuò)增專業(yè)知識(shí)講座第2頁試驗(yàn)原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)，是一個(gè)在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列方法，故又稱為基因體外擴(kuò)增法。在待擴(kuò)增DNA片斷兩側(cè)和與其兩側(cè)互補(bǔ)兩個(gè)寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，DNA擴(kuò)增2n倍。pcr基因擴(kuò)增專業(yè)知識(shí)講座第3頁P(yáng)CR技術(shù)原理1.變性：在加熱或堿性條件下可使DNA雙螺旋氫鍵斷裂，形成單鏈DNA，稱之為變性。2.退火：是模板與引物復(fù)性。引物是與模板某區(qū)序列互補(bǔ)一小段DNA片段。3.延伸：從結(jié)合在特定DNA模板上引物為出發(fā)點(diǎn)，將四種脫氧核苷酸以堿基配對(duì)形式按5’→3’方向沿著模板次序合成新DNA鏈。pcr基因擴(kuò)增專業(yè)知識(shí)講座第4頁(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA擴(kuò)增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互補(bǔ)鏈引物1互補(bǔ)鏈單位長(zhǎng)度鏈不一樣長(zhǎng)度鏈5’3’3’5’引物1互補(bǔ)鏈引物2互補(bǔ)鏈目標(biāo)片段（不一樣長(zhǎng)度鏈未示出）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖(e)(f)(g)pcr基因擴(kuò)增專業(yè)知識(shí)講座第5頁pcr基因擴(kuò)增專業(yè)知識(shí)講座第6頁pcr基因擴(kuò)增專業(yè)知識(shí)講座第7頁pcr基因擴(kuò)增專業(yè)知識(shí)講座第8頁pcr基因擴(kuò)增專業(yè)知識(shí)講座第9頁pcr基因擴(kuò)增專業(yè)知識(shí)講座第10頁溫度（℃）時(shí)間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應(yīng)溫度循環(huán)周期PCR反應(yīng)每一個(gè)溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個(gè)步驟完成。圖中設(shè)定反應(yīng)參數(shù)是94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量滿足試驗(yàn)需求為止。pcr基因擴(kuò)增專業(yè)知識(shí)講座第11頁普通PCR反應(yīng)條件pcr基因擴(kuò)增專業(yè)知識(shí)講座第12頁試驗(yàn)儀器電泳儀pcr基因擴(kuò)增專業(yè)知識(shí)講座第13頁瓊脂糖凝膠電泳槽pcr基因擴(kuò)增專業(yè)知識(shí)講座第14頁P(yáng)CR儀pcr基因擴(kuò)增專業(yè)知識(shí)講座第15頁凝膠成像系統(tǒng)pcr基因擴(kuò)增專業(yè)知識(shí)講座第16頁移液器pcr基因擴(kuò)增專業(yè)知識(shí)講座第17頁試驗(yàn)材料1、DNA模板2、4種dNTP3、引物1、引物24、Taq酶5、瓊脂糖6、DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物7、吸頭、50ulPCR管pcr基因擴(kuò)增專業(yè)知識(shí)講座第18頁試劑10×PCR緩沖液(含Mg2＋)4×dNTP(每種1mmol)Tag酶1U/ulDNA模板引物1:5`-

GGGGAATTCATGGTGAGCAAGGGC-3`引物2:5`-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGC-3`

引物溶液濃度10pmol/ulpcr基因擴(kuò)增專業(yè)知識(shí)講座第19頁試驗(yàn)步驟1在0.5mlRCR管內(nèi)配置20ul反應(yīng)體系：

CK(ul)1#(ul)模板01引物10.40.4引物20.40.410×PCRBuffer22Taq酶0.50.5dNTPs0.40.4ddH2O14.315.3Total2020pcr基因擴(kuò)增專業(yè)知識(shí)講座第20頁P(yáng)CR反應(yīng)程序(1)94℃變性5min，(2)94℃變性1min，

(3)52℃退火1min，

(4)72℃延伸1min。(5)重復(fù)(2)-(4)30次（6）72℃延伸1min。pcr基因擴(kuò)增專業(yè)知識(shí)講座第21頁試驗(yàn)匯報(bào)要求：1、寫出本試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)、原理；2、試驗(yàn)器材及試驗(yàn)步驟；3、列出試驗(yàn)結(jié)果示意圖并