植物組織細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的研究進展

關(guān)于植物組織細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的研究進展背景介紹紫杉醇是紅豆杉屬植物中的一種復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物,也是目前所了解的惟一一種可以促進微管聚合和

穩(wěn)定已聚合微管的藥物。第2頁,共27頁，2024年2月25日，星期天藥理細胞接觸紫杉醇后會在細胞內(nèi)積累大量的微管，這些微管的積累干擾了細胞的各種功能,特別是使細胞分裂停止于有絲分裂期，阻斷了細胞的正常分裂。通過Ⅱ-Ⅲ臨床研究，紫杉醇主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也都有一定療效。第3頁,共27頁，2024年2月25日，星期天獲取紫杉醇的途徑化學(xué)合成紅豆杉中提取真菌發(fā)酵植物組織培養(yǎng)第4頁,共27頁，2024年2月25日，星期天化學(xué)合成1.全合成：

路線復(fù)雜，反應(yīng)條件難以控制，產(chǎn)率低，用到劇毒原料，僅限于實驗室水平2.半合成：國外專利技術(shù)壁壘，國內(nèi)生產(chǎn)附加值低第5頁,共27頁，2024年2月25日，星期天紅豆杉中直接提取資源匱乏紅豆杉生長緩慢，

樹皮剝?nèi)『蟛荒茉偕?/p>

樹木將死去紫杉醇在植物體內(nèi)含量極低，最多0.069%需多步柱分離技術(shù)，生產(chǎn)成本高第6頁,共27頁，2024年2月25日，星期天真菌發(fā)酵真菌發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇因真菌的紫杉醇含量僅有植物細胞的十萬分之一,離生產(chǎn)的距離太遠。從長遠來看,植物組織培養(yǎng)才是解決紫杉醇供需矛盾的最佳途徑。第7頁,共27頁，2024年2月25日，星期天組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)是在無菌和人為控制外因（營養(yǎng)成分、光、溫、濕）的條件下，培養(yǎng)和研究植物組織、器官，甚至進而從中分化、發(fā)育出整體植株的技術(shù)。第8頁,共27頁，2024年2月25日，星期天植物組織培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)繼代培養(yǎng)懸浮細胞培養(yǎng)紫衫細胞大量培養(yǎng)第9頁,共27頁，2024年2月25日，星期天愈傷組織培養(yǎng)選擇合適的外植體：以幼莖為佳除去病原菌和雜菌：處理外植體配置合適的培養(yǎng)基。誘導(dǎo)及培養(yǎng)：將上述小塊組織接種于MS培養(yǎng)基中，于25℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40天。PH5.8，誘導(dǎo)和分化，即可形成小的愈傷組織塊第10頁,共27頁，2024年2月25日，星期天繼代培養(yǎng)愈傷組織長出后經(jīng)過4~6周的迅速細胞分裂，原有培養(yǎng)基的水分和營養(yǎng)成分多以耗失有害代謝產(chǎn)物已在培養(yǎng)基中積累，必須移植。即是繼代愈傷組織也易分泌橙紅色色素或發(fā)生褐化，使生長速度減慢，甚至死亡（這是愈傷組織分泌的酚類物質(zhì)被氧化成醌類物質(zhì)造成的）。第11頁,共27頁，2024年2月25日，星期天*緩解褐化在培養(yǎng)基中加入還原劑或吸收酚類的物質(zhì),可以減少致死現(xiàn)象,保持愈傷組織的生長活性。如：半胱氨酸、維生素C、活性炭PS：由于吸附劑對營養(yǎng)物質(zhì)和激素的吸收,較高濃度的吸附劑會部分地抑制愈傷組織的生長第12頁,共27頁，2024年2月25日，星期天繼代懸浮懸浮培養(yǎng)步驟：第13頁,共27頁，2024年2月25日，星期天懸浮細胞培養(yǎng)只有當愈傷組織經(jīng)過長時期固體培養(yǎng),表現(xiàn)出相當?shù)纳矸€(wěn)定性后,才能進行懸浮培養(yǎng)。一般采用B5培養(yǎng)基，碳源多為蔗糖。

溫度、接種量、光照強度，pH值等的改變均能影響細胞的生長率和產(chǎn)物合成第14頁,共27頁，2024年2月25日，星期天半連續(xù)培養(yǎng)：每隔一定時間倒出一定量的懸浮液，同時補充加入等量的新鮮培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)：連續(xù)收獲細胞，同時不斷補充培養(yǎng)液加入培養(yǎng)基排出培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物第15頁,共27頁，2024年2月25日，星期天紫衫細胞大量培養(yǎng)前期利用碳水化合物的選擇加快細胞生長,使細胞量迅速增加。達到一定細胞量后,改用利于紫杉醇合成的培養(yǎng)液。通過調(diào)整合成培養(yǎng)液的組成,延長紫杉醇合成時間（靜止期）。為了提高生產(chǎn)率，需要提高活性細胞濃度，大規(guī)模地培養(yǎng)紅豆杉細胞?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展了不少大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)，同時使用固定化的細胞，原位提取等現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)方法能夠在一定程度上提高活性細胞的濃度。第16頁,共27頁，2024年2月25日，星期天提高紫杉醇產(chǎn)量的方法前體飼喂添加抑制劑添加誘導(dǎo)因子篩選細胞株系第17頁,共27頁，2024年2月25日，星期天前體飼喂一方面可通過增加底物量來加快反應(yīng)速度和提高產(chǎn)率另一方面能夠反饋抑制分支路徑而促進反應(yīng)順利進行,有效提高紫杉醇產(chǎn)量。常用：苯甲酸，苯甲酰甘氨酸第18頁,共27頁，2024年2月25日，星期天添加抑制劑添加抑制劑能夠反饋抑制分支路徑而使反應(yīng)向有利于紫杉醇合成的方向進行。發(fā)現(xiàn)合成代謝抑制劑氯化膽堿CCC可以使紫杉醇含量提高，但濃度過高卻抑制合成。第19頁,共27頁，2024年2月25日，星期天添加誘導(dǎo)子紫杉醇是一種植物防衛(wèi)素，可以被誘導(dǎo)茉莉酸甲酯----參與植物防御信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)與放大花生四烯酸----濃度為5μg/g時即可將紫杉醇含量提高9.3倍,與茉莉酸甲酯表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)協(xié)同作用。第20頁,共27頁，2024年2月25日，星期天篩選出高產(chǎn)的細胞株系

誘導(dǎo)

變異細胞克隆技術(shù)篩選目前，主要運用現(xiàn)代生物基因工程的方法來獲得高產(chǎn)細胞系紫杉醇含量高的外植體愈傷組織高產(chǎn)細胞植株第21頁,共27頁，2024年2月25日，星期天問題與前景①紅豆杉屬植物組織細胞培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)像，尚無良好的解決辦法【8】②紫杉醇本身是一種細胞生長的毒性物質(zhì),其量的積累愈多,對細胞增殖的抑制越強.,即使添加真菌誘導(dǎo)子及生物合成前體,組織細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇也難以達到產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用水平【10】,第22頁,共27頁，2024年2月25日，星期天③細胞培養(yǎng)物生長速度慢,有效物質(zhì)含量低、成本高、大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)尚未過關(guān)【9】④添加誘導(dǎo)因子，在一段時間內(nèi)可以增加紫杉醇產(chǎn)量，但隨著細胞的遺傳，會逐漸產(chǎn)生抗性，是產(chǎn)量降低，這也是無法工業(yè)化生產(chǎn)的一大原因。第23頁,共27頁，2024年2月25日，星期天⑤紫杉醇作為一種抗有絲分裂機制，在有絲分裂過程中，干擾了細胞的正常分裂，使紅豆杉細胞染色體數(shù)目極易發(fā)生變化,紅豆杉中紫杉醇的含量極不穩(wěn)定，因此穩(wěn)定的保存并篩選高產(chǎn)的紫杉醇細胞系顯得尤為重要。第24頁,共27頁，2024年2月25日，星期天⑥現(xiàn)今又有一種新的培養(yǎng)高產(chǎn)細胞系的方法,即利用秋水仙素誘導(dǎo)建立四倍體紅豆杉細胞系,實驗證明,產(chǎn)量是普通二倍體的3.85倍.[13]第25頁,共27頁，2024年2月25日，星期天參考文獻[1]鄧立新.抗癌新藥紫杉醇簡介.化學(xué)教學(xué),2006年，第1期[2]Kohler

D

R，Goldspiel

B

R.Paclitax（el

taxol）[J].Pharmacotherapy.1994，1（41）：3-34[3]王蒂.植物組織培養(yǎng).中國農(nóng)業(yè)出版社，2004年6月第一版[4]常明進，李春強，彭明.天然藥物紫杉醇的研究與開發(fā).安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),Journal

of

Anhui

Agri.Sci.2006,34(2):257-258[5]邢建民,查麗杭,李佐虎,劉大陸.植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的研究進展.植物學(xué)通報,1997,14(3):22～29[6]Fett-Neto

A.G.et

al.1994a

Biotechnol.Bioeng.44P205～210[7]胡凱,何穎,祝順琴,談鋒,唐克軒.紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的研究進展.《天然產(chǎn)物研究與開發(fā)》.Vo1.15,No.5[8]夏銘,吳絳云,張麗梅.紅豆杉組織培養(yǎng)中褐變問題的研究.生物技術(shù),1996;16(3):18-20[9]張宗勤,楊建英,吳耀武.南方紅豆杉組織培養(yǎng)及紫杉醇的產(chǎn)生.西北植物學(xué)報1998,18(4):488—492[10]JaziriM,A.zhiri,Y.W

Guo

et

al.Taxus

sp.cell,tissue

and

organ

cultures

as

alternative

sources

for

taxoids

production:

a

literature

survey.Plant

Cell

Tuiss.

Org.Cult.,1996;46:59-75[11]周忠強,梅興國.紅豆杉細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的研究進展.中南民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)Journal

of

South-Central

University

for

Nationalities(Nat.Sci.Edi