自配藥酒對酒精致雄性小鼠肝損傷的影響

自配藥酒對酒精致雄性小鼠肝損傷的影響【摘要】目的：探究自配藥酒對于市售某高度白酒和本實驗基酒灌胃所致雄性小鼠的酒精性肝損傷模型是否有肝臟保護或預(yù)防作用。方法：本實驗研究的藥酒加入了一定量的食品級矯味劑和葛根素、薯蕷皂苷元和綠原酸等具有護肝保肝功能的中藥提取物（單體）并通過超聲、渦旋儀渦旋和低溫水浴方法使單體溶解，以此自配藥酒對比市售某高度酒精和基酒建立的小鼠酒精性肝損傷模型，采取了邊造模邊給藥的實驗方法，對比自配藥酒給藥組和模型組小鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）的值、肝細(xì)胞壞死率和觀察肝組織HE染色切片等從而開展實驗。結(jié)果：在自配藥酒對酒精致雄性小鼠肝損傷影響的研究發(fā)現(xiàn)，對比空白組雄性小鼠的GOT和GPT的值，模型組的GOT和GPT值高于給藥組；在對肝組織HE染色切片的觀察發(fā)現(xiàn)，給藥組的肝細(xì)胞壞死率較低，而模型組的肝細(xì)胞壞死率較高。結(jié)論：用市售白酒與基酒成功建立兩個雄性小鼠酒精性肝損傷模型，在此研究發(fā)現(xiàn)本實驗自配藥酒與市售白酒搭配對高度酒精誘導(dǎo)雄性小鼠肝損傷有減輕作用?！娟P(guān)鍵詞】酒精性肝損傷；葛根素；薯蕷皂苷；綠原酸Effectofself-preparedmedicinalwineonliverinjuryinalcoholicrefinedmalemice[Abstract]Objective:Toinvestigatewhetherself-preparedmedicinalliquorhashepatoprotectiveorpreventiveeffectsonalcoholicliverinjurymodelsinmalemiceinducedbygavagewithcommerciallyavailablehighlevelBaijiuandthisexperimentalbaseliquor.Methods:Inthisstudy,acertainamountoffood-gradeorthodonticagentandChineseherbalextracts(monomers)withhepatoprotectiveandhepatoprotectivefunctions,suchasgeranin,diosgeninandchlorogenicacid,wereaddedtothemedicinalliquoranddissolvedbyultrasound,vortexandlow-temperaturewaterbath.Theexperimentwascarriedoutbycomparingtheserumglutamicoxalyltransaminase(GOT)andglutamicpropyltransaminase(GPT)values,livercoefficientsandhepatocytenecrosisratesofthemiceintheself-preparedmedicinalliquoradministrationgroupandthemodelgroup,andobservingtheHEstainedsectionsoflivertissues.Results:Inthestudyoftheeffectofself-preparedmedicinalliquoronliverinjuryinalcoholicexquisitemalemice,itwasfoundthatwhencomparingthevaluesofGOTandGPTintheblankgroupofmalemice,thevaluesofGOTandGPTinthemodelgroupwerehigherthanthoseinthedrug-administeredgroup;intheobservationofHE-stainedsectionsoflivertissues,itwasfoundthattherateofhepatocytenecrosiswaslowerinthedrug-administeredgroup,whiletherateofhepatocytenecrosiswashigherinthemodelgroup.Conclusion:TwomodelsofalcoholicliverinjuryinmalemiceweresuccessfullyestablishedusingmarketedBaijiuandbaseliquor.Inthisstudy,itwasfoundthatthecombinationofselfpreparedmedicinalliquorandcommercialBaijiuinthisexperimentcouldalleviateliverinjuryinmalemiceinducedbyhighlyBaijiu.[Keywords]AlcoholicliverinjuryPuerarinDiosgeninChlorogenicacid目錄TOC\o"1-3"\h\u87271前言 前言酒精性肝病是因為長期過量攝入酒精而造成的肝臟疾病。急性酒精性肝炎的肝硬化的死亡率可達(dá)到50%，晚期肝硬化患者的生存時間可低至1-2年[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織《Globalstatusreportonalcoholandhealth2018》指出我國人均的酒精消費量呈增加狀態(tài)，而戒酒率趨于下滑，鑒于全球酒精消費模式的時間趨勢，酒精性肝炎的發(fā)病率，尤其是年輕人的發(fā)病率，預(yù)計將在未來十年內(nèi)上升。2016年，酒精飲料是死亡和殘疾的第七大主要風(fēng)險，占男性死亡率的6.8%，占女性死亡率的2.2%[2]。大量研究表明，長期過量飲酒會導(dǎo)致嚴(yán)重的肝臟損傷，脂肪肝常見于大量酗酒的人群中，長期大量飲酒甚至?xí)M一步發(fā)展為肝細(xì)胞癌而造成死亡[3]。而酒精性肝病的治療大多為中醫(yī)藥方面的治療，許多中藥單體可以在酒精性肝病的不同環(huán)節(jié)產(chǎn)生藥效，可以很好地防治該病，如葛根素、薯蕷皂苷元、綠原酸等中藥活性提取物。葛根素（puerarin）有一定的解酒功效與預(yù)防醉酒效果，可以通過提高抗氧化酶的活性而達(dá)到保肝護肝的作用[4]。葛根素可降低由酒精導(dǎo)致的ALT、AST水平升高[5]，和通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）、谷胱甘肽(GSH)、血漿抗利尿激素（ADH）、丙二醛（MDA）來抑制自由基引起的脂質(zhì)過氧化并減少肝細(xì)胞損傷[6]。另外，有研究表明葛根素有抗器官纖維化的作用如心臟、肝、肺、腎、子宮[7]。而葛根素在酒精性脂肪肝方面的研究中，有實驗表明了葛根素能夠預(yù)防酒精性脂肪肝小鼠的肝臟脂質(zhì)沉積也能夠調(diào)節(jié)酒精性脂肪肝小鼠肝臟的脂質(zhì)代謝[8]。薯蕷皂苷元是一種天然的甾體皂苷元，存在于各種植物家族中，如龍舌蘭、蕷蓿、百合科、茄科和荊芥科。各種研究表明，薯蕷皂苷元對各種疾病如癌癥、心血管疾病、Ⅱ型糖尿病、神經(jīng)退行性疾病等都有治療或預(yù)防作用[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，使用薯蕷皂苷元治療LPS/D-Gal誘導(dǎo)的急性ALF可以通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)過程來減少肝損傷[10]。薯蕷皂苷元有對高脂血癥的潛力，用于抑制腸道對脂質(zhì)的吸收、促進膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸及其排泄、膽固醇轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)、抗氧化和脂蛋白沒活性、抑制內(nèi)源性脂質(zhì)生物合成以及調(diào)節(jié)與脂質(zhì)機制相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[11]。綠原酸是一種有機化合物，廣泛存在于杜仲科、忍冬科以及菊科等植物中。據(jù)研究，綠原酸有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降壓、降血糖、降血脂、改善雄性生殖問題、保肝護腰、抗菌、抗白血病、抑制肥胖等生物活性作用[12]。有研究證明了綠原酸對肝損傷的保護作用，觀察到酒精誘導(dǎo)的脂肪變性，凋亡細(xì)胞死亡和由于氧化應(yīng)激水平降低而導(dǎo)致的纖維化減少。這些發(fā)現(xiàn)表明了綠原酸可通過抑制氧化應(yīng)激來減弱酒精性肝損傷[13]。目前，酒精飲料在社會交往中的消費量日趨上升，酒精也成為了部分人群不可避免的飲料，但是酒精飲料造成的各種疾病已被大量報道[14-17]，對人體產(chǎn)生極大傷害，尤其是肝臟損害引起酒精性肝病。所以對于本課題研究查閱了大量文獻(xiàn)，篩選了以上三種保肝護肝的中藥活性提取物——葛根素、薯蕷皂苷元、綠原酸，從發(fā)病根源酒精入手，將以上三種中藥單體按合適劑量加入本實驗所制藥酒中，本實驗所自配藥酒目的是想在一定程度上有對肝臟的緩解和保護作用，本藥酒保留了與茅臺酒相似的風(fēng)味，且吳君等[18]對茅臺酒進行的回顧性流行病學(xué)研究表明，除脂肪肝外，茅臺酒的的飲用人群同纖維化、肝硬化無明顯的相關(guān)性。本藥酒希望達(dá)到與茅臺酒相似的市場歡迎程度的基礎(chǔ)上，再加入保肝護肝的中藥單體，本實驗為探究所制藥酒的效果而開展有效性實驗，發(fā)現(xiàn)并確定其對肝臟損害的緩解作用，且為拓展以上三種中藥活性單體在臨床的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

2材料與方法2.1材料2.1.1動物表2-1本實驗動物信息材料來源SPF級KM雄性小鼠廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心2.1.2試劑表2-2本實驗中使用的實驗試劑及固體信息試劑或固體制劑來源市售白酒北京紅星股份有限公司基酒廣東藥科大學(xué)藥理學(xué)教研室（提供）甘油廣東藥科大學(xué)藥理學(xué)教研室（提供）食品級矯味劑廣東藥科大學(xué)藥理學(xué)教研室（提供）GOT試劑盒南京建成生物工程研究所GPT試劑盒南京建成生物工程研究所超純水屈臣氏0.9%生理鹽水廣東藥科大學(xué)實驗室自配多聚甲醛廣東藥科大學(xué)實驗室自配綠原酸西安小草植物科技有限公司薯蕷皂苷元西安小草植物科技有限公司葛根素西安小草植物科技有限公司2.1.3儀器表2-3本實驗種所使用的儀器/耗材信息儀器/耗材型號/規(guī)格生產(chǎn)公司臺式高速冷凍離心機TD5K-Ⅱ東旺儀器超聲波清洗儀JP-030S深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司雪花制冰機柯尼塔中外合資廣州柯尼塔電器有限公司全自動酶聯(lián)檢測儀MultiskanGO賽默飛科技實驗室電熱鼓風(fēng)干燥箱GZX-9023MBE上海博訊實業(yè)有限公司電子天平SHIMADZU梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司電子顯微鏡——Nikon渦旋振蕩器MX-E美國安勝科技有限公司移液槍5-1000μlThermo灌胃針8號北京中科恒天科技有限公司96孔細(xì)胞培養(yǎng)板——FisherScientificEP管4ml、10ml、50ml廣東藥科大學(xué)藥理學(xué)教研室（提供）移液槍槍頭各種型號Servicebio2.2實驗方法2.2.1藥酒配制首先，在500ml基酒中加入若干食品級矯味劑，封口，放入超聲儀中超聲30min，再加入0.0469g綠原酸、0.1875g薯蕷皂苷元、0.1845g葛根素等中藥單體，（若遇到難溶中藥單體，先將單體加入10mlEP管中，將基酒加至10ml，用渦旋儀渦旋15min，若還未溶解，40℃水浴溶解30min）封口，超聲30min即得到本實驗所需藥酒。2.2.2動物分組及給藥隨機選擇體重在15-30g范圍內(nèi)的SPF級雄性健康昆明小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機分為空白組/K組、給藥1組（給予藥酒）/Y組、給藥2組（給予市售白酒+藥酒）/YE組、模型組1組（給予基酒）/D組、模型2組（給予市售白酒）/E組，共五組?？瞻捉M/K組10只雄鼠、給藥1組（給予藥酒)/Y組19只雄鼠、給藥2組（給予市售白酒+藥酒）/YE組18只雄鼠、模型組1組（給予基酒）/D組16只雄鼠、模型2組（給予市售白酒）/E組12只雄鼠。本研究經(jīng)廣東藥科大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（gdpulac2023163）。2.2.3造模方法除空白組每日飲用水為純凈水，灌胃純水，其余各組飲用水改為3%乙醇飲料，即配制400ml飲用水時混入12ml濃度為53%的基酒，同時灌服53%酒精飲料3ml/kg，每日兩次，間隔12h，連續(xù)至少12周。2.2.4雄性小鼠肝組織HE染色切片[19]每組來自同一肝臟部位的肝組織用10%固定甲醛溶液。肝臟組織脫水，清除，嵌入石蠟，切片并用蘇木精-伊紅（HE）染色，以及在200×在顯微鏡下放大。在光學(xué)顯微鏡下觀察各組雄性小鼠肝組織形態(tài)情況，例如觀察肝小葉結(jié)構(gòu)、纖維增生、脂肪泡的蓄積情況、炎癥細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞變性、肝細(xì)胞壞死等情況。于200×倍拍照保存分析，每組小鼠拍攝10張圖片，并用imageJ軟件計算壞死細(xì)胞數(shù)目，再用SPSS統(tǒng)計分析軟件對其分析。2.2.5肝臟系數(shù)的測定造模結(jié)束后，摘取肝臟組織，將表面水分吸干，稱取肝臟重量及小鼠的體重，肝臟系數(shù)[20]=肝臟重量（g）/體重（g）×100%。正常時肝臟重量與體重的比值恒定。動物肝臟受到損害后，受損肝臟重量可能會發(fā)生改變，故肝臟系數(shù)也隨之改變。肝臟系數(shù)增大，說明肝臟充血、水腫或者增生肥大等；肝臟系數(shù)減小，說明肝臟萎縮及其退行性改變。2.2.6血清GOT和GPT檢測[21]GOT與GPT均是反映肝臟受損的敏感指標(biāo)[19]。GOT為谷草轉(zhuǎn)氨酶，GPT為谷丙轉(zhuǎn)氨酶。長期大量飲酒后會出現(xiàn)肝細(xì)胞損傷，血清內(nèi)谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）與谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）濃度升高。因此采用GOT/GPT試劑盒檢測血清內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶酶活力值，可以直觀的探究到肝臟損傷的情況。檢測步驟按照說明書進行。2.2.7給藥期間記錄數(shù)據(jù)雄性小鼠攝食量變化：每日定時稱量小鼠攝食量，并對每一組進行對比分析，得出折線統(tǒng)計圖。雄性小鼠飲水量變化：每日定時量取小鼠飲水量，并對每一組進行對比分析，得出折現(xiàn)統(tǒng)計圖。雄性小鼠體重變化：每五日為一個周期對小鼠進行體重稱量，觀察小鼠的體重變化，并得出折現(xiàn)統(tǒng)計圖。

3實驗結(jié)果3.1小鼠一般情況及解剖整個實驗期間，若有小鼠死亡，及時補充死亡小鼠空缺并記錄死亡時間。動物實驗前10天，給藥劑量為14.4ml/kg，空白組/K組未見死亡，給藥1組/Y組死亡12只，給藥2組/YE組死亡8只，造模1組/D組死亡9只，造模2組/E組死亡10只。解剖觀察其原因發(fā)現(xiàn)，小鼠酒精攝入過量導(dǎo)致胃出血氣脹而引起死亡，于是減少給藥劑量至3ml/kg，重新開始實驗。更改給藥劑量后至動物實驗結(jié)束，空白組未見死亡；給藥1組共19只，死亡11只，存活率為42.1%；給藥2組共18只，死亡8只，存活率為55.6%；模型1組共16只，死亡9只，存活率為43.8%；模型2組共12只，死亡7只，存活率為41.6%，以上數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，給藥2組即給予藥酒和市售白酒組的小鼠存活率較高。實驗結(jié)束對小鼠進行解剖摘取肝臟，根據(jù)觀察，各組具有相似的肝臟大體觀，沒有肉眼可見明顯的肝臟組織病變，但模型組D組、E組小鼠肝臟輕微呈黃褐色（如圖3.1-1）。12周末時各組的肝/體重比率如表3.1-1，各組肝臟系數(shù)沒有特別明顯的差別，但給藥1、2組即給予藥酒和給予50%藥酒+50%市售白酒組與模型1、2組即給予基酒和市售白酒組的肝臟系數(shù)都明顯略高于空白對照組。本實驗攝入了酒精的雄性小鼠肝臟系數(shù)增大，說明攝入了酒精的雄性小鼠的肝臟均有損傷，可能出現(xiàn)肝臟的水腫、充血或增生肥大。本實驗攝入了酒精的小鼠肝臟系數(shù)均有輕微增大，說明小鼠的肝臟出現(xiàn)輕微損傷。表3.1-112周末時各組小鼠體重/肝重及肝臟指數(shù)Table3.1-1Bodyweight/liverweightandliverindexofmiceineachgroupattheendof12weeks組別數(shù)量（只）初始體重（g）最終體重（g）肝重（g）肝臟系數(shù)（%）空白組/K組824.91±1.3927.63±0.731.75±0.256.26±0.86模型1組/D組814.01±0.6224.83±0.801.70±0.106.85±0.27模型2組/E組813.38±0.4927.96±1.491.89±0.156.76±0.32給藥1組/Y組1215.09±1.4122.24±2.321.58±0.147.65±1.61給藥2組/YE組1220.65±6.5625.88±2.581.86±0.227.11±0.82圖3.1-112周末時K組、D組、E組、Y組、YE組小鼠肝臟大體觀Figure3.1-1GrossviewoftheliverofmiceingroupsK,D,E,YandYEattheendof12weeks3.2肝組織HE染色切片光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果蘇木精-伊紅染色法[22]，簡稱HE染色法（hematoxylin-eosinstaining）,是一種石蠟切片技術(shù)，蘇木精hematoxylin為堿性染液，伊紅eosin為酸性染液。蘇木精染液主要將胞質(zhì)內(nèi)的核酸和細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)染成紫藍(lán)色；伊紅染液主要將細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分染成紅色。本實驗用了此法對肝臟組織進行染色，觀察肝臟中細(xì)胞的整體情況，并對切片進行拍照計算肝細(xì)胞壞死率，判斷肝臟是否有損傷。實驗12周后，運用H&E染色對各組小鼠肝臟組織病理學(xué)觀察進行了檢測。在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白組/K組的肝細(xì)胞索以放射狀方式排列，肝小葉、血竇清晰；細(xì)胞核大且呈圓形，胞漿紅染均勻；細(xì)胞大小適中，形態(tài)正常。與空白對照組/K組雄性小鼠對比，模型組雄性小鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，有明顯的炎癥堆積，尤其模型2組/E組雄性小鼠肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)消失，胞核皺縮，炎癥堆積明顯。與模型組雄性小鼠相比，給藥組雄性小鼠肝組織形態(tài)有所改善，尤以給藥2組/YE組最為明顯，肝細(xì)胞索圍繞中央靜脈以放射狀排列，細(xì)胞核輕微皺縮，但給藥1組/Y組肝組織結(jié)構(gòu)較紊亂。如圖3.2-1所示。實驗12周后，對肝臟HE染色切片進行觀察，每組小鼠隨機選拍10張圖片并用mageJ軟件對壞死細(xì)胞進行計數(shù)，得出每張圖片肝細(xì)胞壞死率，再用SPSS統(tǒng)計分析軟件對其進行分析，得出結(jié)果，與空白組/K組對比，模型1組即基酒組和模型2組即市售白酒組的肝細(xì)胞壞死率高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），給藥組的肝細(xì)胞壞死率也顯著高于空白組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與基酒組和市售白酒組對比，給藥2組/YE組的肝細(xì)胞壞死率低于基酒組和市售白酒組，肝細(xì)胞壞死率顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。根據(jù)結(jié)果可以認(rèn)為給藥組對酒精性肝損傷有一定的減輕作用，但藥酒+市售白酒組較優(yōu)。如表3.2-1和圖3.2-2所示。圖3.2-1各組雄性小鼠肝臟組織HE染色切片圖（200×）（依次為：空白組、基酒組、市售白酒組、藥酒組、藥酒+市售白酒組）Figure3.2-1HE-stainedsectionsoflivertissueofmalemiceineachgroup(200×)（Inorder:blankgroup,basewinegroup,commerciallyavailablewhitewinegroup，medicinalwinegroup,medicinalwine+commerciallyavailablewhitewinegroup）表3.2-1肝臟HE切片中各組平均細(xì)胞壞死率Table3.2-1NecrosisrateofeachgroupofcellsinHEsectionsoftheliver平均空白組/K組模型1組/D組模型2組/E組給藥1組/Y組給藥2組/YE組正常細(xì)胞（個數(shù)）1557890138131壞死細(xì)胞（個數(shù)）6910311711287總細(xì)胞數(shù)224181207250218肝細(xì)胞壞死率（%）30.7256.89***56.68***44.90*#39.77##注：與K組比較，*P<0.05,***P<0.001；與D組和E組比較，#P<0.05,##P<0.01。圖3.2-2肝臟HE切片中各組細(xì)胞平均壞死率Figure3.2-2NecrosisrateofeachgroupofcellsinHEsectionsoftheliver3.3血清GOT和GPT檢測結(jié)果由GOT試劑盒檢測結(jié)果可知，與空白對照組對比，給藥組的血清GOT酶活力值均低于空白對照組，分別為26.045μ/L和28.099μ/L，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與空白對照組和給藥組對比，酒精干預(yù)的模型組的GOT酶活力值均高于空白對照組和給藥組，分別為50.411μ/L和55.976μ/L，均有一定程度的上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。如表3.3-1所示，圖3.3-1所示。由GPT試劑盒檢測結(jié)果可知，與空白對照組對比，給藥組的血清GPT酶活力值低于空白對照組，分別為17.988μ/L和6.27μ/L，尤其是YE組即給與藥酒+市售白酒組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與給藥1組和給藥2組相比，酒精干預(yù)的模型組血清GPT酶活力值均高于各組，分別為29.382μ/L和21.988μ/L，尤其與給藥2組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而與空白組相比，酒精干預(yù)的模型組血清GPT酶活力值無明顯變化。如表4.3-1所示，圖3.3-2所示。從整體來看，攝入了酒精的基酒組和市售白酒組的GOT和GPT酶活力值均高于空白對照組，說明酒精對雄性小鼠的肝臟組織造成了一定損傷，而使用了自配藥酒干預(yù)后，血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）酶活力值均有所下降，有的甚至比空白對照組的血清轉(zhuǎn)氨酶水平低，特別是50%藥酒+50%市售白酒組，充分說明了自配藥酒可在一定程度上緩解酒精所致的肝臟損傷。表3.3-1血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）酶活力值Table3.3-1Serumglutamicoxaloacetictransaminase(GOT)andglutamyltransaminase(GPT)enzymeactivityvalues(μ/L)K組D組E組Y組YE組GOT酶活力值43.05750.411*55.976*26.045*#28.099*#GPT酶活力值18.97329.382**21.988*17.988*#6.27*##注：與K組比較，*P<0.05；與D組和E組比較，#P<0.05。圖3.3-1各組血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）酶活力值Figure3.3-1Serumglutamicoxaloacetictransaminase(GOT)enzymeactivityvaluesforeachgroup注：與K組比較，*P<0.05,**P<0.01；與D組和E組比較，#P<0.05,##P<0.01。圖3.3-2各組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）酶活力值Figure3.3-2Serumglutathioneaminotransferase(GPT)enzymeactivityvaluesforeachgroup3.4給藥期間數(shù)據(jù)結(jié)果3.4.1雄鼠平均每日攝食量記錄每只雄鼠每日的攝食量，以每只雄鼠平均攝食量為縱坐標(biāo)，以每七天一個周期為橫坐標(biāo)，對雄鼠平均每日攝食量變化作圖（如圖3.4-1所示），結(jié)果發(fā)現(xiàn)對比空白組，其余組別攝食量均較小，排除末段可能因誤差造成的全體攝食量上升，截取后發(fā)現(xiàn)給藥組及模型組的攝食量均呈現(xiàn)下降趨勢，造成的原因可能是飲酒直接刺激胃黏膜，與其代謝中間產(chǎn)物乙醛等共同導(dǎo)致了胃黏膜損傷，對小鼠產(chǎn)生了胃腸道刺激等癥狀。圖3.4-1雄性小鼠每日攝食量變化Figure3.4-1Variationofdailyfoodintakeinmalemice3.4.2雄鼠平均每日飲水量記錄雄鼠平均每日飲水量，以雄鼠平均每日飲水量為縱坐標(biāo)，以每七天一個周期為橫坐標(biāo)，對雄鼠平均每日飲水量作圖（如圖3.4-2所示），結(jié)果發(fā)現(xiàn)對比空白組，模型組即給予基酒與市售白酒組小鼠自由飲水較空白組多，而給藥組即給予藥酒+市售白酒組和藥酒組穩(wěn)定在空白組飲水量周圍。圖3.4-2雄性小鼠飲水量變化Figure3.4-2Changesindailywaterconsumptioninmalemice3.4.3雄鼠體重變化以雄性小鼠平均體重（單位：g）為縱坐標(biāo)，以每五日一周期為橫坐標(biāo)，對雄性小鼠體重變化作折線統(tǒng)計圖（如圖3.4-3所示），結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗前期，除空白組小鼠外，其余組別小鼠體重驟降，原因是，給藥前期所使用的給藥劑量酒精濃度過高，給藥劑量過多，造成小鼠酒精性中毒，處于昏沉狀態(tài)無法正常進食，體重下降，調(diào)整劑量后，小鼠體重緩慢回升，并增長趨于平緩。但是與空白組對比，體重增長速度較為緩慢。圖3.4-3雄性小鼠體重變化Figure3.4-3Bodyweightchangesinmalemice整個實驗期間發(fā)現(xiàn)，模型組雄性小鼠即給予市售白酒及基酒的小鼠存活率較低，而給藥組雄性小鼠，尤其是給藥2組即給予藥酒+市售白酒組的小鼠存活率相對于其他組而言較高。解剖觀察發(fā)現(xiàn)死亡原因主要是小鼠酒精攝入過多導(dǎo)致胃出血氣脹及未知的肝損傷，即酒精性中毒。且本實驗攝入了酒精的小鼠肝臟系數(shù)均有小幅增大，說明酒精導(dǎo)致雄性小鼠肝臟有一定的毒性作用。而前10天，由于給酒量過大而發(fā)生攝入酒精小鼠大量死亡，可能造成了急性酒精性肝損傷。通過光學(xué)顯微鏡下觀察得出，相比于空白對照組，藥酒組、藥酒+市售白酒組、基酒組和市售白酒組，胞核均有皺縮現(xiàn)象，尤以模型組最為明顯。相比于模型組，給藥組雄性小鼠肝組織形態(tài)有所改善。對肝臟組織HE染色切片用mageJ軟件對壞死細(xì)胞進行計數(shù)得出，模型組即給予市售白酒組和基酒組的平均肝細(xì)胞壞死率較高，分別為56.89%、56.68%；用SPSS統(tǒng)計軟件對其進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)給藥2組即給予藥酒+市售白酒組的肝細(xì)胞壞死率相比與模型組較低，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。由GOT/GPT試劑盒對血清檢測結(jié)果可知，基酒組和市售白酒組的血清轉(zhuǎn)氨酶均高于空白對照組（P<0.05），而使用了自配藥酒干預(yù)的雄性小鼠，相比于模型組（基酒組與市售白酒組）轉(zhuǎn)氨酶各項指標(biāo)均有所下降（P<0.05），說明了自配藥酒可在一定程度緩解酒精所致的肝臟損傷。

4分析與討論隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，人們越來越意識到飲酒會給社會、健康和經(jīng)濟帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)，雖然適度飲酒有益于身體健康，使身心愉悅，但是長期過量飲酒會導(dǎo)致酒精性肝病。而肝臟是人體的主要代謝器官之一，酒精性肝病是因為長期大量飲酒而造成的肝臟疾病。酒精相關(guān)的肝病亞型包括單純性和酒精性脂肪肝炎、脂肪變性、肝纖維化、肝硬化、肝細(xì)胞癌[23]。除此之外，一位成年人每日攝入酒精超過60ml的人群中有60%會發(fā)展為酒精性脂肪肝，而每天攝入超過120ml酒精的人群發(fā)展為肝硬化的概率非常高[24,25]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織《Globalstatusreportonalcoholandhealth2018》指出在過去的2018年里，隨著中國經(jīng)濟的爆炸性增長和社會開放程度的提高，中國的酒精消費量急劇增加。所以飲酒是社會發(fā)展不可避免的社交活動，但是適度飲酒也并未有具體的研究表明其閾值，若習(xí)慣性的飲酒，在體內(nèi)造成堆積也是不可估量的。所以本實驗希望從酒這個發(fā)病根源入手，配出能夠?qū)凭愿螕p傷有緩解作用的藥酒。對于酒精性肝損傷的治療的藥物，國內(nèi)外均有大量的研究，目前西藥如降脂藥、抗氧化劑、抗內(nèi)毒素劑等均為常用治療酒精肝損傷的藥物，還有秋水仙堿、胰島素、丙基硫氧嘧啶也有一定的療效。除此之外，還有幾種臨床常用改善肝功能藥物如還原型谷胱甘肽、多烯磷脂酰膽堿[26]。雖然這幾種在臨床治療酒精性肝病的使用率高，但是西藥的治療存在一定的不良反應(yīng)，如胃腸道刺激反應(yīng)、血糖水平升高、心肌受到傷害等[27]。而中藥對于酒精性肝病治療也日漸發(fā)展，主要是通過改善肝臟功能、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)、抗炎保肝作用、抑制細(xì)胞凋亡四個方面來治療酒精性肝損傷[28]。例如中藥活性提取物薯蕷皂苷元可以防止小鼠脂質(zhì)積累、氧化應(yīng)激、細(xì)胞損傷和肝臟輕度炎癥，也有研究表明薯蕷皂苷元可以通過調(diào)節(jié)SIRT2相關(guān)脂肪酸的攝取來減輕糖尿病的非酒精性脂肪肝病[29]。大量實驗表明肝臟疾病的發(fā)生和發(fā)展與腸道微生物群的變化，長期酗酒會改變結(jié)構(gòu)和腸道菌群在體內(nèi)的分布，引起粘膜損傷和細(xì)菌易位，減少有益細(xì)菌的數(shù)量，增加有害細(xì)菌數(shù)量，加重肝細(xì)胞損傷，研究有表明通過調(diào)節(jié)腸道微生物群的多樣性，組成腸道微生物群可以優(yōu)化，有益細(xì)菌的增加可以促進，并能抑制病原菌的生長，從而起到對酒精性肝損傷的保護作用[30]。如靈芝孢子粉可用作為益生元調(diào)節(jié)腸道微生物，從而改善身體健康。大量研究表明，靈芝孢子粉可以減少細(xì)胞損傷，促進肝細(xì)胞再生，對肝臟起到保護作用[31]。又如沙棘和膜黃芪作為中藥，具有藥食同源性，具有良好的肝臟保護作用，其多糖可以調(diào)節(jié)腸道菌群[32]。大量證據(jù)表明，mTOR的激活可減少與飲酒和新陳代謝相關(guān)的肝損傷，而葛根素是一種從葛根（野生）中分離出的天然生物活性黃酮化合物，可以通過抗炎、抗酒精中毒和調(diào)節(jié)雷帕霉素（mTOR）的機制靶標(biāo)提供肝臟保護[33]。綠原酸是人類飲食中最豐富的多酚化合物之一，綠原酸的作用機制主要涉及通過調(diào)節(jié)肝過氧化物酶體增殖物激活的受體γ或肝臟X受體-α（PPARαγ，LXRα）在肝臟中攝取和合成脂肪酸，而異綠原酸B的抗氧化作用和抑制促纖維化因子通過Nrf2和miR-122/HIF-1α信號通路介導(dǎo)，以防止非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的纖維化[34]。除了上述幾種中藥或中藥活性提取物外，還有很多可用于緩解或治療肝損傷的中藥活性提取物，如黃酮類化合物槲皮素、黃芩素、木犀草素等，多酚類化合物白藜蘆醇、姜黃素、丹參酸，萜類化合物白樺酸、熊果酸等，皂苷類薯蕷皂苷、人參皂苷等，生物堿小檗堿、五味子苷等[35]。而對于藥酒的配備，本實驗希望做出有市場前景的藥酒保健品銷售，以茅臺酒作為參考發(fā)現(xiàn)，吳君等[18]對茅臺酒進行的回顧性流行病學(xué)研究表明，除脂肪肝外，茅臺酒的的飲用人群同纖維化、肝硬化無明顯的相關(guān)性。適量的飲用茅臺酒人群比飲用其他酒人群發(fā)生肝細(xì)胞癌的風(fēng)險較低。為了與茅臺酒相媲美，本藥酒加入了一系列食品級矯味劑以調(diào)配口感，經(jīng)過反復(fù)的對比，反復(fù)的測試，經(jīng)各年齡段志愿者品嘗打分，最終確定了食品級矯味劑的劑量及藥酒配方。綜上所述，為能夠配出對酒精性肝損傷有緩解或保護作用的藥酒，本實驗所自配的藥酒加入了綠原酸、葛根素和薯蕷皂苷元三種保肝護肝中藥活性提取物，對所配藥酒進行了有效性實驗——動物實驗，將小鼠分為了五個組別，分別為空白組/K組，藥酒組/Y組，藥酒+市售白酒組/YE組，基酒組/D組，市售白酒組/E組。其中發(fā)現(xiàn)給藥組尤其是藥酒與市售白酒搭配的組別對肝損傷緩解作用的效果優(yōu)于各組。本實驗的發(fā)展前景是可觀的，望在與茅臺酒相似風(fēng)味的基礎(chǔ)上，又能達(dá)到緩解或預(yù)防酒精性肝損傷等酒精引起的健康問題。

5結(jié)論用市售白酒與基酒成功建立兩個雄性小鼠酒精性肝損傷模型。藥酒組與藥酒+市售白酒搭配組均有緩解酒精性肝損傷的作用，其中以藥酒+市售白酒搭配組的效果最佳。

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