大學(xué)課程：反義RNA技術(shù)

反義RNA技術(shù)反義基因技術(shù)（antisensetechnique）是19世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)，它為植物基因工程在農(nóng)業(yè)上及相關(guān)產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用開辟了廣闊的前景。反義基因技術(shù)的基本概念和原理所謂反義RNA是指有義DNA鏈轉(zhuǎn)錄成的，與特異的靶RNA互補(bǔ)結(jié)合并能抑制靶RNA表達(dá)的一段序列。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義RNA的基因稱之為反義基因（antisensegene）。所謂植物反義RNA技術(shù)是指把一段DNA序列以反義方向插入到合適的啟動(dòng)子和終止子之間，然后把此基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到植物中去（通常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法）進(jìn)行選擇培養(yǎng)以獲得轉(zhuǎn)化植株的技術(shù)。反義基因轉(zhuǎn)錄生成的mRNA可以抑制具有同源性的內(nèi)源基因的表達(dá)，用這種方法可獲得特定基因表達(dá)受阻而其他不相關(guān)基因的表達(dá)不受影響的轉(zhuǎn)基因植株。一般認(rèn)為，在原核細(xì)胞中反義RNA與靶RNA具有特異互補(bǔ)性，通過堿基配對結(jié)合的方式在復(fù)制(replicate)、轉(zhuǎn)錄(transcript)、翻譯(translation)等過程中對目的基因起著負(fù)調(diào)控作用（圖2-3），但詳細(xì)的機(jī)理還不清楚。真核生物尚未找到天然存在的反義RNA，但有一些小RNA分子可能起類似反義RNA的作用，反義RNA在真核細(xì)胞中的作用機(jī)制目前尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，不僅與靶5`端互補(bǔ)的反義RNA有抑制作用，而且與3`端互補(bǔ)的反義RNA有抑制作用，而且反義RNA在真核細(xì)胞中的抑制作用具有高度的專一性。進(jìn)一步研究認(rèn)為反義RNA或DNA與形成RNA·DNA或DNA·DNA雜交鏈,或抑制翻譯起始，或抑制RNA多聚/酶體上的翻譯，或抑制從核內(nèi)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。圖2-3反義RNA對mRNA翻譯過程的調(diào)控作用（聞偉等，1990）2．反義基因技術(shù)的特點(diǎn)經(jīng)過20多年的研究和應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，反義基因技術(shù)有許多特點(diǎn)使其能夠很好地應(yīng)用于實(shí)踐，總結(jié)起來有以下一些特點(diǎn)：（1）反義RNA可以高度專一地調(diào)節(jié)某一特定基因的表達(dá)，不影響其它基因表達(dá)。反義基因的不同區(qū)段抑制效率不同，基因的部分片段（小至41bp）就可起到抑制效果，抑制程度理論上從0%到100%，這不同于基因的完全致死抑制，因此可從轉(zhuǎn)基因個(gè)體中篩選到所需要的基因型。（2）轉(zhuǎn)化到植物中的反義RNA的作用類似于遺傳上的缺陷型，表現(xiàn)為顯形。所以被轉(zhuǎn)化的植物材料不必為純合體就可表現(xiàn)相應(yīng)的性狀，從而避免了二倍體內(nèi)等位基因的顯隱性干擾。（3）反義基因整合到植物的基因組中可獨(dú)立表達(dá)和穩(wěn)定遺傳，后代符合孟德爾遺傳規(guī)律(MendelianGeneticsRule)。用反義基因不必了解其目的基因所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，可省去對基因產(chǎn)物的研究工作。反義基因不改變目的基因的結(jié)構(gòu)，在應(yīng)用上更加安全。3．反義基因技術(shù)的應(yīng)用反義基因技術(shù)已經(jīng)是相對比較成熟的技術(shù)，利用反義基因技術(shù)人為地控制生物體內(nèi)某些基因的表達(dá)是植物基因工程中有巨大應(yīng)用前景的研究。世界上第一個(gè)基因工程商業(yè)化園藝產(chǎn)品，就是利用反義基因技術(shù)將反義PG基因轉(zhuǎn)入番茄得到的耐貯運(yùn)的番茄。具體的應(yīng)用實(shí)例可見本章4。可以說，反義基因技術(shù)為食品生物技術(shù)的發(fā)展開辟了廣闊的應(yīng)用前景。

1988年美國sheehy和英國smith分別獨(dú)立地構(gòu)建了PG反義RNA系統(tǒng)，smith1990年所獲得的轉(zhuǎn)PG反義基因番茄經(jīng)研究表明：一個(gè)反義基因的轉(zhuǎn)入可以99/100的效率抑制PG的產(chǎn)生，PG活性的降低有效的抑制了細(xì)胞壁果膠的降解，而反義RNA只專一的抑制PG活性，對番茄果實(shí)成熟的其它指標(biāo)如乙烯產(chǎn)生，轉(zhuǎn)化酶活性無影響，有效的促使番茄果實(shí)延熟，并使其在貯藏期間較少的感受真菌感染。實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)反義PG基因的番茄雖然在硬度上與對照組沒有區(qū)別，但很明顯地延長了貯藏壽命和增加了運(yùn)輸過程的抗破壞的能力。轉(zhuǎn)反義PG基因的果實(shí)用冷破粹的方法處理的番茄汁與對照組相比黏度增加，有力的提高了番茄加工的品質(zhì)。因此PG基因也被稱為黏度基因。由于乙烯是促使番茄成熟的激素，利用反義基因技術(shù)抑制生物合成的研究也已獲得突破性進(jìn)展，這種轉(zhuǎn)基因番茄能99。5/100的抑制乙烯合成，果實(shí)不能正常成熟，不出現(xiàn)呼吸高峰，室溫放置90--120天不變紅，不變軟。只有通過外源乙烯或丙烯誘導(dǎo)才能成熟，成熟的果實(shí)的品質(zhì)和正常番茄相同，這說明通過反義基因技術(shù)控制乙烯的生物合成有可能獲得耐貯的番茄品種。反義PG基因技術(shù)意義反義基因技術(shù)已經(jīng)是相對比較成熟的技術(shù)，已經(jīng)為在基因水平研究果蔬成熟衰老機(jī)制開拓了一片廣闊的領(lǐng)域，如前所述已經(jīng)在很多領(lǐng)域有了具體的應(yīng)用。而PG在果實(shí)成熟衰老中的地位也正為人們所認(rèn)識(shí)，所研究。當(dāng)然，對于PG許多方面的認(rèn)識(shí)更多的還是未知數(shù)。還需要我們做很多的工作去揭開PG神秘的面紗如PG在果實(shí)衰老過程中的作用時(shí)間：是整個(gè)過程還是在特定階段出現(xiàn)并起作用，再如PG對果實(shí)的有效最低作用量：是12/100還是0.05/100等。反義基因技術(shù)與PG的結(jié)合恰是認(rèn)識(shí)PG的一條可行的捷徑。而反義PG表達(dá)載體的構(gòu)建則是其中的關(guān)鍵步驟和中心環(huán)節(jié)。同時(shí)PG與乙烯在很多方面有相關(guān)性，對PG的深入研究也有助于進(jìn)一步理解乙烯作用的機(jī)理。

對PG受阻后基因表達(dá)載體及果實(shí)品質(zhì)改變的研究，不僅對于系統(tǒng)地，全