高考生物二輪復(fù)習(xí)PCR技術(shù)之引物設(shè)計

PCR技術(shù)之引物設(shè)計新教材新高考高三二輪復(fù)習(xí)

早期的干擾素是從人體白細(xì)胞中通過純化技術(shù)提取的，不僅量少，且含有很多雜質(zhì)，導(dǎo)致作用有限。1978年，瑞士羅氏公司的科學(xué)家帕斯特卡(Pestka)成功克隆了干擾素cDNA，為后來干擾素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。1990年，基因重組技術(shù)正式應(yīng)用于干擾素的工業(yè)化生產(chǎn)，于是今天所說的“普通干擾素”開始批量生產(chǎn)。如何通過基因工程生產(chǎn)人干擾素？1）獲取人干擾素目的基因2）構(gòu)建表達(dá)載體3）將人干擾素基因?qū)胧荏w細(xì)胞4）人干擾素基因的檢測與鑒定1.請說出PCR技術(shù)的原理、條件、基本過程？2.引物是什么？在復(fù)性過程中引物結(jié)合到基因的哪一端？3.PCR為什么需要引物？4.如何設(shè)計引物來特異性擴(kuò)增人干擾素基因？5.如何在干擾素基因兩端添加限制酶識別序列？DNA聚合酶只能催化單個核苷酸加到已有核苷酸片段3′端的羥基上任務(wù)一：擴(kuò)增干擾素基因4.如何設(shè)計引物，特異性擴(kuò)增干擾素基因？干擾素基因【例1】通過PCR方法獲取干擾素基因時，TaqDNA聚合酶只能從_____________延伸DNA鏈，而不能從頭合成DNA，需要先根據(jù)_________________________

_____設(shè)計兩種特異性引物序列。擴(kuò)增干擾素基因所需2種引物的序列為（寫出引物的前6個堿基）

。引物的3′端

目的基因(干擾素基因)兩端堿基序列提示：引物與3

′端DNA鏈結(jié)合，

與5

′端DNA鏈序列相同5′--CCTAGA--3′3′--TTGAAA--5′5′-CCTAGA-3′；5′-AAAGTT-3′（3）若下表所列為已知的DNA序列和設(shè)計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是_______?！纠?】[2020·江蘇·33]如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側(cè)的未知序列，具體流程如下圖（以EcoRI酶切為例）：3’5’3’5’②④提示：由待擴(kuò)增區(qū)段倒推所需引物5.如何在干擾素基因兩端添加限制酶識別序列？---加在引物5

′端5.如何在干擾素基因兩端添加限制酶識別序列？【例3】為使目的基因與載體正確連接，

在設(shè)計PCR引物時可添加限制酶

______________的識別序列。已知干擾素基因左端①處的堿基序列為-CCTAGAT-，則其中一種引物設(shè)計的序列是

5

3’。XhoⅠ和MunⅠ-CTCGAGCCTAGAT---XhoⅠ-CCTAGAT----加在引物5

′端3

′端提示：1.引物5′端加哪種限制酶2.基因左端引物與哪條鏈結(jié)合載體目的基因自連片段間的連接正向連接反向連接1.怎樣設(shè)計引物檢測干擾素基因是否正向連接？---同時擴(kuò)增載體和目的基因【例4】[2023·山東·25]科研人員構(gòu)建了可表達(dá)J-V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進(jìn)行了檢測，該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示，其中V5編碼序列表達(dá)標(biāo)簽短肽V5。（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒后，為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進(jìn)行PCR檢測，若僅用一對引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物___________________。已知J基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的_________（填“a鏈”或“b鏈”）相應(yīng)部分的序列相同。F1和R2

或F2和R1

a鏈

3

′端提示：引物位置只代表延伸方向解題關(guān)鍵：判斷模板鏈方向。任務(wù)二：檢測干擾素重組載體

檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入的干擾素基因在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)效率很低，且不易體外保存，如何生產(chǎn)大量表達(dá)、易保存、可口服的人干擾素呢？

資料一：不同生物對密碼子具有不同的偏好。同樣編碼甲硫氨酸，原核生物偏好的GUG，真核生物偏好的AUG；

資料二：科學(xué)家對比人白細(xì)胞表達(dá)的天然干擾素結(jié)構(gòu)圖和失活人工干擾素結(jié)構(gòu)圖，推測將干擾素第17位的半胱氨酸替換成絲氨酸，可使干擾素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，且不影響功能；

資料三：提出將人干擾素基因和CTB蛋白基因融合作為目的基因，便可利用CTB蛋白能防止外源蛋白在小腸黏膜處被消化分解的特性實現(xiàn)人干擾素口服制劑的生產(chǎn)；

1.如何誘導(dǎo)干擾素基因在特定位點突變？2.如何在干擾素基因的一端引入突變位點？3.如何在干擾素基因的內(nèi)部引入突變位點？4.如何通過PCR技術(shù)，構(gòu)建融合基因？5.如何修飾引物確保表達(dá)出正確的干擾素氨基酸序列？【例5】[2021·天津·16](1)獲得轉(zhuǎn)基因釀酒酵母菌株的過程如下設(shè)計引物擴(kuò)增乳酸脫氫酶編碼序列。為使擴(kuò)增出的序列中編碼起始密碼子的序列由原核生物偏好的GTG轉(zhuǎn)變?yōu)檎婧松锲玫腁TG,且能通過雙酶切以正確方向插人質(zhì)粒,需設(shè)計引物1和2。其中引物1的5'端序列應(yīng)考慮：

和

。包含BamH的識別序列

2.如何誘導(dǎo)干擾素基因的兩端位點突變？將GTG改為ATG【例6】PCR技術(shù)不僅可以擴(kuò)增目的基因，還可用于定點誘變目的基因等。大引物PCR就是一種定點突變技術(shù)。大引物PCR需要用到引物進(jìn)行兩次PCR，其操作步驟如圖∶

在第一次PCR反應(yīng)中，形成圖示雙鏈DNA至少要經(jīng)過_____次復(fù)制。第一次PCR產(chǎn)物DNA的_____條鏈作為第二次PCR所用的引物。與X射線誘變相比，該突變技術(shù)的優(yōu)點是____________________________________。1目的性強(qiáng)、突變概率高Ca2(3)利用微生物進(jìn)一步克隆PCR定點誘變產(chǎn)物作為目的基因，將獲取目的基因和質(zhì)粒進(jìn)行連接后，需先用_____處理農(nóng)桿菌以便將基因表達(dá)載體導(dǎo)入馬鈴薯細(xì)胞，將馬鈴薯細(xì)胞培養(yǎng)成幼苗時經(jīng)過的兩個過程是_____。【答案】(1)3耐高溫的DNA聚合酶(2)(3)目的基因與載體結(jié)合

將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞

+

脫分化和再分化23.如何誘導(dǎo)干擾素基因的中間位點突變？---①大引物PCR思考：第一次PCR與第二次PCR的復(fù)性溫度比較3.如何誘導(dǎo)干擾素基因的中間位點突變？---②重疊延伸PCR【例7】重疊延伸PCR需要用到引物進(jìn)行4次PCR，其操作步驟如圖。圖中所示的4次PCR如何選擇引物？請?zhí)顚懸韵卤砀瘢ㄈ暨x用該引物劃“√”，若不選用該引物則劃“×”）。

引物A引物B引物C引物DPCR1

PCR2

PCR3

PCR4

√√√√√√××××××××××abcd4.如何通過PCR技術(shù)，構(gòu)建融合基因？3’3’5’5’---②重疊延伸PCR【例8】[2022·山東·25]PCR擴(kuò)增得到的P基因經(jīng)酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個融合基因，如圖甲所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導(dǎo)入細(xì)胞后，融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同。據(jù)圖甲分析，出現(xiàn)該問題的原因是______。修改擴(kuò)增P基因時使用的帶有EcoRⅠ識別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是______5.如何修飾引物確保表達(dá)出正確的干擾素氨基酸序列？1.P基因編碼鏈的第一個堿基與EcoRI識別序列的最后兩個堿基編碼一個氨基酸，導(dǎo)致mRNA的密碼子被錯位讀取

2.在引物中的EcoRI識別序列3'端添加1個堿基提示：其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導(dǎo)入細(xì)胞后，融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同，出現(xiàn)該問題的原因是：P基因編碼鏈的第一個堿基與EcoRI識別序列的最后兩個堿基編碼一個氨基酸，導(dǎo)致mRNA的密碼子被錯位讀取

在引物中的EcoRI識別序列3'端添加1個堿基修改擴(kuò)增P基因時使用的帶有EcoRⅠ識別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是:PCR應(yīng)用引物設(shè)計要點總結(jié)1.擴(kuò)增目的基因干擾素基因正向連接的重組載體融合基因A+B???????根據(jù)目的基因兩端堿基序列設(shè)計引物①引物與目的基因3

′端鏈結(jié)合，與5

′端序列相同2.改造目的基因加限制酶識別序列定點突變防止移碼突變???????歸納總結(jié)②-P,-OH；啟動子；模板鏈；編碼鏈；起始密碼子等1.[2019·江蘇·33]圖1是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程示意圖，載體質(zhì)粒P0具有四環(huán)素抗性基因（tetr)和氨芐青霉素抗性基因（ampr）。請回答下列問題：

（4）為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計引物進(jìn)行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時應(yīng)選擇的一對引物是__________。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400bp片段，原因是________________________。目的基因反向連接乙、丙乙正向連接

反向連接2.PCR技術(shù)的發(fā)明可以說是生物學(xué)的分水嶺，該技術(shù)對于目的基因的定點誘變也是非常重要的，目的基因的不同位置突變需求往往可以采用不同的策略。結(jié)合所學(xué)知識回答以下問題:（1）若突變堿基位于目的基因某一側(cè)，可以采用如圖1所示的大引物PCR技術(shù)，在圖1獲取突變基因過程中，需要以下3種引物:引物A:5'-CCCCAACCGGAAAGTGTCA-3'(下劃線字母為突變堿基)引物B:5'-TAAGCTTCGAACATCCTA-3'(下劃線部分為限制酶HindⅢ識別序列)引物C:5'-GTGAGCTCGCTGCCCCAA-3'(下劃線部分為限制酶SacI識別序列)則PCR1中使用的引物有

，PCR2中使用的引物有

和圖中大引物的

(選填①或②)鏈。引物A和引物C引物B②(2)若突變堿基位于目的基因中央時，可以采用如圖2所示的PCR技術(shù)，圖2中4次PCR對引物的使用不完全相同，如PCR1選擇引物A和B，PCR2選擇引物C和D，請問PCR3和PCR4應(yīng)分別如何選擇引物，____________________________