細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理與技術(shù)

關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理與技術(shù)第一章細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理與技術(shù)

體外培養(yǎng)的概念細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程細(xì)胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境常用培養(yǎng)器皿及清洗消毒第2頁,共46頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞培養(yǎng)意義

現(xiàn)代生物技術(shù)一般認(rèn)為包括基因工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)、酶工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)，而這些技術(shù)的發(fā)展幾乎都與細(xì)胞培養(yǎng)有密切關(guān)系，特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)更具有特殊的作用和價值。比如基因工程藥物或疫苗在研究生產(chǎn)過程中很多是通過細(xì)胞培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)的?；蚬こ桃腋我呙绾芏嗍且訡HO細(xì)胞作為載體；細(xì)胞工程中更是離不細(xì)胞培養(yǎng)，雜交瘤單克隆抗體，完全是通過細(xì)胞培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)的，既使是現(xiàn)在飛速發(fā)展的基因工程抗體也離不開細(xì)胞培養(yǎng)。第3頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)體外培養(yǎng)的概念

一、基本概念體外培養(yǎng)（invitroculture），就是將活體結(jié)構(gòu)成分或活的個體從體內(nèi)或其寄生體內(nèi)取出，放在類似于體內(nèi)生存環(huán)境的體外環(huán)境中，讓其生長和發(fā)育的方法。

第4頁,共46頁，2024年2月25日，星期天組織培養(yǎng)：是指從生物體內(nèi)取出活的組織（多指組織塊）在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。細(xì)胞培養(yǎng)：是指將活細(xì)胞（尤其是分散的細(xì)胞）在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。

器官培養(yǎng)：是指從生物體內(nèi)取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。

第5頁,共46頁，2024年2月25日，星期天胎腎的培養(yǎng)植物組織的培養(yǎng)培養(yǎng)的hela細(xì)胞第6頁,共46頁，2024年2月25日，星期天人類胚胎干細(xì)胞培育出立體視網(wǎng)膜組織培養(yǎng)中的上皮細(xì)胞

第7頁,共46頁，2024年2月25日，星期天二、體內(nèi)、外細(xì)胞的差異和分化1.差異：細(xì)胞離體后，失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間的相互影響，生活在缺乏動態(tài)平衡相對穩(wěn)定環(huán)境中，易發(fā)生如下變化：分化現(xiàn)象減弱形態(tài)功能趨于單一化發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性，變成可無限生長的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系第8頁,共46頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞在體內(nèi)組織條件的狀態(tài)體外培養(yǎng)的細(xì)胞第9頁,共46頁，2024年2月25日，星期天2.分化：體外培養(yǎng)的細(xì)胞分化能力并未完全喪失，只是環(huán)境的改變，細(xì)胞分化的表現(xiàn)和在體內(nèi)不同細(xì)胞是否表現(xiàn)分化,關(guān)鍵在于是否存在使細(xì)胞分化的條件Friend細(xì)胞（小鼠紅白血病細(xì)胞）在一定的因素作用下可以合成血紅蛋白，血管內(nèi)皮細(xì)胞在類似基膜物質(zhì)底物上培養(yǎng)時能長成血管狀結(jié)構(gòu)第10頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程準(zhǔn)備工作取材培養(yǎng)凍存及復(fù)蘇常用儀器設(shè)備第12頁,共46頁，2024年2月25日，星期天一、準(zhǔn)備工作

準(zhǔn)備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試。第13頁,共46頁，2024年2月25日，星期天二、取材在無菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞（視實(shí)驗?zāi)康亩ǎ?jīng)過一定的處理（如消化分散細(xì)胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中。如是細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng)則無取材這一過程。機(jī)體取出的組織細(xì)胞的首次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。

第14頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共46頁，2024年2月25日，星期天各種動物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實(shí)際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。第16頁,共46頁，2024年2月25日，星期天三、培養(yǎng)將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中組織塊培養(yǎng)，則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個小時后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)，一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細(xì)胞數(shù)表示）接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞盡早進(jìn)入生長狀態(tài)。第17頁,共46頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)中的細(xì)胞應(yīng)每隔一定時間觀察一次，觀察的內(nèi)容包括細(xì)胞是否生長良好，形態(tài)是否正常，有無污染，培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示），此外對培養(yǎng)溫度和CO2濃度也要定時檢查。

第18頁,共46頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞狀態(tài)第19頁,共46頁，2024年2月25日，星期天原代培養(yǎng)一般有一段潛伏期（數(shù)小時到數(shù)十天不等）在潛伏期細(xì)胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過了潛伏期后細(xì)胞進(jìn)入旺盛的分裂生長期。細(xì)胞長滿瓶底后要進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將一瓶中的細(xì)胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為“一代”

第20頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第21頁,共46頁，2024年2月25日，星期天四、凍存及復(fù)蘇為了保存細(xì)胞，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株，要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度－196℃，方法：將細(xì)胞收集至凍存管中加入含保護(hù)劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中第22頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第23頁,共46頁，2024年2月25日，星期天五、常用儀器設(shè)備無菌室,超凈工作臺,三重純水蒸餾器,抽氣泵,壓力蒸氣消毒器,電熱恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)器具，CO2培養(yǎng)箱,恒溫水浴鍋,倒置顯微鏡,離心機(jī),無菌過濾器,洗刷裝置,細(xì)胞計數(shù)板等等。第24頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境

無菌室超凈工作臺

第26頁,共46頁，2024年2月25日，星期天無菌室無菌室的結(jié)構(gòu)：一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。

無菌室的消毒和防污染：為保持無菌狀態(tài)，經(jīng)常消毒是必要的，通常采用，每天用紫外照射，每周甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸和每月新潔爾滅擦拭地面第27頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共46頁，2024年2月25日，星期天表：我國無菌室的級別

空氣潔凈度級別≥0.5μm的微粒數(shù)個/m3≥5μm的微粒數(shù)個/m3沉降菌（90mm皿，沉降0.5h）菌落/皿浮游菌個/m31001萬10萬≤3500≤350000≤35000000≤2000≤20000≤1≤3≤10≤5≤100≤50030萬級≤10500000≤60000≤15—返回第29頁,共46頁，2024年2月25日，星期天二、超凈工作臺

超凈臺的使用與保養(yǎng)：超凈臺的平均風(fēng)速保持在0.32-0.48米/秒為宜，過大、過小均不利于保持凈化度；使用前最好開啟超凈臺內(nèi)紫外燈照射10－30分鐘使用完畢后要用70%酒精將臺面和臺內(nèi)四周擦拭干凈，以保證超凈臺無菌。還要定期用福爾馬林熏蒸超凈臺。第30頁,共46頁，2024年2月25日，星期天風(fēng)向：水平和垂直第31頁,共46頁，2024年2月25日，星期天生物安全柜第32頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)常用培養(yǎng)器皿及清洗消毒

清洗消毒和滅菌第33頁,共46頁，2024年2月25日，星期天一、清洗離體條件下，有害物質(zhì)直接同細(xì)胞接觸，細(xì)胞對任何有害物質(zhì)十分敏感，極少殘留物都可以對細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必須認(rèn)真清洗，達(dá)到不含任何殘留物的要求。第34頁,共46頁，2024年2月25日，星期天（一）玻璃器皿的清洗一般經(jīng)過浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四個步驟。

1.浸泡:新的或用過的玻璃器皿要先用清水浸泡，軟化和溶解附著物。新玻璃器皿使用前得先用自來水簡單刷洗，然后用5％鹽酸浸泡過夜；用過的玻璃器皿往往附有大量蛋白質(zhì)和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后應(yīng)立即浸入清水中備刷洗。第35頁,共46頁，2024年2月25日，星期天2.刷洗:將浸泡后的玻璃器皿放到洗滌劑水中，用軟毛刷反復(fù)刷洗。不要留死角，并防止破壞器皿表面的光潔度。將刷洗干凈的玻璃器皿洗凈、晾干，備浸酸。第36頁,共46頁，2024年2月25日，星期天3.浸酸:浸酸是將上述器皿浸泡到清潔液中，又稱酸液，通過酸液的強(qiáng)氧化作用清除器皿表面的可能殘留物質(zhì)。浸酸不應(yīng)少于六小時，一般過夜或更長。放取器皿要小心。第37頁,共46頁，2024年2月25日，星期天4.沖洗:刷洗和浸酸后的器皿都必須用水充分沖洗，浸酸后器皿是否沖洗的干凈，直接影響到細(xì)胞培養(yǎng)的成敗。手工洗滌浸酸后的器皿，每件器皿至少要反復(fù)“注水－倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干后包裝備用。第38頁,共46頁，2024年2月25日，星期天（二）橡膠制品清洗

新的橡膠制品洗滌方法：0.5mol/LNaOH煮沸15分鐘，流水沖洗，0.5mol/LHCl煮沸15分鐘，流水沖洗，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50℃烤干備用。第39頁,共46頁，2024年2月25日，星期天（三）塑料制品的清洗

塑料制品特點(diǎn)：質(zhì)軟、易出現(xiàn)劃痕；耐腐蝕能力強(qiáng)、但不耐熱。

清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來水過夜，用紗布或棉簽和50℃清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液15分鐘，流水沖洗（15－20遍）,蒸餾水浸洗三次，雙蒸水泡24小時，晾干備用。

第40頁,共46頁，2024年2月25日，星期天（四）包裝:對細(xì)胞培養(yǎng)用品進(jìn)行消毒前，要進(jìn)行嚴(yán)密包裝，以便于消毒和貯存。常用的包裝材料：牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、較大培養(yǎng)皿等，近幾年用鋁箔包裝，非常方便，適用。培養(yǎng)皿、注射器、金屬器械等用牛皮紙包裝后再裝入飯盒內(nèi)，較大的器皿可以進(jìn)行局部包扎。第41頁,共46頁，2024年2月25日，星期天二、消毒和滅菌（一）物理消毒法

1.紫外線消毒:紫外線是一種低能量的電磁輻射，可殺死多種微生物。革蘭陰性菌最為敏感，其次是陽性菌，再次為芽孢，真菌孢子的抵抗力最強(qiáng)。紫外線的直接作用是通過破壞微生物的核酸及蛋白質(zhì)等而使其滅活，間接作用是通過紫外線照射產(chǎn)生的臭氧殺死微生物。直接照射培養(yǎng)室消毒，用法簡單，效果好。第42頁,共46頁，2024年2月25日，星期天2.高溫濕熱滅菌:壓力蒸汽滅菌是最常用的高溫濕熱滅菌方法。對生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白質(zhì)變性凝固而使微生物死亡。布類、物、璃器皿、屬器皿、膠和某些培養(yǎng)液都可以用這方法滅菌。

第43頁,共46頁，2024年2月25日，星期天3.高溫干熱消毒:干熱滅菌主要是將電熱烤箱內(nèi)物品加熱到160℃以