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NYT1103中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1103.3—2006轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品食用安全檢測(cè)抗?fàn)I養(yǎng)素第3部分：硫代葡萄糖苷的測(cè)定SafetyassessmentofgeneticallymodifiedplantandderivedproductsPart3:assayofanti-nutrientsglycosinolate2006-07-10公布2006-10-01實(shí)施中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公布

NY/T1103.3—2006前言本標(biāo)準(zhǔn)附錄A為資料性附錄，附錄B為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全治理標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所、中國疾病預(yù)防操縱中心營養(yǎng)與食品安全所、農(nóng)業(yè)部科技進(jìn)展中心、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、天津市衛(wèi)生防病中心。本標(biāo)準(zhǔn)首次公布。

NY/T1103.3—2006轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品食用安全檢測(cè)抗?fàn)I養(yǎng)素第3部分：硫代葡萄糖苷的測(cè)定范疇本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了轉(zhuǎn)基因油菜籽及其產(chǎn)品中硫代葡萄糖苷的高效液相色譜測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于轉(zhuǎn)基因油菜籽及其產(chǎn)品中硫代葡萄糖苷的高效液相色譜測(cè)定。規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓舞按照本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB5491糧食、油料檢驗(yàn)扦樣、分樣法GB/T14488.1油料種籽含油量測(cè)定法GB/T14489.1油料水分及揮發(fā)物含量測(cè)定法術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1轉(zhuǎn)基因油菜籽geneticallymodifiedrapeseed指利用基因工程技術(shù)改變基因組構(gòu)成，用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)或者農(nóng)產(chǎn)品加工的油菜籽。3.2轉(zhuǎn)基因油菜籽產(chǎn)品productsderivedfromgeneticallymodifiedrapeseed指轉(zhuǎn)基因油菜籽的直截了當(dāng)加工產(chǎn)品和含有轉(zhuǎn)基因油菜籽的產(chǎn)品。3.3相對(duì)校正系數(shù)responsefactors待測(cè)硫代葡萄糖苷的摩爾吸光系數(shù)與內(nèi)標(biāo)的摩爾吸光系數(shù)的相對(duì)比值。原理NY/T1103.3—2006用70%甲醇水溶液提取硫代葡萄糖苷，然后在陰離子交換樹脂上純化，并酶解脫去硫酸根，反相色譜柱分離，紫外檢測(cè)器檢測(cè)硫代葡萄糖苷。試驗(yàn)材料轉(zhuǎn)基因油菜籽及其產(chǎn)品、受體油菜籽及其產(chǎn)品。如果對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜籽產(chǎn)品中的硫代葡萄糖苷進(jìn)行測(cè)定，轉(zhuǎn)基因油菜籽產(chǎn)品和受體油菜籽產(chǎn)品的處理?xiàng)l件應(yīng)相同。上述材料的水分含量和種植環(huán)境應(yīng)差不多一致。試劑除非另有講明，僅使用分析純?cè)噭凰疄檎麴s水。6.1硫酸酯酶溶液：HelixpomatiaH1型（EC3.1.6.1），每毫升硫酸酯酶溶液的活性單位不低于0.5，硫酸酯酶溶液應(yīng)即配即用。6.2葡聚糖凝膠懸浮液：稱取10gDEAESephadexA25葡聚糖凝膠，浸泡在過量的2mol/L醋酸溶液中，靜置沉淀，再加入2mol/L醋酸溶液，直到液體體積是沉淀體積的2倍，于4℃冰箱中存放，待用。6.370%甲醇溶液：取70mL甲醇，加水定容至100mL。6.40.02mol/L醋酸鈉溶液：稱取0.272g醋酸鈉（CH3COONa·3H2O），加入800mL水溶解，用醋酸調(diào)劑溶液的pH值至4.0，加水定容至1L。6.56mol/L甲酸咪唑溶液：稱取204g咪唑，溶解于113mL甲酸中，待溶液冷卻后加水定容至500mL。6.6內(nèi)標(biāo)：用丙烯基硫代葡萄糖苷（Mr=415.49）作內(nèi)標(biāo)，當(dāng)樣品中含有丙烯基硫代葡萄糖苷時(shí)，用苯甲基硫代葡萄糖苷（Mr=447.52）作內(nèi)標(biāo)。對(duì)硫代葡萄糖苷含量低于20.0mol/g的樣品，可將下述6.6.1至6.6.4中的內(nèi)標(biāo)溶液濃度降為1mmol/L至3mmol/L。內(nèi)標(biāo)溶液在4℃的冰箱中可存放三周，在-18℃條件下可儲(chǔ)存更長時(shí)刻，內(nèi)標(biāo)溶液的純度檢定見附錄A。6.6.15mmol/L丙烯基硫代葡萄糖苷溶液：稱取207.7mg丙烯基硫代葡萄糖苷溶解于80mL水中，加水定容至100mL。6.6.220mmol/L丙烯基硫代葡萄糖苷溶液：稱取831.0mg丙烯基硫代葡萄糖苷溶解于80mL水中，加水定容至100mL。6.6.35mmol/L苯甲基硫代葡萄糖苷溶液：稱取223.7mg苯甲基硫代葡萄糖苷溶解于80mL水中，加水定容至100mL。6.6.420mmol/L苯甲基硫代葡萄糖苷溶液：稱取895.0mg苯甲基硫代葡萄糖苷溶解于80mL水中，加水定容至100mL。NY/T1103.3—20066.7流淌相A：超聲波脫氣30s的水。6.8流淌相B：取200mL色譜級(jí)乙腈，加入800mL水，渾勻，超聲波脫氣30s。儀器和設(shè)備7.1通常實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備。7.2研缽或微型研磨機(jī)。7.3聚丙烯離子交換微柱：底部篩板為100目。7.50.45μm水溶性微孔濾膜。7.6色譜柱：填料顆粒小于或等于10m的反相C18或C8柱，例如：NovapakC18柱，5m（150mm×3.9mm）；LichrosorbRp18柱，5m（150mm×4.6mm）；SpherisorbC18柱，10m（150mm×4mm）；LichrospherRp8柱，5m（125mm×4mm）。7.7高效液相色譜儀：具備梯度洗脫，柱溫可操縱在30℃，帶紫外檢測(cè)器。試樣的制備按照GB5491的規(guī)定對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行縮分，將縮分后的試驗(yàn)材料分成三等份。第一份按GB/T14489.1的規(guī)定測(cè)定水分及揮發(fā)物含量，第二份按GB/T14488.1的規(guī)定測(cè)定含油量，第三份為硫代葡萄糖苷待測(cè)試樣。如果試驗(yàn)材料的水分及揮發(fā)物含量超過10%，應(yīng)在45℃條件下通風(fēng)干燥，并將干燥后的待測(cè)試樣在微型粉碎機(jī)中粉碎，過40目篩，然后趕忙連續(xù)完成9.1和9.2。操作步驟9.1稱樣分不稱取200.0mg待測(cè)試樣至A、B兩支離心管中。9.2硫代葡萄糖苷的提取9.2.1將離心管75℃水浴1min，加入2mL70％沸甲醇溶液后，趕忙加入200L5mmol/L內(nèi)標(biāo)溶液至A管中，200L20mmol/L內(nèi)標(biāo)溶液至B管中。9.2.275℃水浴10min，其間每隔2min取出離心管在旋渦混合器上旋渦混合，然后取出離心管冷卻至室溫，5000g離心3min，分不轉(zhuǎn)移上清液至10mL刻度試管A＇、B＇中。9.2.3分不向A、B管中再加入2mL70％沸甲醇溶液，75℃水浴約30s，旋渦混勻后，75℃水浴10min，其間每隔2min取出離心管旋渦混合，然后取出離心管冷卻至室溫，5000gNY/T1103.3—2006離心3min，分不轉(zhuǎn)移上清液至原刻度試管A＇、B＇中。9.2.4用水調(diào)劑A＇、B＇管中的提取液至5mL，混勻。此提取液在-18℃暗處可儲(chǔ)存2周。9.3離子交換微柱的制備每一個(gè)試樣提取液預(yù)備一支聚丙烯離子交換微柱，垂直置于試管架上。取0.5mL充分混勻的葡聚糖凝膠懸浮液至每一離子交換微柱中，注意不要使懸浮液粘附在柱壁。靜置待液體排干后，取2mL6mol/L甲酸咪唑溶液沖洗樹脂，排干后，再用1mL水沖洗樹脂兩次，每次均讓水排干。9.4純化、脫硫酸根9.4.1取1mL提取液慢慢加入已制備好的離子交換微柱中，注意不能攪動(dòng)樹脂表面，待液體排干后，分不加入1mL0.02mol/L醋酸鈉溶液兩次，每次加入后均讓液體排干。9.4.2加入100L硫酸酯酶溶液至離子交換微柱，35℃條件下反應(yīng)16h。9.4.3分不用1mL水沖洗離子交換微柱2次，洗脫液收集于試管中。9.4.4用水將洗脫液定容至5mL，充分混勻后，用0.45m的微孔濾膜過濾，待進(jìn)樣。洗脫液在-18℃暗處可存放1周。9.5空白試驗(yàn)用相同的樣品進(jìn)行相同的前處理，但不加內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，以檢定樣品中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)是否存在。9.6色譜條件9.6.1儀器條件：流淌相流速為1.0mL/min，柱溫30℃，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長229nm。9.6.2洗脫梯度9.6.2.1對(duì)SpherisorbC18柱，10m（150mm×4mm）和NovapakC18柱，5m（150mm×3.9mm），洗脫梯度見表1。表1SpherisorbC18柱和NovapakC18柱洗脫梯度時(shí)刻流淌相A（％）流淌相B（％）0min158510min100012min100015min158520min15859.6.2.2對(duì)LichrosorbRP18柱，5m（150mm×4.6mm），洗脫梯度見表2。NY/T1103.3—2006表2LichrosorbRP18柱洗脫梯度時(shí)刻流淌相A（％）流淌相B（％）0min10001min100020min010025min100030min10009.6.2.3對(duì)LichrospherRP8柱，5m（125mm×4mm），洗脫梯度見表3。表3LichrospherRP8柱洗脫梯度時(shí)刻流淌相A（％）流淌相B（％）0min10002.5min100020min010025min010027min100032min10009.7色譜測(cè)定進(jìn)樣量10L，記錄峰面積。10結(jié)果表示10.1單組分硫代葡萄糖苷含量的運(yùn)算10.1.1以每克干基脫脂油菜籽中所含硫代葡萄糖苷的微摩爾數(shù)表示，按式（1）運(yùn)算：D1=…………（1）式中：D1－干基脫脂油菜籽中硫代葡萄糖苷含量，單位為微摩爾每克（mol/g）；Ag—脫硫硫代葡萄糖苷峰面積；As—內(nèi)標(biāo)峰面積；Kg—脫硫硫代葡萄糖苷相對(duì)校正系數(shù)，見附錄B；NY/T1103.3—2006m—試樣質(zhì)量，單位為克（g）；n—試樣中加入內(nèi)標(biāo)的量，單位為微摩爾（mol）；w—試樣中水分、揮發(fā)物和含油量之和，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)表示（％）。運(yùn)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后兩位。10.1.2以每克脫脂油菜籽含標(biāo)準(zhǔn)水分及揮發(fā)物時(shí)所含硫代葡萄糖苷的微摩爾數(shù)表示，按式（2）運(yùn)算：D2=…………（2）式中：Ag、As、n、m、Kg、w同式（1）；D2－脫脂油菜籽含標(biāo)準(zhǔn)水分及揮發(fā)物時(shí)硫代葡萄糖苷的含量，單位為微摩爾每克（mol/g）；Ws—標(biāo)準(zhǔn)水分及揮發(fā)物含量，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)表示，數(shù)值為8.5％或9％。運(yùn)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后兩位。10.1.3以每克干基油菜籽中所含硫代葡萄糖苷的微摩爾數(shù)表示，按式（3）運(yùn)算：D3=………（3）式中：Ag、As、n、m、Kg同式（1）；D3－干基油菜籽中硫代葡萄糖苷含量，單位為微摩爾每克（mol/g）；Wt—試樣中水分及揮發(fā)物含量，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)表示（％）。運(yùn)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后兩位。10.1.4以每克油菜籽含標(biāo)準(zhǔn)水分及揮發(fā)物時(shí)所含硫代葡萄糖苷的微摩爾數(shù)表示，按式（4）運(yùn)算：D4=…………（4）式中：Ag、As、n、m、Kg、wt、Ws同式（1）、（2）和（3）；D4—油菜籽含標(biāo)準(zhǔn)水分及揮發(fā)物時(shí)硫代葡萄糖苷的含量，單位為微摩爾每克（mol/g）。NY/T1103.3—2006運(yùn)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后兩位。硫代葡萄糖苷含量的運(yùn)算硫代葡萄糖苷含量等于單組分硫代葡萄糖苷（單組分峰面積應(yīng)大于峰面積總和的1%）含量的總和，以每克樣品中所含硫代葡萄糖苷的微摩爾數(shù)表示。如果A、B兩管硫代葡萄糖苷含量的測(cè)定值滿足11中承諾差的要求，硫代葡萄糖苷的含量為兩測(cè)定值的算術(shù)平均值。運(yùn)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后兩位。承諾差11.1同一試樣、同一方法、同一操作者、同一儀器、同一實(shí)驗(yàn)室短期內(nèi)兩次測(cè)定值承諾差：如果硫代葡萄糖苷含量低于20.00mol/g，承諾差不大于2.00mol/g；如果硫代葡萄糖苷含量在20.00mol/g－35.00mol/g范疇內(nèi)，承諾差不大于4.00mol/g；如果硫代葡萄糖苷含量大于35.00mol/g，承諾差不大于6.00mol/g。11.2同一試樣、同一方法、不同操作者、不同儀器、不同實(shí)驗(yàn)室兩次測(cè)定值承諾差：如果硫代葡萄糖苷含量低于20.00mol/g，承諾差不大于4.00mol/g；如果硫代葡萄糖苷含量在20.00mol/g－35.00mol/g范疇內(nèi)，承諾差不大于8.00mol/g；如果硫代葡萄糖苷含量大于35.00mol/g，承諾差不大于12.00mol/g。

NY/T1103.3—2006附錄A（資料性附錄）內(nèi)標(biāo)純度的檢定A.1檢定方法內(nèi)標(biāo)純度的檢定方法要緊包括：——用本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法進(jìn)行高效液相色譜分析?！酶咝б合嗌V的離子對(duì)技術(shù)分析完整的內(nèi)標(biāo)（不脫硫酸根的內(nèi)標(biāo)）?！脷庀嗌V分析脫硫酸鹽和硅烷化的內(nèi)標(biāo)?！媒孀用福‥C3.2.3.2）水解內(nèi)標(biāo)，按照水解產(chǎn)物葡萄糖的濃度檢定內(nèi)標(biāo)的純度。A.2結(jié)果分析如果用色譜方法檢定內(nèi)標(biāo)純度，當(dāng)色譜圖中主峰面積不小于總峰面積的98％時(shí)，表明內(nèi)標(biāo)純度符合本標(biāo)準(zhǔn)要求。如果用酶水解方法檢定內(nèi)標(biāo)純度，當(dāng)水解產(chǎn)物葡萄糖的摩爾濃度不小于內(nèi)標(biāo)摩爾濃度的98％時(shí)，表明內(nèi)標(biāo)純度符合本標(biāo)準(zhǔn)要求。

NY/T1103.3—2006附錄B（規(guī)范性附錄）相對(duì)校正系數(shù)表B.1脫硫硫代葡萄糖苷的相對(duì)校正系數(shù)序號(hào)硫代葡萄糖苷名稱相對(duì)校正系數(shù)（Kg）中