轉基因植物的遺傳特性與表達調控

關于轉基因植物的遺傳特性與表達調控一、轉基因植物中外源DNA的整合特性1、外源DNA的整合位點和拷貝數(shù)（1）整合位點：轉基因導入植物細胞后，通過細胞分裂時遺傳物質的復制過程整合到核基因組中，目前普遍認為，轉基因在寄主染色體內的整合位點是隨機的,外源DNA可以插入植物基因組的任何一條染色體，也可以插入一條染色體的任何位點或沒有固定的插入位點，但往往對轉錄活躍區(qū)域具有優(yōu)先插入特性。（2）整合拷貝數(shù)：許多研究表明，外源DNA的插入拷貝數(shù)有以下幾種：單拷貝單位點插入；串聯(lián)多拷貝單位點插入；多拷貝多位點插入，多數(shù)情況是以單拷貝在單位點整合，但在同一位點，也存在較多的多個拷貝串聯(lián)整合的情況。形式為頭對尾式串聯(lián)和頭對頭式串聯(lián)。農(nóng)桿菌轉化和基因直接轉化整合拷貝數(shù)存在差異，前者拷貝數(shù)少，整合位點特異性強。第2頁,共25頁，2024年2月25日，星期天2、外源DNA結構對整合的影響

外源DNA結構分為四種類型：單鏈線形DNA、單鏈環(huán)形DNA、雙鏈線性DNA及雙鏈環(huán)形DNA。四種結構中單鏈線狀DNA研究較多，一般認為單鏈DNA可以通過有效的不正常整合參與同源染色體序列的重組，研究認為單鏈DNA在單鏈完全變成雙鏈之前已發(fā)生重組。此外Bilang等（1992）研究了導入煙草的DNA結構（線形和環(huán)形）的重組效率，結果表明線性單鏈DNA同環(huán)形單鏈DNA相比，其抗性愈傷組織數(shù)目要高于后者，說明線性DNA的整合效率要高于環(huán)形DNA。第3頁,共25頁，2024年2月25日，星期天3、轉化后整合位點的DNA結構變化

保持整合外源基因的完整性是實現(xiàn)轉基因功能表達的基本條件，外源基因整合后的完整性與其結構變化有關，現(xiàn)已明確，外源基因作為侵入者的整合，會引起不同程度的基因重排，涉及缺失、異位、倒位及重復等一系列現(xiàn)象。這主要與細胞本身的重復和修復功能有關。

Mayerhofer等（1991）和Gheysen等（1991）對15個獨立的T-DNA插入進行了研究，提出了外源DNA整合模型，他們認為：（1）T-DNA的插入不會引起植物DNA大的重排，但在T-DNA的兩側各出現(xiàn)了一個158bp的正向重復序列，且多數(shù)插入會導致靶位點處小的缺失，最多79個核苷酸；（2）在T-DNA和植物DNA連接處常有幾個至33個核苷酸的填充DNA，這些填充序列與靠近連接處的植物DNA序列相似；（3）在靶位點處不要求有特異的序列，但若T-DNA兩端與植物靶位點之間有一段短序列（5-10bp）同源，則可能對T-DNA整合進植物基因組其作用。

此外，插入植物染色體的外源DNA大小是有限制的，如油菜插入外源DNA為5-6Kb，煙草中最大可達9Kb，但頻率較低。第4頁,共25頁，2024年2月25日，星期天4、轉化方法對整合外源基因結構的影響

盡管轉化方法較多，但外源DNA以兩種分子形式轉化，一種是外源DNA插入T-DNA質粒載體中導入；另一種是裸露的DNA分子直接導入，由于轉化原理不同，因此與整合后的外源DNA結構必然存在直接關系。（1）T-DNA轉化的外源DNA結構變化農(nóng)桿菌介導轉化細胞中T-DNA結構完整，整合位點穩(wěn)定，多數(shù)情況下在25bp處與植物DNA連接，整合后的外源基因結構變異少，但外源DNA也會出現(xiàn)結構變化，表現(xiàn)為T-DNA的串聯(lián)和截短現(xiàn)象。

T-DNA串聯(lián)：通常有5-20個拷貝的T-DNA的首尾相聯(lián)，在大多數(shù)整合事件中，T-DNA可以在無選擇壓的情況下串聯(lián)起來。

T-DNA截短：也是T-DNA轉化時較多發(fā)生的結構變化，可能是由于T-DNA兩側各有一個25bp的邊界類似序列。截短是在轉移和整合過程中產(chǎn)生，由于T-DNA區(qū)內‘框類似’序列的存在，被用作引導T-DNA轉移和整合的次級識別位點，從而代替正常情況下的25bp右邊界序列，所以正常的有邊界序列被截短。截短在共整合載體中比二元載體系統(tǒng)更易發(fā)生。第5頁,共25頁，2024年2月25日，星期天（2）裸露DNA直接轉化的外源DNA結構變化

采用裸露DNA直接轉化時，整合的外源DNA往往出現(xiàn)復雜的雜交圖譜，在轉化當代及子代中常出現(xiàn)DNA環(huán)化、甲基化、片段分離和丟失等現(xiàn)象。在DNA直接轉化中供體DNA容易在整合過程中發(fā)生各種結構變化和修飾，而且植物靶DNA序列也可在供體DNA整合過程中發(fā)生重排。第6頁,共25頁，2024年2月25日，星期天5、位點特異重組（1）位點特異性重組系統(tǒng)

遺傳重組分為3類：同源重組，轉座和位點特異性重組，也稱定位重組。同源重組發(fā)生在兩個具有一定程度同源性的DNA分子之間或同一分子的兩個同源性區(qū)域，它們相互重組。轉座和位點特異重組的共同點是重組只發(fā)生于具有特定的DNA序列的位置上，由特定的酶來識別某一種DNA序列，而造成重排。二者的區(qū)別在于轉座重組中，識別位點之間的DNA片段被轉位插入到另外的位點，是DNA合成過程中伴隨而發(fā)生的DNA斷裂、轉移和插入。而定位重組并不涉及DNA的凈合成，在兩個識別位點之間的DNA片段并不轉移到基因組中的另一地方，這段DNA是在重組酶所識別的位點上進行重組、交換而被切除或發(fā)生倒置，該定位系統(tǒng)越來越多地應用于轉基因植物中，以改造基因重排，去除不需要的篩選基因、激活或缺失某一表達基因。第7頁,共25頁，2024年2月25日，星期天

目前發(fā)現(xiàn)的有4個定位重組系統(tǒng)，Cre/lox、FLP/FRT、R/RS和Gin/gix。（2）位點特異性重組的作用機制

以Cre/lox為例加以說明，Cre來源于噬菌體P1，P1基因組中有1029bp的一段DNA，編碼343氨基酸的38.5kDa的蛋白質，即一種重組酶。該酶在離體系統(tǒng)中以含loxP基因座的DNA序列為底物，高效地使線狀、環(huán)狀甚至超螺旋DNA發(fā)生重組反應，而產(chǎn)生功能。當兩個loxP基因座方向相同，Cre介導的反應造成loxP基因座之間的DNA被刪除，loxP基因座方向相反，Cre介導使兩端攜帶loxP的片段發(fā)生倒位，如果loxP不在同一DNA分子，如一個在質粒上，另一個在染色體上，那么Cre酶可使質粒DNA整合到染色體loxP所在位置，實現(xiàn)定點重組。第8頁,共25頁，2024年2月25日，星期天四類定位重組系統(tǒng)的分子重組程序分以下幾步：A重組酶識別并結合重組位點的反向重復序列，每一反向重復序列結合一個重組酶；B在重組酶作用下，兩個重組位點發(fā)生通向聯(lián)會；C聯(lián)會后兩個重組位點的DNA一條鏈在重組酶的作用下斷裂，并通過3′-PO4與重組酶的Tyr（酪氨酸）的游離-OH相連，保存了DNA斷裂時的能量；D重組酶的斷裂鏈與另一位點處斷裂的5′-OH端相連，此時兩DNA鏈的一條分別與對方交叉相連；E交叉相連的DNA鏈經(jīng)旋轉形成Holliday中間體；FHolliday中間體分枝遷移數(shù)個堿基后，另一條鏈再斷裂并與對方的斷裂鏈重組，這時就完成重組，實現(xiàn)了交換。第9頁,共25頁，2024年2月25日，星期天第10頁,共25頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共25頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共25頁，2024年2月25日，星期天（3）位點特異性重組在轉基因整合遺傳特性研究中的應用

A控制轉基因整合的拷貝數(shù)；

B可導入多個基因進入植物基因組；

C使目標基因重排；

D激活目標基因；

E定點轉化植物；

F基因克隆第13頁,共25頁，2024年2月25日，星期天二、轉基因植物中外源DNA整合的遺傳效應1、位置效應：在同一實驗中獲得的不同轉化植株，外源基因的表達水平存在很大差異，這主要是由于外源基因在染色體上插入的位點不同而造成，這種現(xiàn)象稱為位置效應。外源基因插入位點的位置效應也可引起轉基因的失活，其原因可能是插入位點周圍的DNA序列組成起重要作用。位置效應的明顯表現(xiàn)是外源基因的整合位置對表達頻率的影響。目前的轉化方法通常導致轉基因在宿主細胞中隨機整合，因此位置效應是轉基因表達不一致的主要原因之一。第14頁,共25頁，2024年2月25日，星期天2、重組效應：

轉基因容易被植物基因組存在的重組和修復系統(tǒng)識別，致使轉基因不同程度的重排，轉基因同源和非同源重組必然引起DNA的易位，缺失、重復等一系列結構變化。外源基因結構變化甚至不同位點堿基序列的變化對其表達的影響不同，表現(xiàn)為DNA重組的多樣性：正效應、負效應及無影響等狀態(tài)。第15頁,共25頁，2024年2月25日，星期天3、轉基因沉默

外源基因在轉基因植物中表達受到抑制的現(xiàn)象稱為轉基因沉默，轉基因沉默是遺傳工程走向應用的潛在障礙，成為基因工程中的重要問題。（1）轉基因沉默的機理概述

20世紀80年代后期，基因沉默主要涉及到轉基因與轉基因之間或轉基因與內源基因之間的互作，認為沉默的來源于多拷貝的同源DNA序列，這些序列指蛋白質編碼區(qū)，啟動子或兩者皆有。已提出三種基因沉默模型：順式失活；即多拷貝，串聯(lián)基因的導入常常導致倒位或直接重復引起失活；反式失活；可以看作順式失活的副產(chǎn)品，指因順式作用失活的轉基因可以作為一種沉默子，使獨立DNA分子上的同源靶基因引起相似水平的甲基化和失活；共抑制或有義抑制，涉及到一個轉基因與一個同源的內源基因或兩個同源的轉基因之間的協(xié)同沉默。三種模型均涉及核酸互作而引起的變化，如DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA等。轉基因沉默主要發(fā)生在兩個階段，一是發(fā)生在轉錄水平；二是發(fā)生在轉錄后水平上。第16頁,共25頁，2024年2月25日，星期天（2）轉錄水平的基因沉默

A轉基因及其啟動子甲基化；B多拷貝重復基因序列引起的轉錄水平基因沉默；

C同源基因間的反式失活；

D轉基因位置效應引起的轉基因沉默；

E染色體包裝對轉基因沉默的影響；

F后成修飾作用導致轉基因沉默。第17頁,共25頁，2024年2月25日，星期天（3）轉錄后水平的轉基因沉默A生化開關模型；B異常RNA模型；C反義RNA模型；DRNA介導的病毒抗性模型；（4）從頭甲基化與沉默機制

A植物對外源DNA的基因免疫誘導反應；

BDNA-DNA配對誘導；

CDNA-DNA互作誘導。第18頁,共25頁，2024年2月25日，星期天4.克服轉基因沉默的策略

(1)轉基因的選擇：（2）啟動子的選擇；（3）利用組織和發(fā)育特異性作用的增強子（4）利用MAR序列；（5）利用位置特異性重組系統(tǒng)；（6）選擇單拷貝的轉化體。第19頁,共25頁，2024年2月25日，星期天三、轉基因植物中外源基因的遺傳特性

通過轉基因技術導入受體細胞的外源基因（transgene）進入受體細胞后，其整合、表達和傳遞規(guī)律通常利用表性傳遞、標記基因及分子雜交分析等方法進行研究。1.外源基因在轉化植物中的遺傳傳遞規(guī)律（1）孟德爾式分離:1984年David報道，發(fā)根農(nóng)桿菌介導的胡蘿卜、煙草和牽?；ㄞD基因植株表型分析和Southern雜交證明，后代中顯性位點的遺傳為真實的孟德爾式遺傳。

第20頁,共25頁，2024年2月25日，星期天單位點插入外源基因：大多數(shù)轉化植株中，轉基因呈單基因顯性的孟德爾式分離。轉基因有可能作為一個單個顯性基因在轉基因植株中遺傳，相對于轉基因來說，植物同源染色體中沒有其相對的等位基因位點，因此轉基因一般呈顯性遺傳。單位點插入無論是單拷貝還是多拷貝串聯(lián)，在不超過一定長度時，大多數(shù)轉基因植株中外源基因能夠穩(wěn)定遺傳并顯示孟德爾單基因分離規(guī)律。

B.多位點插入外源基因：

Akama等（1992）在擬南芥中發(fā)現(xiàn)R1代植株中有10株抗性分離比為3R:1S，3株為15R：1S，1個株系為63R：1S。表明多數(shù)情況下外源基因為單位點插入，但也存在二、三個位點插入。進一步對124個轉化株進行分子雜交，分析T-DNA的拷貝數(shù)，拷貝數(shù)為1、2、3個T-DNA者分別為44%、28%和10%，即90%插入拷貝數(shù)在4個一下，也有10個拷貝的個體。在44個轉KM抗性基因的煙草中，通過轉基因植株自交、轉化與非轉化雜交、轉化株雜交進行分析，發(fā)現(xiàn)35個無性系包含一個單位點插入KM抗性基因，其余5個為兩位點插入，且觀察到雙位點插入導致自交后代中出現(xiàn)隱形致死突變。多基因轉化植株后代分離規(guī)律與其整合特性密切相關，多基因連鎖形式整合到一個位點，其符合單基因的孟德爾式分離規(guī)律；如分別整合到不同位點，那么每個基因的分離符合孟德爾式規(guī)律，各個基因間不影響。第21頁,共25頁，2024年2月25日，星期天（2）非孟德爾遺傳現(xiàn)象：轉基因植株后代分離中，普遍存在顯性個體明顯不符合孟德爾比例的現(xiàn)象，成為非孟德爾遺傳現(xiàn)象。后代顯性個體比例明顯低于3：1，此外在自交二代中，由于轉基因的失活、純合致死等未知原因而未出現(xiàn)純合體。轉基因丟失：如小麥轉化株系中，自交一代能表達，自交二代僅能檢測到，自交三代中發(fā)生了丟失。B.轉基因沉默：轉化體仍保留完好的轉基因但不表達或表達活性低，或發(fā)生重排而不表達，導致后代分離規(guī)律的異常。C.轉基因逃逸：采用酶活性檢測得到的3：1的分離中，部分轉化體中僅有20%含目標基因片段，因此需采用標記選擇、表達分析及分子檢測相結合的方法檢測轉話體。D.花粉致死：當以轉化體為父本與非轉化體回交時，只產(chǎn)生非轉化體，而非1：1的分離，其原因可能是花粉致死。E.誘導