單克隆抗體制備流程

單抗制備流程1975年，Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的雜交細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無(wú)限增殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破不僅為醫(yī)學(xué)與生物學(xué)基礎(chǔ)研究開(kāi)創(chuàng)了新紀(jì)元，也為臨床疾病的診、防、治提供了新的工具.制備單克隆抗體包括動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、選擇雜交瘤、檢測(cè)抗體、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn),要經(jīng)過(guò)幾個(gè)月的一系列實(shí)驗(yàn)步驟，下面按照制備單克隆抗體的流程順序，逐一介紹其實(shí)驗(yàn)方法。一、細(xì)胞融合前準(zhǔn)備免疫方案選擇合適的免疫方案對(duì)于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般要在融合前兩個(gè)月左右確立免疫方案開(kāi)始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。.顆粒性抗原免疫性較強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細(xì)胞性抗原為例的免疫方案:初次免疫 1X107/0。5mlip（腹腔內(nèi)注射）! 2?3周后第二次免疫 1X107/0。5mlipI3周后加強(qiáng)免疫（融合前三天）1X107/0.5mlip或iv（靜脈內(nèi)注射）I取脾融合2?？扇苄钥乖庖咴匀酰话阋幼魟?常用佐劑：福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起,研磨成油包水的乳糜狀,放一滴在水面上不易馬上擴(kuò)散呈小滴狀表明已達(dá)到油包水的狀態(tài)。商品化福氏完全佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻.初次免疫Ag1?50Hg加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射I （一般0。8?1ml0.2ml/點(diǎn)）I3周后第二次免疫劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ipI （ip劑量不宜超過(guò)0。5ml）I3周后第三次免疫劑量同上，不加佐劑，ipI（5?7天后采血測(cè)其效價(jià)，檢測(cè)免疫效果）I2?3周后加強(qiáng)免疫，劑量50~500Hg為宜，ip或ivI3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如①將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷环矫嬖鰪?qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射.③使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平,促進(jìn)免疫細(xì)胞對(duì)抗原反應(yīng)性。飼養(yǎng)細(xì)胞在制備單克隆抗體過(guò)程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細(xì)胞,如：在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（較為常用）、小鼠脾臟細(xì)胞或小鼠胸腺細(xì)胞，也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞,使用比較方便，照射后可放入液氮罐長(zhǎng)期保存，隨用隨復(fù)蘇。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備小鼠采用與免疫小鼠相同的品系，常用BaLb/c小鼠6?10周齡!拉頸處死浸泡于75%酒精，消毒3?5分鐘!用無(wú)菌剪刀剪開(kāi)皮膚,暴露腹膜!用無(wú)菌注射器注入6?8ml培養(yǎng)液!反復(fù)沖洗，吸出沖洗液!放入10ml離心管，1200轉(zhuǎn)/分離心5?6分鐘!用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)1X105/ml!加入96孔板，100H1/孔!放入37℃CO2孵箱培養(yǎng)一般飼養(yǎng)細(xì)胞在融合前一天制備，一只小鼠可獲得5?8X106腹腔巨噬細(xì)胞，若用小鼠胸腺細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞濃度為5X106/ml,小鼠脾細(xì)胞為1X106/ml,小鼠的成纖維細(xì)胞（3T3）1X105/ml,均為100口1/孔。骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系,這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細(xì)胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。常用骨髓瘤細(xì)胞系有：NS1、SP2/0、X63Ag8。653等。骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)適合于一般的培養(yǎng)液,如RPMI1640,DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10?20%,細(xì)胞的最大密度不得超106/ml,一般擴(kuò)大培養(yǎng)以1：10稀釋傳代,每3?5天傳代一次。細(xì)胞的倍增時(shí)間為16?20小時(shí)，上述三株骨髓瘤細(xì)胞系均為懸浮或輕微貼壁生長(zhǎng),只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細(xì)胞.一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開(kāi)始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞,為確保該細(xì)胞對(duì)HAT的敏感性，每3?6月應(yīng)用8?AG（8氮雜鳥(niǎo)嘌呤）篩選一次，以防止細(xì)胞的突變。保證骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,良好的形態(tài),活細(xì)胞計(jì)數(shù)高于95%,也是決定細(xì)胞融合的關(guān)鍵.免疫脾細(xì)胞免疫脾細(xì)胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細(xì)胞素漿母細(xì)胞.一般取最后一次加強(qiáng)免疫3天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液，由于此時(shí)B淋巴母細(xì)胞比例較大,融合的成功率較高。脾細(xì)胞懸液的制備:在無(wú)菌條件下取出脾臟,用不完全的培養(yǎng)液洗一次,置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上,用注射器針芯研磨成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù).一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的2倍，細(xì)胞數(shù)為2刈08左右。二、細(xì)胞融合,選擇雜交瘤細(xì)胞融合流程(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0,1000rpm離心5分鐘，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞懸液,用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。(3)將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，1200rpm,8分鐘.棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略加松動(dòng)。在室溫下融合：30秒內(nèi)加入預(yù)熱的1ml45%PEG(Merek,分子量4000)含5%DMSO,邊加邊攪拌.作用90秒鐘，若冬天室溫較低時(shí)可延長(zhǎng)至120秒鐘.加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔2分鐘分別加入1ml,2ml,3ml,4ml,5ml和10ml。離心，800rpm,6分鐘.(8)棄上清，先用6ml左右20%小牛血清RPMI1640輕輕混懸，切記不能用力吹打,以免使融合在一起的細(xì)胞散開(kāi)。根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液，10ml一塊96孔板。(10)將融合后細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板,100口l/孔,37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。一般一塊96孔板含有1義107脾細(xì)胞。HAT選擇雜交瘤應(yīng)用HAT選擇培養(yǎng)液篩選雜交瘤細(xì)胞的原理已在研究生專題講座第六專題中已經(jīng)提到,這里主要介紹加HAT選擇培養(yǎng)的時(shí)間和濃度。一般在融合24小時(shí)后，加HAT選擇培養(yǎng)液。HT和HAT均有商品化試劑50義貯存，用時(shí)1ml加入50ml20%小牛血清完全培養(yǎng)液中。因?yàn)樵谂囵B(yǎng)板內(nèi)已加入飼養(yǎng)細(xì)胞、融合后的細(xì)胞，200口l/孔。所以在加選擇培養(yǎng)液時(shí)應(yīng)加3倍量的HAT.我們認(rèn)為，融合后最初補(bǔ)加的量可用全量的2/3進(jìn)行選擇，可得到滿意的篩選結(jié)果。50XHATH:5X10—3MA： 2X10—5MT:8X10-4M一般選擇HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后，改用HT培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)兩周，改用一般培養(yǎng)液。三、抗體的檢測(cè)篩選雜交瘤細(xì)胞通過(guò)選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細(xì)胞系中,僅少數(shù)能分泌針對(duì)免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10面積時(shí)，即可開(kāi)始檢測(cè)特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。檢測(cè)抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感的方法為原則.常用的方法有：ELISA用于可溶性抗原（蛋白質(zhì)）、細(xì)胞和病毒等McAb的檢測(cè).RIA用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb的檢測(cè)。FACS（熒光激活細(xì)胞分類儀）用于檢查細(xì)胞表面抗原的McAb檢測(cè).IFA用于細(xì)胞和病毒McAb的檢測(cè).上述方法均為一般實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法，故在此不介紹具體的實(shí)驗(yàn)過(guò)程.可靠的篩選方法必須在融合前建立，避免由于方法不當(dāng)貽誤整個(gè)篩選時(shí)機(jī)。四、雜交瘤的克隆化和凍存克隆化一般是指將抗體陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化。聚r為經(jīng)過(guò)HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個(gè)孔內(nèi)只有一個(gè)克隆.在實(shí)際工作中，可能會(huì)有數(shù)個(gè)甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞；所需要的抗體（特異性抗體）分泌細(xì)胞和其它無(wú)關(guān)抗體分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開(kāi)，就需要克隆化?？寺』脑瓌t是，對(duì)于檢測(cè)抗體陽(yáng)性的雜交克隆應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化,否則抗體分泌的細(xì)胞會(huì)被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制,因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度比抗體分泌的細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，二者競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果會(huì)使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過(guò)的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆,以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力?？寺』桨赣每寺』姆椒ê芏?，而最常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法.有限稀釋法的程序制備飼養(yǎng)細(xì)胞懸液（同融合前準(zhǔn)備）陽(yáng)性孔細(xì)胞的計(jì)數(shù)，并調(diào)細(xì)胞數(shù)在1?5X103/ml取130個(gè)細(xì)胞放入6。5ml含飼養(yǎng)細(xì)胞完全培養(yǎng)液，即20個(gè)細(xì)胞/ml,100口l/孔加A、B、C三排為每孔2個(gè)細(xì)胞。余下2.9ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.9ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液，細(xì)胞數(shù)為10個(gè)/ml,100Hl/孔加D、E、F三排，為每孔1個(gè)細(xì)胞.余下2。2ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.2ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液，細(xì)胞數(shù)5個(gè)/ml,100Hl/孔，加G、H兩排，為每孔0.5個(gè)細(xì)胞.培養(yǎng)4~5天后，在倒置顯微鏡上可見(jiàn)到小的細(xì)胞克隆，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液200Hl/孔。第8?9天時(shí)，肉眼可見(jiàn)細(xì)胞克隆，及時(shí)進(jìn)行抗體檢測(cè)。注:初次克隆化的雜交瘤細(xì)胞需要在完全培養(yǎng)液中加HT。軟瓊脂法軟瓊脂的配制含20%FCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI16401％瓊脂水溶液:高壓滅菌,42℃預(yù)熱。0。5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。用上述0。5%瓊脂液（含有飼養(yǎng)細(xì)胞）15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。按100/ml,500/ml或5000/ml等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液.④1ml0。5%瓊脂液（42℃預(yù)熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細(xì)胞懸液相混合.混勻后立即傾注于瓊脂基底層上,在室溫中10分鐘,使其凝固,孵育于37℃,5%CO2孵箱中。⑥4?5天后即可見(jiàn)針尖大小白色克隆，7?10天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板中進(jìn)行培養(yǎng).⑦檢測(cè)抗體，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要時(shí)再克隆化。雜交瘤細(xì)胞的凍存及時(shí)凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞、每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的。因?yàn)樵跊](méi)有建立一個(gè)穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時(shí)候，細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中隨時(shí)可能發(fā)生細(xì)胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒(méi)有原始細(xì)胞的凍存，則因?yàn)樯鲜龅囊馔舛ΡM棄。雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含1X106以上，但對(duì)原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),當(dāng)長(zhǎng)滿孔底時(shí)，一孔就可以凍一支安瓿。細(xì)胞凍存液:50％小牛血清40％不完全培養(yǎng)液10%口忖50（二甲亞砜）凍存液最好預(yù)冷，操作動(dòng)作輕柔、迅速。凍存時(shí)從室溫可立即降到0℃,再降溫時(shí)一般按每分鐘降溫2?3℃,待降至-70℃可放入液氮中。或細(xì)胞管降至0℃后放—70℃超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可以用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長(zhǎng)時(shí)間。五、單克隆抗體的大量生產(chǎn)大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為10?60口g/ml,如果大量生產(chǎn)，費(fèi)用較高。體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清。①實(shí)體瘤法對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞按1~3X107/ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0。2ml,共2?4點(diǎn)。待腫瘤達(dá)到一定大小后（一般10?20天）則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達(dá)到1—10mg/ml。但采血量有限。②腹水的制備常規(guī)是先腹腔注射0.5mlPristane（降植烷）或液體石臘于BaLb/c鼠，1?2周后腹腔注射1X106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7?10天后可產(chǎn)生腹水,密切觀察動(dòng)物的健康狀況與腹水征象,待腹水盡可能多,而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1?10ml腹水。也可用注射器抽取腹水,可反復(fù)收集數(shù)次.腹水中單克隆抗體含量可達(dá)5-20mg/ml,這是目前最常用的方法,還可將腹水中細(xì)胞凍存起來(lái),復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。六、單克隆抗體的鑒定對(duì)制備的McAb進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的。應(yīng)對(duì)其做如下方面的鑒定：抗體特異性的鑒定：除用免疫原（抗原）進(jìn)行抗體的檢測(cè)外,還應(yīng)用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進(jìn)行交叉試驗(yàn)，方法可用ELISA、IFA法。例如①制備抗黑色素瘤細(xì)胞的McAb,除用黑色素瘤細(xì)胞反應(yīng)外，還應(yīng)用其它臟器的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行交叉反應(yīng),以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。②制備抗重組的細(xì)胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達(dá)菌株的蛋白有交叉反應(yīng),其次是與其它細(xì)胞因子間有無(wú)交叉。McAb的Ig類與亞類的鑒定:一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行篩選時(shí)，已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型.如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測(cè)出來(lái)的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴(kuò)或夾心ELISA來(lái)確定McAb的亞類。在作雙擴(kuò)試驗(yàn)時(shí),如加入適量的PEG(3%),將有利于沉淀線的形成。McAb中和活性的鑒定：用動(dòng)物的或細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定McAb的生物學(xué)活性。例如如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時(shí)接種于易感的動(dòng)物或敏感的細(xì)胞，來(lái)觀察動(dòng)物或細(xì)胞是否得到抗體的保護(hù).McAb識(shí)別抗原表位的鑒定:用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)、測(cè)相加指數(shù)的方法,測(cè)定McAb所識(shí)別抗原位點(diǎn),來(lái)確定McAb的識(shí)別的表位是否相同。McAb親和力的鑒定：用ELISA或RIA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)來(lái)確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親和力。七、影響因素、失敗原因分析由于制備McAb的實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，環(huán)節(jié)多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會(huì)造成失敗.其主要失敗原因和影響因素有:污染：包括細(xì)菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中最辣手的問(wèn)題。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應(yīng)及早將污染板棄之，以免污染整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境。支原體的污染主要來(lái)源于牛血清，此外，其它添加劑、實(shí)驗(yàn)室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。在有條件的實(shí)驗(yàn)室，要對(duì)每一批小牛血清