YL膠囊溶出度試驗(yàn)方法的初步研究

YL膠囊溶出度試驗(yàn)方法的初步研究【摘要】目的：建立YL膠囊溶出度試驗(yàn)方法，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。方法：采用小杯法，模擬胃液的溶出介質(zhì)為0.1mol/L鹽酸溶液100mL，模擬腸液的溶出介質(zhì)為pH=6.8的磷酸鹽緩沖液100mL，轉(zhuǎn)速50r·min-1，溫度37±0.5℃進(jìn)行溶出度試驗(yàn)，溶出液經(jīng)孔徑10μm的濾膜濾過(guò)，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其600nm處的吸光度。結(jié)果：YL高濃度膠囊在胃液中無(wú)溶出，在腸液中完全溶出。結(jié)論：試驗(yàn)結(jié)果可為YL膠囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考，保證藥物的質(zhì)量?！娟P(guān)鍵詞】YL膠囊；溶出度；比濁法；CCK-8；活菌數(shù)PreliminaryStudyonDissolutionMethodofYLCapsules[Abstract]Objective:ToestablishamethodofthedeterminationofthedissolutionofYLcapsules,thus,toprovidereferenceforitsqualityevaluation.Methods:Thesmallglassmethodwasadoptedfortwodifferentdissolutionmedia,thedissolutionmediumofsimulatedgastricfluidwas100mLof0.1mol/Lhydrochloricacidsolution,andthedissolutionmediumofsimulatedintestinalfluidwas100mLofphosphatebufferwithpH=6.8,therotationspeedwas50r·min-1,andthetemperaturewas37±0.5℃.Thedissolutionwasfilteredthroughafiltermembranewithaporesizeof10μm。Itsabsorbanceat600nmwasdeterminedbyanultravioletspectrophotometer.Results:TheHighconcentrationofYLcapsulesdonotdissolveingastricjuice,whiletotaldissolveinintestinalfluid.Conclusion:TheexperimentalresultscanprovideareferenceforthequalityevaluationofYLcapsulesandensurethequalityofdrugs.[Keywords]YLCapsulesDissolutionTurbidimetricmethodCellCountingKit-8Numberofviablebacteria目錄TOC\o"1-3"\h\u1前言 前言1.1益生菌的藥理作用、臨床作用及發(fā)展現(xiàn)狀YL膠囊是一種自研的活菌膠囊，其主要的藥物為益生菌。益生菌是一種腸道的共生菌群，其主要作用是調(diào)整人體免疫和腸道等健康，是目前用于調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)的常見(jiàn)制劑產(chǎn)品。近年來(lái)微生物組學(xué)的研究不斷深入，越來(lái)越多的研究證據(jù)顯示微生物與人體的健康密切相關(guān)，人類生活質(zhì)量的不斷提高，促使益生菌制劑產(chǎn)品也逐漸走在高科技生物制品的前沿。對(duì)于日漸發(fā)展的益生菌制劑產(chǎn)品，確認(rèn)其活菌數(shù)是確保產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵。為了滿足科研部門和醫(yī)院測(cè)定工作的需要，國(guó)內(nèi)外在益生菌制劑的研究上給予更多的關(guān)注以及不斷深入探究。1.2溶出度試驗(yàn)的發(fā)展現(xiàn)狀在藥物產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)階段或常規(guī)的質(zhì)量控制階段,溶出度試驗(yàn)以反映和控制藥物制劑的體內(nèi)溶出行為為目的REF_Ref28207\n\h[1]，因此溶出方法都應(yīng)盡可能建立良好的體內(nèi)外相關(guān)性，才能較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)該藥物在體內(nèi)的吸收行為。美國(guó)藥典是最早收載有關(guān)溶出度試驗(yàn)的藥典，于1973年版美國(guó)藥典收載地高辛片的溶出度和釋放度檢查，第一次引入溶出度檢查的相關(guān)概念，隨后在1988年正式引入溶出度檢查法。而溶出度試驗(yàn)最初以溶出檢查法在1985年被收錄入中國(guó)藥典，在1995年新增了小杯法裝置，至最新版中國(guó)藥典2020年版，收錄了籃法、漿法、小杯法、槳碟法、轉(zhuǎn)筒法、流池法以及往復(fù)筒法，共七種測(cè)定方法。目前中國(guó)藥典溶出度檢查品種數(shù)達(dá)180種，美國(guó)藥典則高達(dá)515種REF_Ref28296\n\h[2]。橫觀國(guó)內(nèi)外，美國(guó)藥典是目前收錄溶出度試驗(yàn)方法最多且各方面最詳盡的藥典?？v觀整個(gè)溶出度試驗(yàn)方法發(fā)展歷程，國(guó)內(nèi)外不斷新增溶出度試驗(yàn)方法，不斷優(yōu)化與完善現(xiàn)存的方法，要求越來(lái)越嚴(yán)格，可見(jiàn)溶出度試驗(yàn)對(duì)藥物的質(zhì)量保證越來(lái)越重要。目前各國(guó)藥典關(guān)于藥物溶出檢查的政策和規(guī)定不盡相同,但總體趨勢(shì)向著趨于統(tǒng)一的方向發(fā)展REF_Ref28397\n\h[3]。如今，相對(duì)前沿的方法如往復(fù)筒法、流通池法，基于介質(zhì)的自然對(duì)流，使樣品一直暴露于均勻無(wú)渦流的新鮮介質(zhì)中，從而達(dá)到模擬藥物體內(nèi)溶出的效果。在一定程度為一般口服藥物的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考，但裝置以及操作步驟較為復(fù)雜，且有待改進(jìn)與完善。而籃法和小杯法等作為較常用的溶出度試驗(yàn)方法，以攪拌或旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的強(qiáng)制對(duì)流使藥物溶出為原理REF_Ref28433\n\h[4]，其裝置簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)單，同樣能建立良好的體內(nèi)外相關(guān)性，故更加多地應(yīng)用于藥物溶出檢查中。盡管當(dāng)前各國(guó)還沒(méi)有關(guān)于溶出方法建立與驗(yàn)證的詳盡指導(dǎo)與解釋，但是通常在藥物溶出方法建立過(guò)程中首選籃法與漿法，在兩者不適用時(shí)，才考慮采用往復(fù)筒法或流通池法等REF_Ref28465\n\h[5]。1.3活菌數(shù)測(cè)定方法的發(fā)展現(xiàn)狀1.3.1平板菌落計(jì)數(shù)法作為一種傳統(tǒng)的總菌數(shù)的測(cè)定方法，平板菌落計(jì)數(shù)法是取合適稀釋度的菌液，滴入選擇性瓊脂培養(yǎng)基平皿上，玻棒涂布均勻后置適宜條件下培養(yǎng)，到期對(duì)平皿菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)REF_Ref28576\n\h[6]。該法能準(zhǔn)確地測(cè)定出相應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故被廣泛應(yīng)用且多作為其他方法的驗(yàn)證方法。但時(shí)由于其檢測(cè)過(guò)程中多因操作過(guò)程繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，容易導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果受多種試驗(yàn)因素(如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基等)的影響。1.3.2比濁法比濁法也是一種傳統(tǒng)、常見(jiàn)的總菌數(shù)的測(cè)定方法，其原理是利用微生物液體培養(yǎng)后因活菌的增加，導(dǎo)致培養(yǎng)液渾濁度的增加，進(jìn)而運(yùn)用分光光度計(jì)在特定波長(zhǎng)下測(cè)定REF_Ref28622\n\h[7]，進(jìn)行渾濁度的對(duì)比。該方法優(yōu)點(diǎn)在于簡(jiǎn)單、快速且直觀，但無(wú)法確定培養(yǎng)液中菌的死活，故測(cè)出的數(shù)據(jù)不能準(zhǔn)確地表明微生物的活菌數(shù)。1.3.3流式細(xì)胞分析技術(shù)（FCM）流式細(xì)胞分析技術(shù)（flowcytometryanalysisFCM）是近年來(lái)在非培養(yǎng)活菌定量技術(shù)中迅速崛起的一項(xiàng)技術(shù)，其原理基于SYTO9和PI兩種核酸染料的跨膜特性進(jìn)行益生菌死/活的區(qū)分，染色后孵育，使用nFCM檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌活性的評(píng)估。該法提供了一種極其快速且準(zhǔn)確的單細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)菌檢測(cè)方法REF_Ref28655\n\h[8]，且其結(jié)果的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性以及重復(fù)性較高，現(xiàn)已被證實(shí)可用于益生菌產(chǎn)品總菌及活菌的計(jì)數(shù)，但目前該檢測(cè)技術(shù)很難實(shí)現(xiàn)每種菌的活菌計(jì)數(shù)REF_Ref28684\n\h[9]，而且裝置昂貴，測(cè)試條件苛刻，不易實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確地檢測(cè)活菌總數(shù)。1.3.4熒光法CalceinUltraGreen?AM是一種新型熒光染料，可用于標(biāo)記和監(jiān)測(cè)活細(xì)胞。該方法利用新型熒光染料的熒光特性及其在活細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的反應(yīng)特性，根據(jù)熒光染料的光譜特性測(cè)定其熒光強(qiáng)度值，建立熒光強(qiáng)度值與活菌數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。張宇婷REF_Ref28717\n\h[10]等用熒光法、比濁法、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法與平板計(jì)數(shù)法四種方法測(cè)定活菌數(shù)，實(shí)驗(yàn)表明上述建立的熒光法檢測(cè)結(jié)果更接近于平板計(jì)數(shù)法的檢測(cè)結(jié)果，而且重復(fù)性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性更好。但由于該染色條件是用于染色動(dòng)物細(xì)胞，目前應(yīng)用該染料檢測(cè)活菌數(shù)的相關(guān)文獻(xiàn)鮮有報(bào)道，技術(shù)的成熟性未得到驗(yàn)證。1.3.5MTT法快速檢測(cè)技術(shù)噻唑藍(lán)[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoli-umromide，MTT]法，其原理是利用活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性黃色的四甲基偶氮藍(lán)(MTT)還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，根據(jù)甲瓚生成量與活細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系，測(cè)定相應(yīng)的OD值，從而間接獲得活細(xì)胞數(shù)量REF_Ref28759\n\h[11]。該法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便、節(jié)省材料、無(wú)同位素污染，便于實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)REF_Ref28825\n\h[12]，從而可以用于大部分細(xì)菌以及部分益生菌的活菌測(cè)定，簡(jiǎn)化操作過(guò)程的同時(shí)滿足大批量樣本的處理需求。但對(duì)于其他菌種，是否也適用MTT比色法還有待進(jìn)一步研究。該法還存在一個(gè)不足之處--存在濃度下限，當(dāng)菌體數(shù)量太低時(shí)，由于系統(tǒng)誤差造成的數(shù)據(jù)偏差相對(duì)于測(cè)定結(jié)果非常顯著，因而線性關(guān)系弱化，方法便不再適用REF_Ref28864\n\h[13]。1.3.6CCK-8法CCK-8法，CellCountingKit-8是一種較新型的活細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。其原理類似與MTT法，CCK-8試劑被細(xì)胞內(nèi)脫氫酶氧化還原后生成的橙黃色甲臜染料能夠溶解在組織培養(yǎng)基中，可直接進(jìn)行測(cè)定，且因CCK-8試劑生成的甲臢物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量呈正比，測(cè)定的OD值可以間接反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)量REF_Ref28893\n\h[14]。相比于應(yīng)用廣泛的MTT法，CCK-8法存在著優(yōu)勢(shì)：生成的可溶性甲臜可以直接測(cè)定，操作更加方便快捷且安全；孵育時(shí)間較MTT法短，更加省時(shí)；目前已有實(shí)驗(yàn)REF_Ref28916\n\h[15]證明CCK-8法重復(fù)性好、靈敏度高，明顯優(yōu)于MTT法。但此法尚未在活性菌增殖或藥物篩選中應(yīng)用，故可以在不斷改進(jìn)和完善該方法下嘗試采用其對(duì)活菌數(shù)量進(jìn)行測(cè)定。1.3.7小結(jié)對(duì)于微生物制劑的質(zhì)量控制上，建立一種操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確并可反映細(xì)菌活性的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法是非常必要的，故才不斷出現(xiàn)如以上所述的各種創(chuàng)新方法。對(duì)比其余幾種方法，比濁法操作相較于簡(jiǎn)單便捷，但測(cè)定結(jié)果沒(méi)有其他儀器法準(zhǔn)確；流式細(xì)胞技術(shù)、熒光法、MTT法和CCK-8法都是基于試劑染色或者與細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生有色的產(chǎn)物來(lái)進(jìn)行測(cè)定，流式細(xì)胞技術(shù)和MTT法都擁有準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，但這兩種方法所使用的儀器設(shè)備價(jià)格高，相比之下，CCK-8法不僅準(zhǔn)確度較高，而且成本低，操作簡(jiǎn)單。故本文選取了比濁法和CCK-8法對(duì)YL膠囊進(jìn)行溶出度試驗(yàn)，旨在選出較為適宜該藥物的溶出度試驗(yàn)方法。2材料與儀器2.1儀器見(jiàn)表1。表1實(shí)驗(yàn)儀器儀器型號(hào)生產(chǎn)廠家藥物溶出度儀RCZ-8上海黃海藥檢儀器有限公司酶標(biāo)儀synergyHT美國(guó)伯騰儀器有限公司pH計(jì)FiveEasyPlusMETTLERTOLEDO公司集團(tuán)細(xì)胞培養(yǎng)板TCP010096GuangzhouJetBio-FiltrationCo.超聲波清洗器SK720LHC上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司千分之一天平BS423S北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司紫外分光光度計(jì)UV-1800島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司冰箱BCD-535WGHSSEDS9海爾智家股份有限公司微孔濾膜10μm上海興亞凈化材料廠2.2試劑與試藥見(jiàn)表2。表2實(shí)驗(yàn)材料材料批號(hào)來(lái)源空白YL膠囊20230101廣東南芯醫(yī)療科技有限公司低濃度YL膠囊20230102廣東南芯醫(yī)療科技有限公司高濃度YL膠囊20230104廣東南芯醫(yī)療科技有限公司鹽酸（分析純）2021111123廣東廣試試劑科技有限公司磷酸三鈉（分析純）2020072073天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司CCK-8試劑MA0218-Nov-30H廣州瑞舒生物科技有限公司純水20230311廣州市屈臣氏食品飲料有限公司3方法3.1溶出介質(zhì)的制備3.1.1模擬胃液的溶出介質(zhì)0.1mol/L鹽酸溶液配制方法：量取9mL的濃鹽酸于燒杯中加入適量蒸餾水，用玻璃棒攪拌，使其混合均勻，待稀釋的鹽酸冷卻后，沿玻璃棒注入1000mL的量瓶中，加入蒸餾水至刻度線，搖勻即可。溶液使用前進(jìn)行15-20min的超聲，以除去氣泡。3.1.2模擬腸液的溶出介質(zhì)0.1mol/L鹽酸溶液配制方法：同3.1.1方法一致。0.2mol/L磷酸鈉溶液配制方法：精密稱取76.0248g磷酸三鈉于燒杯中加入適量蒸餾水，用玻璃棒攪拌，使其溶解。沿玻璃棒注入1000mL的容量瓶中，加入蒸餾水定容，搖勻。pH=6.8的磷酸鹽緩沖溶液配制方法：取0.1mol/L鹽酸溶液和0.2mol/L磷酸鈉溶液按3:1混合均勻，必要時(shí)用0.1mol/L鹽酸溶液和0.2mol/L磷酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，在37±0.5℃溫度下保存。使用前進(jìn)行15-20min的超聲，以除去氣泡。4溶出度試驗(yàn)條件的考察4.1溶出度試驗(yàn)方法的選擇取待測(cè)膠囊6粒，根據(jù)不同的方法分別放入六杯溶出杯中，設(shè)定不同溶出度試驗(yàn)方法的條件，按儀器使用流程操作，對(duì)比膠囊在籃法和小杯法的溶出情況。由于膠囊為腸溶膠囊，需經(jīng)歷兩種不同的溶出介質(zhì)的溶出，觀察在酸中和緩沖液中的溶出情況。4.1.1籃法取待測(cè)膠囊6粒和空白膠囊1粒分別投進(jìn)轉(zhuǎn)籃中，照溶出度與釋放度測(cè)定法（中國(guó)藥典2020年版四部通則0931第一法）進(jìn)行溶出度試驗(yàn)。分別量取規(guī)定量的0.1mol/L鹽酸溶液置各大溶出杯中，待溶出介質(zhì)溫度恒定在37±0.5℃，轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘100轉(zhuǎn)，啟動(dòng)儀器，依法操作，經(jīng)2小時(shí)后取樣，吸取溶出液5mL于安瓿中，另外吸取溶出液5mL過(guò)濾后置于EP管中。按實(shí)驗(yàn)設(shè)定的各方法測(cè)定，得出每粒的酸中溶出情況。上述各溶出杯酸液中加入溫度為37±0.5℃規(guī)定量的0.2mol/L磷酸鈉溶液，繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)60min，于140min、160min、180min取溶出液5mL于安瓿中，另外吸取溶出液5mL過(guò)濾后置于EP管中。按實(shí)驗(yàn)設(shè)定的各方法測(cè)定，得到每粒的緩沖液中溶出情況。4.1.2小杯法取待測(cè)膠囊6粒和空白膠囊1粒分別放入沉降籃中，照溶出度與釋放度測(cè)定法（中國(guó)藥典2020年版四部通則0931第三法）進(jìn)行溶出度試驗(yàn)。溶出介質(zhì)的體積可選用250ml或100ml。除另有規(guī)定外，分別量取規(guī)定量的0.1mol/L鹽酸溶液置各溶出杯內(nèi)，實(shí)際量取的體積與規(guī)定體積的偏差應(yīng)在±1%范圍之內(nèi)，待溶出介質(zhì)溫度恒定在37℃±0.5℃，取待測(cè)膠囊6粒分別投入溶出杯中，注意避免膠囊表面產(chǎn)生氣泡，立即按各品種項(xiàng)下規(guī)定的轉(zhuǎn)速50rpm啟動(dòng)儀器，2小時(shí)后在規(guī)定取樣點(diǎn)吸取溶出液適量。按實(shí)驗(yàn)設(shè)定的各方法測(cè)定，計(jì)算每粒的酸中溶出量。棄去上述各溶出杯中酸液，立即加入規(guī)定量的溫度為37℃±0.5℃的磷酸鹽緩沖液（pH=6.8），繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)60分鐘，更換使用玻棒進(jìn)行人工攪拌至藥物分散均勻，在規(guī)定取樣點(diǎn)吸取溶出液適量，經(jīng)孔徑10μm的濾膜濾過(guò)，自取樣至濾過(guò)應(yīng)在30秒內(nèi)完成。按實(shí)驗(yàn)設(shè)定的各方法測(cè)定，計(jì)算每粒的緩沖液中溶出量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)籃法的溶出介質(zhì)體積較大導(dǎo)致測(cè)出的吸光度值較低，容易造成誤差大，不易得出相適應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)材料消耗較大。最后確定使用小杯法，濃度適宜。4.2介質(zhì)的選擇根據(jù)溶出度與釋放度測(cè)定法（中國(guó)藥典2020年版四部通則0931），腸溶制劑通常要進(jìn)行酸中溶出量和緩沖液中溶出量的測(cè)定，酸中溶出時(shí)使用的溶出介質(zhì)為了模擬胃液一般采用0.1mol/L的鹽酸溶液，緩沖液中溶出時(shí)使用的溶出介質(zhì)為了模擬腸液一般有兩種方式：①在原來(lái)酸液加入適量0.2mol/L的磷酸鈉溶液，調(diào)節(jié)pH至6.8；②直接棄去原酸液，更換為相同體積的新鮮配制的pH=6.8的磷酸鹽緩沖液。本實(shí)驗(yàn)采取的為后者，使用該溶出介質(zhì)具有操作簡(jiǎn)便，誤差小，準(zhǔn)確高的特點(diǎn)。4.3介質(zhì)體積的選擇根據(jù)溶出度與釋放度測(cè)定法（中國(guó)藥典2020年版四部通則0931），漿法的溶出杯為1000ml杯狀容器，必要時(shí)溶出介質(zhì)可減少至500ml。小杯法的溶出杯則為250ml杯狀容器，通常溶出介質(zhì)體積采用250ml，必要時(shí)溶出介質(zhì)可減少至100ml。實(shí)驗(yàn)對(duì)比高濃度膠囊于250ml和100ml體積的溶出介質(zhì)中的溶出情況，結(jié)果為于250ml的吸光度均值約0.158，于100ml的吸光度均值約0.355。表明采用100ml的溶出體積成本低，且測(cè)定數(shù)值在0.2-0.8范圍內(nèi)，測(cè)定較為準(zhǔn)確，故該溶出體積選用100ml。4.4CCK-8試劑加入量的選擇根據(jù)CCK-8試劑的使用說(shuō)明書，為篩選出適宜的CCK-8試劑加入量，選取了三個(gè)不同試劑終濃度進(jìn)行對(duì)比。取單粒低濃度YL膠囊置于250ml37℃±0.5℃的磷酸鹽緩沖液（pH6.8）中，攪拌至完全溶出。按照以下三種方法對(duì)溶出液進(jìn)行操作：①吸取50μl的溶出液，加入100μl的稀釋10倍的CCK-8試劑，混勻，此時(shí)CCK-8試劑終濃度為6.66%；②吸取100μl的溶出液，加入50μl未稀釋的CCK-8試劑，混勻，此時(shí)CCK-8試劑終濃度為33.33%；③吸取100μl的溶出液，加入100μl未稀釋的CCK-8試劑，混勻，此時(shí)CCK-8試劑終濃度為50.00%。結(jié)果見(jiàn)表3。表3不同濃度的CCK-8放置不同時(shí)間的OD值CCK-8濃度6.66%33.33%50.00%0.5h0.0520.1790.1911h-0.1820.1941.5h-0.1850.1972h-0.1850.1993h-0.1890.20318h-0.2210.236由上表可見(jiàn)，CCK-8試劑終濃度在6.66%且放置半小時(shí)后，OD值低至0.051，故不采用方法①。而方法②和③結(jié)果顯示，兩種終濃度的OD值均大于0.100，易于測(cè)得，且CCK-8的終濃度從33.33%增大到50.00%其OD值增大不明顯，CCK-8試劑的加入劑量應(yīng)為33.33%。4.5酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)的選擇根據(jù)CCK-8試劑的使用說(shuō)明書，為篩選出適宜的測(cè)定波長(zhǎng)，選取了三個(gè)不同波長(zhǎng)進(jìn)行對(duì)比。取單粒高濃度YL膠囊置于250ml37℃±0.5℃的磷酸鹽緩沖液（pH6.8）中，攪拌至完全溶出。取5份100μl的溶出液，各加入50μl的CCK-8試劑，避光孵化1h后，考察450nm、562nm和600nm處的OD值。結(jié)果見(jiàn)圖4-1。圖4-1不同波長(zhǎng)下測(cè)定高濃度膠囊的OD值由上圖可見(jiàn)，450nm處測(cè)得的OD值明顯比562nm和600nm處的OD值要大，即CCK-8試劑與活菌反應(yīng)產(chǎn)生的甲臜在450nm處測(cè)定敏感度最高，故選用450nm的波長(zhǎng)測(cè)定。4.6孵化時(shí)間的選擇根據(jù)CCK-8試劑的使用說(shuō)明書，為篩選出適宜的孵化時(shí)間，選取了六個(gè)不同時(shí)間進(jìn)行對(duì)比。取單粒低濃度YL膠囊置于250ml37℃±0.5℃的磷酸鹽緩沖液（pH6.8）中，攪拌至完全溶出。取100μl的溶出液，加入50μl的CCK-8試劑，避光孵化0.5h、1h、1.5h、2h、3h和18h后，在450nm處測(cè)定其OD值。結(jié)果見(jiàn)圖4-2。圖4-2加入CCK-8試劑后不同孵化時(shí)間的OD值由上圖可見(jiàn)，OD值隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而變大，在前3小時(shí)OD值與時(shí)間顯線性關(guān)系，基于CCK-8試劑的建議孵育時(shí)間2-4h，故選用3h作為孵育時(shí)間。4.7紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)的選擇根據(jù)膠囊前期制備所提供的測(cè)定波長(zhǎng)600nm，按照4.8.2對(duì)空白膠囊和高濃度膠囊的過(guò)濾后的溶出液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果見(jiàn)圖4-3和圖4-4。結(jié)果顯示，在可見(jiàn)光波長(zhǎng)400-760nm處，待測(cè)膠囊溶出液有明顯吸收值，而空白膠囊?guī)缀鯖](méi)有吸收，故選擇600nm是合理的。4.8含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證4.8.1專屬性試驗(yàn)取1?？瞻啄z囊置于裝有100mL0.1mol/L鹽酸溶液的溶出杯中，1粒高濃度膠囊置于裝有100mL0.1mol/L鹽酸溶液的溶出杯中，以50rpm轉(zhuǎn)速，37℃的條件下溶出2h后更換相同體積的37℃±0.5℃的磷酸鹽緩沖液（pH6.8），繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)60分鐘，取其溶出液，經(jīng)孔徑10μm的濾膜濾過(guò)。以pH=6.8的磷酸鹽緩沖液作空白對(duì)照，對(duì)空白膠囊和高濃度膠囊的過(guò)濾后的溶出液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果見(jiàn)圖4-3、圖4-4。圖4-3膠囊溶出液的全波長(zhǎng)掃描圖4-4膠囊溶出液的500-700nm處掃描由上圖可見(jiàn)，在600nm處，空白膠囊無(wú)明顯的吸收，而高濃度膠囊的吸光度值明顯比空白膠囊的值要大，表明空白膠囊在選用的波長(zhǎng)上對(duì)含藥物的膠囊吸光度值無(wú)影響或不干擾。即可采用測(cè)定600nm處的波長(zhǎng)對(duì)供試品膠囊進(jìn)行吸光度的測(cè)定。4.8.2穩(wěn)定性試驗(yàn)根據(jù)4.1.2的方法，取一粒高濃度膠囊置于裝有100mL0.1mol/L鹽酸溶液的溶出杯中，以50rpm轉(zhuǎn)速，37±0.5℃的條件下溶出2h后更換相同體積的37℃±0.5℃的磷酸鹽緩沖液（pH6.8），繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)60分鐘，取其溶出液，經(jīng)孔徑10μm的濾膜濾過(guò)。測(cè)定藥物完全溶出后0h、18h和24h在600nm處的吸光度值。結(jié)果見(jiàn)圖4-5。圖4-5溶出液在不同時(shí)長(zhǎng)600nm處的OD值由上圖可見(jiàn)，在0h、18h和24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的吸光度值無(wú)太大的變化，即溶出后馬上測(cè)定以及放置一段時(shí)間后測(cè)定無(wú)明顯差別，且三者的RSD小于15.0%，表明該法測(cè)定在24h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。5測(cè)定方法的篩選5.1實(shí)驗(yàn)原理5.1.1比濁法的實(shí)驗(yàn)原理比濁法是測(cè)定總菌數(shù)常用而又比較簡(jiǎn)便的方法，它的原理是在微生物液體培養(yǎng)以后，隨著活菌增多，培養(yǎng)液渾濁度也隨之升高，再利用分光光度計(jì)對(duì)某一特定波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)REF_Ref28622\n\h[7]，測(cè)定值能在一定程度上反映菌數(shù)。5.1.2CCK-8法的實(shí)驗(yàn)原理CCK-8法，CellCountingKit-8(CCK-8法)是一種較新型的活細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。其原理類似與MTT法，CCK-8試劑被細(xì)胞內(nèi)脫氫酶氧化還原后生成的橙黃色甲臜染料能夠溶解在組織培養(yǎng)基中，可直接進(jìn)行測(cè)定，且因CCK-8試劑生成的甲臢物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量呈正比，測(cè)定的OD值可以間接反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)量REF_Ref28759\n\h[11]。5.2方法5.2.1比濁法的測(cè)定方法根據(jù)4.1中的小杯法，采用250ml溶出體積對(duì)空白YL膠囊和高濃度YL膠囊進(jìn)行溶出，取空白和不同濃度膠囊的不同時(shí)段的溶出液于96孔板中，在酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定其OD值；或根據(jù)4.1中的小杯法，分別采用250ml和100ml的溶出體積對(duì)空白YL膠囊和高濃度YL膠囊進(jìn)行溶出，取120min、180min已過(guò)濾的溶出液，取空白和不同濃度膠囊的不同時(shí)段的溶出液于比色皿中，在紫外分光光度計(jì)下測(cè)定600nm處的OD值。5.2.2CCK-8法的測(cè)定方法根據(jù)4.1中的小杯法對(duì)單顆空白YL膠囊和單顆高濃度YL膠囊分別進(jìn)行溶出，取180min溶出液，用移液槍分別移取空白和不同濃度膠囊不同時(shí)段的溶出液各5份100μl于96孔板，分別加入50μl的CCK-8試劑，混勻，37℃避光孵育，于3h后在酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定其OD值。5.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.3.1比濁法的測(cè)定結(jié)果根據(jù)5.2.1中的方法，在酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定其OD值。結(jié)果見(jiàn)表4、表5。根據(jù)5.2.1中的方法，在紫外分光光度計(jì)的600nm處測(cè)定其OD值。溶出體積為250ml的結(jié)果見(jiàn)表6、表7;溶出體積為100ml的結(jié)果見(jiàn)表8、表9。表4120min溶出液的OD值空白123456OD10.0390.0390.0370.0390.0390.0400.039OD20.0390.0400.0370.0390.0400.0380.038OD30.0380.0390.0400.0380.0390.0380.039OD40.0390.0390.0360.0370.0400.0380.037OD50.0370.0380.0390.0360.0380.0370.036AVERAGE0.0380.0390.0380.0380.0390.0380.038RSD0.0230.0180.0430.0340.0210.0290.034減去空白-0.001-0.001-0.0010.0010.000-0.001表5180min溶出液的OD值空白123456OD10.0530.0550.0710.0560.0570.0640.057OD20.0500.0540.0530.0550.0580.0590.057OD30.0490.0540.0510.0550.0560.0590.058OD40.0480.0530.0530.0530.0560.0590.056OD50.0490.0510.0540.0530.0560.0570.058AVERAGE0.0490.0530.0560.0540.0570.0600.057RSD0.0390.0280.1500.0250.0160.0440.015減去空白-0.0040.0070.0050.0070.0100.007表6120min溶出液600nm處OD值123456OD10.0020.0000.0020.000-0.001-0.001OD20.0020.0000.0020.000-0.001-0.001OD30.0020.0000.0020.000-0.001-0.001EQ\*jc0\*hps10\o(\s\up9(—),OD)0.0020.0000.0020.000-0.001-0.001AVERAGE0.000表7180min溶出液600nm處OD值123456OD10.1740.1470.1580.1410.1440.187OD20.1740.1470.1570.1410.1440.188OD30.1740.1470.1560.1420.1440.188EQ\*jc0\*hps10\o(\s\up9(—),OD)0.1740.1470.1570.1410.1440.187AVERAGE0.158STDEV0.018RSD11.7%表8120min溶出液600nm處OD值123456OD1-0.000-0.001-0.000-0.000-0.001-0.000OD2-0.000-0.001-0.000-0.000-0.001-0.000OD3-0.000-0.001-0.000-0.000-0.001-0.000EQ\*jc0\*hps10\o(\s\up9(—),OD)-0.000-0.001-0.000-0.000-0.001-0.000AVERAGE0.000表9180min溶出液600nm處OD值123456OD10.4020.3880.3150.3980.3320.296OD20.4020.3890.3150.3970.3330.295OD30.4020.3900.3150.3970.3340.295EQ\*jc0\*hps10\o(\s\up9(—),OD)0.4020.3890.3150.3970.3330.296AVERAGE0.355STDEV0.046RSD13.0%結(jié)果可知，在酶標(biāo)儀下測(cè)定溶出液的OD值均非常小，其結(jié)果無(wú)法準(zhǔn)確地表明溶出液的渾濁程度，故不使用該法。而使用紫外分光光度法，在模擬胃液的2h內(nèi)，待測(cè)膠囊無(wú)論在250ml或100ml溶出介質(zhì)中進(jìn)行溶出，其溶出液在600nm處基本無(wú)吸收，即表明YL膠囊在胃的環(huán)境下不溶出；在模擬腸液的1h內(nèi)，膠囊殼變形、破裂，逐漸溶解，暴露出內(nèi)容物，溶液逐漸變渾濁。溶出液在600nm處有吸收，且溶出體積越小吸光度值越大，即表明YL膠囊在腸的環(huán)境下完全溶出，六杯溶出液的RSD＜15%，證明其重復(fù)性較好，故可以采用該儀器法對(duì)溶出液進(jìn)行測(cè)定。5.3.2CCK-8法的測(cè)定結(jié)果根據(jù)5.2.2測(cè)定溶出液在450nm處的OD值。結(jié)果見(jiàn)表10。表10180min溶出液450nm測(cè)定OD值編號(hào)空白高濃度對(duì)照10.0770.1890.07320.0810.1860.07530.1020.2270.07740.1520.251-50.1630.218-AVERAGE0.1150.2140.075結(jié)果可知，在模擬腸液的1h內(nèi)，膠囊逐漸崩解，取180min溶出液與CCK-8反應(yīng)，溶液從淺粉色經(jīng)避光孵育后呈棕黃色，在450nm處有較大的OD值，即表明YL膠囊在腸液的環(huán)境下溶出且溶出液中存在活菌。6討論溶出介質(zhì)是溶出度試驗(yàn)的其中一個(gè)重要要素，溶出介質(zhì)的pH值影響藥物的溶出效果。實(shí)驗(yàn)選取如4.2所述的兩種不同方法制備模擬腸液，方法①在溶出杯中直接按比例混合鹽酸與磷酸鈉溶液，無(wú)法保證讓平行六杯溶出杯中的溶液同時(shí)達(dá)到pH=6.8，且操作繁雜，容易造成誤差。相比之下方法②，使用當(dāng)天新鮮配制的pH=6.8的磷酸鹽緩沖液，操作較為簡(jiǎn)便，確保溶出杯中的溶液相同，能在一定程度降低在更換溶出液時(shí)的誤差。在進(jìn)行CCK-8法染色時(shí)，試劑的濃度是影響顯色的一個(gè)因素。設(shè)定三個(gè)三個(gè)試劑終濃度，調(diào)整其加入量。CCK-8試劑終濃度在6.66%時(shí)，OD值非常低，推測(cè)此時(shí)CCK-8濃度太低，試劑與細(xì)胞反應(yīng)不充分，以致難以顯色；當(dāng)CCK-8試劑終濃度在33.33%時(shí)，OD值大于0.1，顯色明顯。但為確保該濃度下CCK-8未飽和，將CCK-8終濃度加大到50.00%，可見(jiàn)OD值增加不明顯，即表明在終濃度為33.33%時(shí)CCK-8試劑不存在飽和現(xiàn)象，且為了節(jié)省成本，最終確定CCK-8試劑的加入量為50μl。在進(jìn)行吸光度值測(cè)定時(shí)，直接用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其OD值，或用酶標(biāo)儀直接測(cè)定其OD值，發(fā)現(xiàn)空白膠囊的值較低濃度的值大，推測(cè)空白膠囊和待測(cè)膠囊的輔料自身存在吸光度值，會(huì)對(duì)測(cè)定產(chǎn)生一定的干擾。為除去輔料的干擾，相關(guān)研究人員使用孔徑為0.45、2、5、10μm的濾膜對(duì)溶出液進(jìn)行過(guò)濾，綜合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以得到濾紙孔徑大于5μm，并不會(huì)造成活菌數(shù)停留在濾膜上，活菌的通過(guò)率達(dá)100%，而輔料中其他較大顆粒會(huì)因?yàn)闉V紙孔徑被吸付著。故本實(shí)驗(yàn)采用10μm的濾膜以消除自身輔料對(duì)測(cè)定的干擾。YL膠囊的紫外分光光度計(jì)測(cè)定中，實(shí)驗(yàn)建立的CCK-8法和比濁法均能表現(xiàn)YL膠囊的溶出情況?；趯?shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)比兩種方法，CCK-8相對(duì)于比濁法操作更加復(fù)雜，耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)，且成本相對(duì)較高，所以選擇了后者。本實(shí)驗(yàn)僅初步建立了YL膠囊的溶出度試驗(yàn)的方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能直接呈現(xiàn)溶出度及其溶出的活菌數(shù)。但有相關(guān)人員研究選取OD值范圍在0.1-1.0間的YL菌液，進(jìn)行稀釋涂布，統(tǒng)計(jì)平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，進(jìn)一步深入研究得出YL菌液的OD值在0.1~1.0的范圍內(nèi)，其OD值與對(duì)應(yīng)的活菌數(shù)的相關(guān)性呈線性關(guān)系，其關(guān)系表現(xiàn)為：Y=14.216*X-1.6136(單位每毫升活菌數(shù)為10^8CPU/mL)，即隨著OD值的增大，其對(duì)應(yīng)的活菌數(shù)也升高。OD值與活菌數(shù)之間的關(guān)系考察，說(shuō)明了本實(shí)驗(yàn)確立的比濁法的可行性與準(zhǔn)確性?？筛鶕?jù)該考察，進(jìn)一步完善YL膠囊的溶出度試驗(yàn)及其含量測(cè)定方法，補(bǔ)充相應(yīng)的方法學(xué)考察后，可以將其應(yīng)用于大批量膠囊的溶出度試驗(yàn)，為YL膠囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考，保證藥物的質(zhì)量。7結(jié)論7.1體外溶出試驗(yàn)通過(guò)對(duì)溶出度試驗(yàn)條件的篩選，適合YL膠囊溶出度試驗(yàn)的方法為：以0.1mol/L鹽酸溶液100mL作模擬胃液，以pH=6.8的磷酸鹽緩沖液100mL作模擬