菌種鑒定流程

關(guān)于菌種鑒定流程12005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室2菌種分離鑒定流程增菌分純初步鑒別試驗革蘭染色生化試驗酶類試驗抗生素敏感性試驗（用于菌種鑒定）全面鑒定血清分型毒素分析基因分型蛋白組分析自動化儀器分析（生化，酶學，基因序列等）第2頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室32供試品的制備參看藥典微生物限度檢查法有抑菌活性的檢品應(yīng)進行預處理稀釋法離心沉淀集菌法3000r/min離心30min，有不溶性沉渣先500r/min離心5min薄膜過濾法0.45um±0.02100ml中和法磺胺類100ml中1~5ml1%對氨基苯甲酸；砷汞，硫乙醇酸鹽；洗必泰，聚山梨醇酯80自然沉降法難溶于水的抗菌制劑同時做陽性和陰性對照了解常用的培養(yǎng)方法和常用培養(yǎng)基上各控制菌菌落特征，知道如何進行菌種分純，以便于進行下面的試驗第3頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室43革蘭染色、鏡檢3.1操作步驟3.1.1制片-過火固定，避免水沖，破壞細胞結(jié)構(gòu)使染料易透過3.1.2結(jié)晶紫染色-1分3.1.3碘液媒染-1分3.1.4乙醇脫色-30秒3.1.5沙黃復染-30秒第4頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室53.2染色結(jié)果革蘭陽性菌呈藍紫色；革蘭陰性菌呈紅色。可以分別用金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌作質(zhì)控株第5頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室63.3革蘭染色注意事項3.2.1玻片必須潔凈3.2.2涂片菌量宜少，菌不可濃3.2.3新鮮培養(yǎng)物3.2.4脫色是關(guān)鍵第6頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室73.3革蘭染色意義3.3.1初步識別細菌，利于進一步鑒定3.3.2初步選擇治療用藥物3.3.3與致病性相關(guān)，陽性以外毒素為主，陰性菌以內(nèi)毒素為主第7頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室84觸酶試驗觸酶試驗不應(yīng)當在含血的碟子上（用上面的菌落試驗應(yīng)小心）進行因為紅細胞中含有觸酶可能導致假陽性出現(xiàn)用于檢測細菌是否生成過氧化氫酶，是否利于在有氧環(huán)境中生長細菌在有環(huán)境中代謝可以生成超氧離子和過氧化氫，具有殺菌作用，能生成觸酶的菌種容易耐氧。但厭氧菌有產(chǎn)生觸酶者，某些非厭氧菌觸酶也不產(chǎn)生（鏈球菌，此試驗可用于菌種鑒別）第8頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室9第9頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室105氧化酶試驗5.1試驗方法：濾紙，無菌玻璃棒，1滴新配制的1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液5.2結(jié)果判定：30s，培養(yǎng)物出現(xiàn)粉紅色逐漸變?yōu)樽霞t色，即為氧化酶試驗陽性反應(yīng)。若培養(yǎng)物不變色或僅顯粉色為陰性反應(yīng)第10頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室11試驗陽性圖示第11頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室125.3氧化酶試驗注意事項5.3.1試驗菌落(苔)必須新鮮，陳舊培養(yǎng)物反應(yīng)不可靠5.3.2試驗避免與鐵、鎳等金屬接觸，否則易出現(xiàn)假陽性。宜用玻璃棒或木棒5.3.3試劑宜新鮮配制，放置過久，二鹽酸二甲基對苯二胺氧化變色不可用5.3.4反應(yīng)需在有氧條件下進行，勿滴加試劑過多，以免浸泡培養(yǎng)物使之與空氣隔絕，造成假陰性反應(yīng)5.3.5含糖培養(yǎng)基上的菌落不適于做氧化酶試驗，因為糖分解產(chǎn)酸抑制氧化酶活性第12頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室136血漿凝固酶試驗簡介主要用于金黃色葡萄球菌的鑒定分為兩大類，結(jié)合凝固酶和游離凝固酶檢測以試管法為參考方法第13頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室146凝固酶試驗操作方法無菌試管(10×100mm)3支，加入血漿和0.9%無菌氯化鈉溶液(1：1)各0.5ml，1支加入被檢菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌懸液0.5ml，作為檢品管；其余2支作對照管：1支加入金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌懸液0.5ml作為陽性對照；另一支加入營養(yǎng)肉湯或0.9%無菌氯化鈉溶液0.5ml作陰性對照三管同時置36±1℃水浴或恒溫培養(yǎng)箱，3h后開始檢查，以后每隔適當時間觀察一次，直至24h第14頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室156凝固酶試驗的注意事項血漿凝固酶試驗應(yīng)用新鮮培養(yǎng)物及新鮮血漿。如用陳舊培養(yǎng)物及血漿(纖維蛋白常已析出)易導致假陰性反應(yīng)用試管法檢查時，輕輕將試管傾斜，(動作勿大，防止江凝塊搖碎)仔細觀察試驗時間過長容易導致假陰性第15頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室166凝固酶試驗的結(jié)果判定陰性對照管血漿流動自如，陽性對照管液呈凝固狀，試驗管液呈凝固者為陽性反應(yīng)；不凝固為陰性反應(yīng)。陽性對照管和陰性對照管任何一管不符合要求時，應(yīng)另制備血漿，重新試驗?zāi)壳吧唐坊哪堂冈噭┒嗉椅⑸锵嚓P(guān)制劑公司有售，試劑具有較好的穩(wěn)定性、準確性第16頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室177生化試驗細菌鑒定的傳統(tǒng)方法，參考方法因為針對不同菌種，選擇有針對性的生化試驗進行，菌種不同所作的試驗不同，藥品檢驗中常用的種類不再一一介紹，所以在以后各菌種鑒定內(nèi)容當中單獨討論所有試驗都需要已知陽性和陰性的菌株作為質(zhì)控菌株，定期對試劑、培養(yǎng)基（包括培養(yǎng)基的靈敏度試驗）以及試驗操作過程進行質(zhì)控試驗，保證結(jié)果解釋的準確性第17頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室188自動化儀器優(yōu)點：包含的菌種的生物學特性測試試驗種類更多，可以提高菌種鑒定的準確率縮短菌種鑒定所需要的時間，為檢品的快速檢驗提供保證細菌鑒定的酶學技術(shù)以及近紅外技術(shù)等其他鑒定方法應(yīng)用的研究將為藥品微生物鑒定提供更多的選擇和便利第18頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室19B-D公司的phenix系統(tǒng)、生物梅里埃公司的VITEK系統(tǒng)等第19頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室20生化鑒定第20頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室21一、大腸桿菌檢查法第21頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室221簡述大腸桿菌即大腸埃希菌（Escherichia

coli），為腸桿菌科埃希菌屬的模式種。埃希菌屬除大腸埃希菌外，還有蟑螂埃希菌等四個種大腸埃希菌是人和溫血動物腸道內(nèi)的棲居菌，隨糞便排出體外。在藥品中檢出大腸桿菌，表明該樣品受到人和溫血動物的糞便污染，即可能污染腸道病原體。為保證人體健康，口服藥品必須檢查大腸桿菌大腸埃希菌除普通大腸桿菌外尚有致病性大腸桿菌、產(chǎn)毒性大腸桿菌、溶血性大腸桿菌、侵襲性大腸桿菌等，可引起嬰幼兒、成人爆發(fā)性腹瀉、結(jié)膜炎等病癥第22頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室232對照用菌液菌種為大腸桿菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）44102］對照菌液加入量含菌50～100cfu（一般用量為0.1ml）制作方法：營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，接種至5ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，36±1℃培養(yǎng)18～24h后，用0.9％無菌氯化鈉溶液稀釋至1：106其用途：做陽性對照檢查培養(yǎng)基靈敏度第23頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室243操作步驟第24頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室253.1增菌培養(yǎng)取膽鹽乳糖（ＢＬ）培養(yǎng)基3瓶，每瓶各100ml2瓶分別加入規(guī)定量的供試液，其中1瓶加入含對照菌50～100個菌落形成單位的控制菌菌液作陽性對照，第3瓶加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對照37℃培養(yǎng)18～24h（必要時可延至48h）。陰性對照應(yīng)無菌生長。搖勻上述BL增菌培養(yǎng)液第25頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室263.2MUG試驗原理4-甲基傘形酮葡糖苷酸（MUG）試驗的原理MUG被β-葡糖苷酸酶（GUD）水解，產(chǎn)生熒光實驗證明96％的大腸桿菌含GUD，約10％的沙門菌屬一些菌種也含有此酶。單一的MUG鑒別大腸桿菌其漏檢率達6％，鑒于98％的大腸桿菌靛基質(zhì)試驗為陽性，故將MUG，靛基質(zhì)試驗結(jié)合，用EMB瓊脂平板分離，輔以IMViC試驗，在理論上可使大腸桿菌的檢出率達99％由于熒光反應(yīng)的敏感度較顏色反應(yīng)強千萬倍，易于觀察，沒有主觀性，因而用MUG鑒定大腸桿菌已被廣泛應(yīng)用于臨床、食品、飲水、污水等的檢測MUG陽性（有熒光）、靛基質(zhì)陽性（玫瑰紅色）,MUG陰性（無熒光）、靛基質(zhì)陰性（無色）如MUG、I試驗為陽性或陰性即可報告結(jié)果，如MUG與I試驗不一致時，則需分離培養(yǎng)、革蘭染色、鏡檢及生化試驗鑒別第26頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室273.2MUG試驗操作以滅菌吸管取供試品膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)液、供試品陽性對照培養(yǎng)液、陰性對照培養(yǎng)液各0.2ml，分別加入MUG－蛋白胨培養(yǎng)基（培養(yǎng)基5.7）管，37℃培養(yǎng)4、24h后，將各管置366nm紫外燈下觀察有無藍白色熒光，然后加歐波試液4～5滴于上述MUG管內(nèi)，觀察液面顏色第27頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室283.2.1MUG法不必分離單個菌落除大腸埃希菌外，尚有部分志賀菌屬、沙門菌屬的菌株；以及少數(shù)革蘭陽性球菌、桿菌和芽孢菌，其MUG為陽性在MUG培養(yǎng)基成分中增加了去氧膽酸鈉，可排除革蘭陽性菌的干擾志賀菌、沙門菌在膽鹽乳糖培養(yǎng)基中較難生長，即使有生長，本法能檢出。并且既然藥品中不得檢出大腸桿菌，更不允許檢出志賀菌、沙門菌第28頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室293.2.2試驗耗材要求配制MUG培養(yǎng)基時，務(wù)必校正pH值，滅菌后pH不得過7.4，否則pH值偏高，MUG分解，本身則顯熒光分裝MUG培養(yǎng)基的試管應(yīng)挑選，試管、蛋白胨不得顯熒光第29頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室303.2.3培養(yǎng)時間及干擾因素供試品培養(yǎng)液接種于MUG培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間，一般在4h、24h觀察是否產(chǎn)生熒光，如熒光很微弱，不能準確判斷時，可延長培養(yǎng)至48h再觀察結(jié)果由于大腸埃希菌各菌株間的GUD的活性不完全相同，對底物和底物的濃度反應(yīng)的差異；培養(yǎng)基中選擇因子的影響；培養(yǎng)溫度；pH的改變；大量競爭菌和樣品本身物質(zhì)成分的干擾等，對結(jié)果的判斷亦有影響第30頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室313.2.4結(jié)果觀察取供試品的MUG試驗管、陽性對照管、陰性對照管同時在366nm紫外燈下觀察，陽性對照管應(yīng)有較強藍白色熒光，陰性對照管無熒光。供試品MUG管是否有熒光，應(yīng)仔細觀察比較，或?qū)⒏鞴苷{(diào)換位置（陰性管居中），適當傾斜試管。如陽性對照管熒光強烈，影響供試品管與陰性對照管的觀察時，亦可移去陽性對照管第31頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室323.3MUG與靛基質(zhì)試驗結(jié)果判定如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性時，將上述供試品BL增菌培養(yǎng)液輕輕搖動，以接種環(huán)沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液劃線于EMB或麥康凱瓊脂平板上，培養(yǎng)18～24h，觀察EMB或麥康凱瓊脂平板有無可疑大腸桿菌菌落生長。當陽性對照的平板呈典型菌落生長時，供試品分離平板無菌落生長，或有菌落但不同于下表所列特征，可判為供試品1g或1ml未檢出大腸桿菌第32頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室33大腸桿菌在不同培養(yǎng)基上

菌落形態(tài)特征當陽性菌對照平板未生長或生長菌落經(jīng)檢查不是大腸桿菌，應(yīng)研究原因，重新試驗或重新制備供試液，以消除供試品抑菌成分的影響。有疑似菌落生長者，挑取可疑菌落做革蘭染色、鏡檢、IMViC試驗培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍瓊脂典型菌落呈紫黑色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，有金屬光澤。非典型菌落呈淺紫色、粉紅色，或菌落中心紫色或無明顯暗色中心，無金屬光澤。麥康凱瓊脂典型菌落呈鮮桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤。非典型菌落呈微紅色，或菌落中心呈紅色。第33頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室34大腸埃希菌在EMB、MAC上的特征第34頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室353.4疑似菌落的挑選如生長菌落與上表所列特征相符或疑似者，以接種針輕輕接觸單個疑似菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑選2～3個以上疑似菌落，分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)18～24h，作檢查無單個可疑菌落，但有可疑菌團（紫黑色，或有金屬光澤），應(yīng)沾取可疑菌團培養(yǎng)物少許，或重新取增菌培養(yǎng)液劃線接種于EMB瓊脂平板，培養(yǎng)18～24h，再挑選單個疑似菌落，純培養(yǎng)，作以下革蘭染色、鏡檢以及生化試驗第35頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室364生化試驗第36頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室374.1乳糖發(fā)酵試驗操作：取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于乳糖發(fā)酵管，培養(yǎng)24～48h，觀察產(chǎn)酸（指示劑為酸性品紅者為紅色；指示劑為溴麝香草酚藍者為黃色），產(chǎn)氣（小倒管內(nèi)有氣泡，氣泡無論大小）假陰性的處理：為避免遲緩發(fā)酵乳糖產(chǎn)生假陰性，亦可接種5％乳糖發(fā)酵管。絕大多數(shù)遲緩發(fā)酵乳糖的細菌，可于24h出現(xiàn)陽性?；蜻m當延長培養(yǎng)時間第37頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室384.2靛基質(zhì)試驗（I）操作：取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白胨水培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～48h，沿管壁加入歐－波試液數(shù)滴，輕輕搖動試管，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性說明：98％的大腸桿菌靛基質(zhì)試驗為陽性。陰性培養(yǎng)物的進一步檢查：一般24h即可出現(xiàn)陽性結(jié)果，以無菌操作先從管中取出1或2ml培養(yǎng)液進行檢查，如靛基質(zhì)是陰性，余下的蛋白胨水培養(yǎng)物再培養(yǎng)24h，作試驗第38頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室394.3甲基紅試驗（Ｍ）操作：取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2h，于培養(yǎng)液中加入甲基紅指示液2～3滴（約每ml培養(yǎng)液加指示液1滴），輕微搖動，立即觀察結(jié)果觀察：呈鮮紅色或桔紅色為陽性，呈黃色為陰性。第39頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室404.4乙酰甲基甲醇生成試驗（V-P）操作：取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2h，于2ml培養(yǎng)液中加入α-萘酚乙醇試液1ml，混勻，再加40％氫氧化鉀試液0.4ml，充分振搖，在4h（通常在30min）內(nèi)觀察結(jié)果結(jié)果觀察：出現(xiàn)紅色應(yīng)判為陽性，無紅色反應(yīng)為陰性第40頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室414.5枸櫞酸鹽利用試驗（C）操作：取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)2～4天結(jié)果觀察：培養(yǎng)基斜面有菌苔生長，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{色時為陽性，培養(yǎng)基顏色無改變、無菌苔生長為陰性注意事項：枸櫞酸鹽利用試驗培養(yǎng)時間，原訂為2天，根據(jù)試驗資料，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)3天后，枸櫞酸鹽利用試驗產(chǎn)生陽性。僅培養(yǎng)2天是不夠的，故試驗培養(yǎng)時間改為2～4天第41頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室425結(jié)果判斷5.1當陰性對照試驗呈陰性，陽性對照試驗MUG呈陽性，供試品MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，報告lg或1ml供試品檢出大腸桿菌。MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，報告lg或1ml供試品未檢出大腸桿菌5.2MUG陽性、靛基質(zhì)陰性、IMViC試驗為-+--、革蘭陰性桿菌，報告lg或1ml供試品檢出大腸桿菌；MUG陰性、靛基質(zhì)陽性、IMViC試驗為++--、革蘭陰性桿菌，報告lg或1ml供試品檢出大腸桿菌5.3供試品培養(yǎng)物檢查不符合上述二項中的任一項，報告lg或1ml供試品未檢出大腸桿菌第42頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室435結(jié)果判斷-不能直接得出結(jié)論5.4當陰性對照有菌生長或陽性對照未生長或生長菌落不是大腸桿菌，不能作出檢驗報告。第43頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室446.注意事項試驗操作應(yīng)當嚴格按照相關(guān)要求進行第44頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室456.1IMViC試驗的順序以滅菌接種針沾取菌苔，首先接種于枸櫞酸鹽瓊脂斜面上，然后接種于蛋白胨水培養(yǎng)基、磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中。切勿將培養(yǎng)基帶入枸櫞酸鹽瓊脂斜面上，以免產(chǎn)生假陽性結(jié)果第45頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室466.2陽性對照試驗的操作環(huán)境陽性對照試驗是檢查供試品是否有抑菌作用及培養(yǎng)條件是否適宜。陽性對照菌液的制備、計數(shù)及加入含供試品的培養(yǎng)基中等操作，不能在檢測供試品的無菌室或凈化臺上進行，必須在單獨的隔離間或凈化臺操作，以免污染供試品及操作環(huán)境第46頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室476.3關(guān)于復驗在各類供試品中檢測大腸桿菌及其他控制菌，按一次檢出結(jié)果為準，不再抽樣復驗。檢出的大腸桿菌及其他控制菌培養(yǎng)物須保留1個月，備查第47頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室48大腸菌群的檢查大腸菌群的檢查與大腸桿菌有相似之處，應(yīng)當將分純的菌種進行大量的生化試驗來區(qū)分菌種。利用乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣者進行進一步鑒別第48頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室49大腸菌群菌落形態(tài)特征菌落疑似者再進行確證試驗菌落接種到膽鹽乳糖發(fā)酵管，產(chǎn)酸產(chǎn)氣報告檢出大腸菌群，否則判未檢出培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍瓊脂呈紫黑色、紫紅色、紅色或者粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤。麥康凱瓊脂呈鮮桃紅色或者粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤。第49頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室50大腸菌群數(shù)的推算各供試品量的檢出結(jié)果可能的大腸菌群數(shù)N（cfu/g(ml)0.1g(0.1ml)0.01g(0.01ml)0.001g(0.001ml)+++>103++-102<N<103+--10<N<102---<10第50頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室51二、沙門菌檢查法第51頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室521簡述腸桿菌科的重要致病菌2003年出版的第八版的臨床微生物手冊將沙門菌屬分成兩個菌種。迄今已發(fā)現(xiàn)2501個血清型,O抗原抗血清的A-F群包含了分離株的95％以上，所以用沙門菌A-FO多價血清進行初篩試驗藥品中的沙門菌，是以鑒定沙門菌屬為準，即對每g(或ml)藥品中是否檢出沙門菌作出檢驗報告。由于沙門菌血清型繁多，各血清型的生化及血清學特性雖密切相關(guān)，卻不盡相同，采用一種增菌培養(yǎng)基和兩種分離培養(yǎng)基，不可能涵蓋所有沙門菌的最適增菌及分離條件第52頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室531.1藥物對沙門菌的影響此外，由于藥品在生產(chǎn)過程中，常受到加熱、干燥等加工步驟的影響，藥品中污染的沙門菌可受到損傷或呈休眠狀態(tài)，故須在增菌培養(yǎng)前先進行預增菌。然后再進行增菌及分離、三糖鐵瓊脂初步鑒別、生化試驗、血清學試驗等步驟。其他控制菌也可能存在相同狀況第53頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室542對照用菌液乙型副傷寒沙門菌〔CMCC(B)50094〕的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，接種至5ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)。36±1℃培養(yǎng)18～24h后，用0.9%無菌氯化鈉溶液釋至1：106，濃度相當于50-100個cfu/0.1ml第54頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室553操作方法第55頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室563.1增菌培養(yǎng)3.1.1預增菌取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基3瓶，每瓶各100ml，2瓶加入1：10供試液各10ml，其中1瓶加入對照菌液0.1ml(含菌量為50～100個cfu/ml)作陽性對照，第3瓶加入稀釋劑10ml作陰性對照，培養(yǎng)18～24h后觀察。搖動陰性對照瓶后應(yīng)清亮透明，無菌生長，否則試驗無效3.1.2增菌培養(yǎng)輕微搖動供試品增菌培養(yǎng)瓶及陽性對照培養(yǎng)瓶，分別吸取1ml各接種于1管四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24h。陽性對照管應(yīng)呈現(xiàn)混濁第56頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室573.2分離培養(yǎng)輕微搖動供試品增菌培養(yǎng)瓶和陽性對照增菌培養(yǎng)瓶，以接種環(huán)分別沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液接種于膽鹽硫乳瓊脂(DHL)或沙門菌志賀菌瓊脂(SS)平板及曙紅亞甲藍(EMB)瓊脂或麥康凱瓊脂平板各1個，倒置培養(yǎng)24～48h。檢查平板上有無疑似沙門菌菌落第57頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室583.3沙門菌在分離平板上的菌落形態(tài)特征見表平板沙門菌屬亞屬ⅠⅡⅣⅤ沙門菌亞屬Ⅲ膽鹽硫乳瓊脂(DHL)無色或微帶橙色，透明或半透明，邊緣整齊、光滑、中等大小或較小，產(chǎn)H2S的菌落中心或幾乎全黑色發(fā)酵乳糖的菌株菌落為粉紅色，中心帶黑色，遲緩發(fā)酵乳糖或不發(fā)酵乳糖的菌株菌落與亞屬ⅠⅡⅣⅤ同沙門菌屬志賀菌屬瓊脂(S.S)無色或微帶粉色，透明或半透明，邊緣整齊、光滑，中等大小或較小，產(chǎn)H2S的菌落，中心呈黑色。同一平板上常有多數(shù)菌落無黑色中心同膽鹽硫乳瓊脂平板。但發(fā)酵乳糖無黑色中心的菌落與大腸埃希菌不能區(qū)別曙紅亞甲藍瓊脂(EMB)無色或微帶橙色，透明或半透明，中等大小，邊緣整齊光滑發(fā)酵乳糖的菌株菌落為紫色。遲緩發(fā)酵乳糖或不發(fā)酵乳糖的菌株與沙門菌亞屬ⅠⅡⅣⅤ同麥康凱瓊脂(MacC)同曙紅亞甲藍瓊脂平板發(fā)酵乳糖的菌株菌落為粉紅色，不發(fā)酵乳糖或遲緩發(fā)酵乳糖的菌株與沙門菌亞屬ⅠⅡⅣⅤ同第58頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室593.3.1菌落特征補充由于沙門菌不發(fā)酵乳糖和蔗糖，不產(chǎn)酸，菌落不著色，一般為無色半透明，多數(shù)沙門菌因產(chǎn)生H2S，菌落中心呈現(xiàn)黑色甚至全黑色，在DHL瓊脂平板上較為明顯在SS瓊脂平板上，H2S特征有時不明顯，沙門菌屬亞屬Ⅲ因多數(shù)菌株發(fā)酵乳糖，故在上述平板上的乳糖發(fā)酵菌落呈現(xiàn)粉紅或紫色，但由于產(chǎn)生H2S，在有H2S指示系統(tǒng)的平板上仍出現(xiàn)黑色中心在上述培養(yǎng)基上，有些非沙門菌屬細菌，也可呈現(xiàn)類似沙門菌菌落形態(tài)，須進一步鑒別陽性對照平板上，應(yīng)有沙門菌落形態(tài)特征的菌落生長，否則，應(yīng)查明原因。若為供試品抑菌成分所致，須重新制備供試液，消除抑菌成分影響后再行檢查由于藥物的影響或非典型菌株的存在，沙門菌菌落可呈現(xiàn)非典型形態(tài)，如色澤變深，菌落粗糙等，應(yīng)注意辨別第59頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室603.3.2菌落與結(jié)果報告如陽性對照平板有典型菌落生長，供試品平板均未生長或無疑似菌落生長，則報告1g或1ml供試品未檢出沙門菌第60頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室613.3.3菌落傳純從每個供試品的分離平板上挑取2～3個疑似菌落(無色或微帶橙色，產(chǎn)H2S的菌落；無色或微帶橙色、不產(chǎn)H2S的菌落；紅色，產(chǎn)H2S的菌落)分別接種于三糖鐵瓊脂斜面，接種時應(yīng)以接種針輕輕接觸單個菌落中心部位，沾取培養(yǎng)物劃線于三糖鐵瓊脂斜面（或者克氏雙糖鐵瓊脂斜面，制備可以查閱相關(guān)工具書）并穿刺到底層或先穿刺底層再劃線斜面，培養(yǎng)24±2h，觀察結(jié)果第61頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室624生化試驗第62頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室634.1三糖鐵瓊脂反應(yīng)疑似沙門菌在三糖鐵瓊脂斜面上的反應(yīng)①斜面紅色(產(chǎn)堿)，底層黑色(產(chǎn)H2S)并顯示黃色(產(chǎn)酸)；②斜面紅色，底層黃色；③斜面黃色，底層黑色，并顯示黃色。多數(shù)沙門菌在三糖鐵瓊脂上產(chǎn)生氣體，使底層瓊脂出現(xiàn)氣泡或使瓊脂斷裂，但也有不產(chǎn)生氣體的菌種。對在三糖鐵瓊脂斜面黃色并同時底層無黑色，或斜面及底層均為紅色者可以排除沙門菌。第63頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室64第64頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室65有關(guān)細菌在三糖鐵瓊脂上的反應(yīng)第65頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室664.2脲酶試驗用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，劃線接種于脲瓊脂斜面，培養(yǎng)4及24h，觀察結(jié)果。紅色為陽性反應(yīng)，沙門菌屬為陰性反應(yīng)，與變形桿菌相區(qū)別第66頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室674.3氰化鉀試驗將培養(yǎng)物先接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，用接種環(huán)沾取培養(yǎng)液1環(huán)，接種至氰化鉀培養(yǎng)基內(nèi)，另取一環(huán)培養(yǎng)液接種于不含氰化鉀的同樣培養(yǎng)基內(nèi)作對照管，接種后即以橡膠塞塞緊，培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。對照管內(nèi)有菌生長(混濁)，而試驗管也有菌生長為陽性反應(yīng)；對照管有菌生長(混濁)而試驗管無菌生長(清亮)為陰性反應(yīng)。沙門菌應(yīng)為陰性反應(yīng)第67頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室684.3.1氰化鉀試驗注意事項本試驗應(yīng)十分注意密封管口，夏天分裝培養(yǎng)基宜在冰浴中進行，防止氰化鉀分解，產(chǎn)生氫氰酸逸出，致使培養(yǎng)基內(nèi)氰化鉀濃度降低，不能抑制細菌生長，造成假陽性。氰化鉀為劇毒品、操作時須謹慎，切勿用口吸液。用后的培養(yǎng)基每管加數(shù)粒硫酸亞鐵和20%氫氧化鉀0.5ml去毒。然后再滅菌、洗滌第68頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室694.4賴氨酸脫羧酶試驗用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，接種在賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基中，同時接種一支不含賴氨酸的同樣培養(yǎng)基作為對照管，培養(yǎng)24～48h觀察結(jié)果。對照管黃色(產(chǎn)酸)，試驗管呈紫色為陽性反應(yīng)(賴氨酸脫羧產(chǎn)堿)；試驗管黃色為陰性反應(yīng)。沙門菌應(yīng)為陽性反應(yīng)第69頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室704.5動力試驗用接種針沾取培養(yǎng)物，穿刺接種于半固體營養(yǎng)瓊脂管中，培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。有動力的細菌能在穿刺線以外的培養(yǎng)基內(nèi)擴散生長使培養(yǎng)基呈混濁現(xiàn)象；無動力的細菌僅能沿穿刺線生長，不向外擴散，培養(yǎng)基仍呈清晰透明狀；無動力表現(xiàn)的培養(yǎng)物，應(yīng)在室溫保留2～3天后，再行觀察。沙門菌除雞雛沙門菌及無動力的變種外，均具有周身鞭毛，能運動第70頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室714.6靛基質(zhì)試驗用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，接種到蛋白胨水培養(yǎng)基中，照大腸桿菌檢查法靛基質(zhì)試驗項下操作、判斷結(jié)果。沙門菌應(yīng)為陰性反應(yīng)第71頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室725血清學凝集試驗第72頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室735.1取血清準備1片潔凈的滅菌載玻片，在近中央的一端，以直徑3mm接種環(huán)沾取0多價1血清2～3環(huán)制成與玻片橫徑相垂直的條形涂沫，長約1.5cm，寬約0.5cm第73頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室745.2取培養(yǎng)物用接種環(huán)挑取三糖鐵瓊脂斜面或營養(yǎng)瓊脂斜面的新鮮培養(yǎng)物少許，在血清中混勻。菌量要適當，勿過濃第74頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室755.3凝集反應(yīng)的觀察將玻片前后傾斜數(shù)次，以暗色背景襯底，在良好的照明條件下進行觀察，任何程度的凝集現(xiàn)象都是陽性反應(yīng)。陽性反應(yīng)通常在3min內(nèi)發(fā)生。有時因血清效價低、反應(yīng)遲緩時，應(yīng)將玻片置培養(yǎng)皿內(nèi)，并放一個濕棉球在旁邊，蓋上皿蓋，經(jīng)約20min，再觀察結(jié)果第75頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室765.4凝集試驗的對照對出現(xiàn)凝集現(xiàn)象的待檢培養(yǎng)物，應(yīng)以0.9%無菌氯化鈉溶液代替血清，與培養(yǎng)物混勻作對照試驗，對照應(yīng)無凝集現(xiàn)象，方可按陽性反應(yīng)報告第76頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室775.5凝集試驗的結(jié)果判定如試驗及對照試驗均出現(xiàn)凝集現(xiàn)象為非特異反應(yīng)，須對該菌株培養(yǎng)物進行處理后再作凝集試驗當培養(yǎng)物與0多價1血清未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象時，應(yīng)以接種環(huán)取上述斜面培養(yǎng)物，置于含少量0.9%無菌氯化鈉溶液的試管中，制成濃菌懸液，在100℃水浴中保溫30min，以除去可能存在的Vi抗原，待冷后再以此處理后的菌懸液與沙門菌0多價1血清按上法作凝集試驗。如出現(xiàn)凝集，仍判為陽性反應(yīng)；如不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則為陰性反應(yīng)第77頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室786.結(jié)果判斷第78頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室796.1直接報告結(jié)果6.1.1供試品培養(yǎng)物為革蘭陰性桿菌，三糖鐵瓊脂反應(yīng)及生化反應(yīng)符合沙門菌屬反應(yīng)，沙門菌屬0多價1血清凝集試驗陽性反應(yīng)(含待檢培養(yǎng)物經(jīng)100℃30min處理后凝集試驗為陽性反應(yīng))，報告1g或1ml供試品檢出沙門菌。有條件者，應(yīng)進一步作菌型鑒定6.1.2供試品培養(yǎng)物三糖鐵瓊脂反應(yīng)或生化反應(yīng)不符合沙門菌屬反應(yīng)及沙門菌屬0多價1血清凝集試驗為陰性反應(yīng)(含待檢培養(yǎng)物經(jīng)100℃30min處理后凝集試驗為陰性反應(yīng))，報告1g或1ml供試品未檢出沙門菌第79頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室806.2不能直接報告供試品培養(yǎng)物出現(xiàn)下列情況應(yīng)繼續(xù)鑒定或保留菌種送交有關(guān)單位鑒定后，再作報告6.3.1供試品培養(yǎng)物生化反應(yīng)符合沙門菌屬反應(yīng)，沙門菌屬0多價1血清凝集試驗陰性反應(yīng)6.3.2供試品培養(yǎng)物生化反應(yīng)不符合沙門菌屬反應(yīng)，沙門菌屬0多價1血清凝集反應(yīng)呈陽性反應(yīng)第80頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室817注意事項：第81頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室827.1培養(yǎng)基的要求試驗用培養(yǎng)基，需經(jīng)過質(zhì)量鑒定，用已知典型反應(yīng)菌株進行測試，其靈敏度及特征性反應(yīng)應(yīng)符合要求。培養(yǎng)基需在規(guī)定條件保存，在規(guī)定時間內(nèi)使用。分離平板在使用前應(yīng)置36℃溫箱內(nèi)倒置孵育1～2h，使其表面溫暖濕潤，利于分離第82頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室837.2防止形成氣溶膠在對供試品進行測試的同時，需做陽性菌對照及陰性對照。陰性對照應(yīng)無菌生長，陽性對照應(yīng)顯示陽性結(jié)果，否則檢驗結(jié)果無效。在進行陽性菌對照試驗時，應(yīng)與供試品檢驗分開操作，避免污染。特別是用接種環(huán)沾取菌液進行接種或分離時，避免動作過大，形成氣溶膠，污染供試品檢驗用具及操作環(huán)境第83頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室847.4

培養(yǎng)物的純度生化試驗及血清學試驗的被鑒定培養(yǎng)物必須是純培養(yǎng)物，否則，不可能得到正確結(jié)果。如遇血清學凝集試驗陽性時而生化試驗不符合，應(yīng)首先檢查培養(yǎng)物的純度。對已污染的培養(yǎng)物，不應(yīng)丟棄，因為污染菌可能掩蓋沙門菌，故應(yīng)對被污染的培養(yǎng)物重新分離，仔細選取單個菌落再進行試驗第84頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室857.5嚴格按照試驗要求操作所有生化反應(yīng)均需按照規(guī)定的試驗要求進行，如觀察三糖鐵瓊脂斜面反應(yīng)的時間，應(yīng)在24±2h，時間過短過長，都可能出現(xiàn)錯誤結(jié)果判斷。又如氰化鉀試驗，試管口應(yīng)密塞，否則氰化鉀濃度降低，致使抑菌作用下降第85頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室867.6凝集試驗的影響因素血清凝集試驗的影響因素甚多，除與電解質(zhì)、pH、溫度有關(guān)外，須特別注意抗原與抗體用量的比例恰當，只有當二者濃度適當時，凝集反應(yīng)方明顯可見。由于本法試驗用多價血清，其凝集力相對較弱，試驗用菌液量切不能過大。測試前，應(yīng)用已知陽性菌測試以掌握適宜菌液濃度第86頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室877.7防止污染沙門菌為腸道重要致病菌，操作時應(yīng)特別注意防止分離待檢菌及陽性對照菌對操作環(huán)境及試驗的污染。所有用過的增菌、分離、生化試驗培養(yǎng)基、血清學凝集試驗及染色鏡檢后的玻片等，均需經(jīng)滅菌后方能洗滌第87頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室88三、銅綠假單胞菌檢查法第88頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室891簡述銅綠假單胞菌，習稱綠膿桿菌，為假單胞菌屬菌種廣泛分布在土壤，水及空氣，人和動物的皮膚、腸道、呼吸道均有存在，故可通過環(huán)境和生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)污染藥品。本菌是常見的化膿性感染菌、在燒傷、燙傷，眼科及其他外科疾患中常引起繼發(fā)感染，由于本菌對許多抗菌藥物具有天然的耐藥性，增加了治療的難度、國內(nèi)外藥典均將銅綠假單胞菌檢查列為檢查項目之一第89頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室902對照用菌液銅綠假單胞菌〔CMCC(B)10104〕營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，接種至5ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，于36±1℃培養(yǎng)18～24h后，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至1：106，使對照菌加入量含50～100個cfu(一般用量為0.1ml)，菌數(shù)在做陽性對照實驗的同時用營養(yǎng)瓊脂平板涂布經(jīng)培養(yǎng)后計數(shù)確定第90頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室913操作方法第91頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室923.1增菌培養(yǎng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基3瓶，每瓶100ml，2瓶分別加入1：10供試液10ml(相當于供試品1g或1ml)，其中一瓶加入含對照菌50～100個菌落形成單位的菌液作為陽性對照。第3瓶加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對照36±1℃培養(yǎng)18～24h(必要時可延至48h)第92頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室933.2分離培養(yǎng)增菌培養(yǎng)液1～2環(huán)(如有菌膜應(yīng)挑取之)，劃線接種于溴代十六烷基三甲胺瓊脂平板于36±1℃培養(yǎng)18～24h銅綠假單胞菌在該培養(yǎng)基平板上的典型菌落為扁平、圓形或無定形、邊緣不齊，光滑濕潤，呈灰白色，周邊略呈擴散現(xiàn)象，在菌落相鄰處常有融合現(xiàn)象。菌落周圍常有水溶性藍綠色素擴散，使培養(yǎng)基顯藍綠色，但亦有不產(chǎn)色素的菌株。菌落還有粗糙型和粘液型等，應(yīng)注意挑選當陽性對照平板呈典型菌落生長時，供試品平板無菌落生長或無疑似菌落生長，可報告1g或1ml供試品未檢出銅綠假單胞菌。當陽性對照平板無菌落生長或生長菌落經(jīng)檢查不是銅綠假單胞菌，應(yīng)研究原因，重新試驗或重新制備供試液，以消除供試品抑菌成分的影響第93頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室943.3純培養(yǎng)供試品分離平板生長3.2所述典型菌落或呈疑似菌落時，以接種針輕輕接觸單個菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑取2～3個疑似菌落，分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)，作以下檢查第94頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室953.4初步鑒別試驗3.4.1革蘭染色鏡檢銅綠假單胞菌為革蘭陰性、無芽孢桿菌，單個，成對或成短鏈排列3.4.2氧化酶試驗：銅綠假單胞菌呈陽性3.4.3綠膿菌素試驗3.4.442℃生長試驗第95頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室963.4.3綠膿菌素試驗取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于綠膿菌素測定用培養(yǎng)基(PDP)斜面上，36±1℃培養(yǎng)24h后，觀察斜面有無色素，如有色素，在試管內(nèi)加氯仿3～5ml，以無菌玻棒攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。使培養(yǎng)物中的色素完全萃取在氯仿液內(nèi)。靜置片刻，待氯仿分層，用吸管將氯仿移至另一試管中，加入鹽酸試液(1mol/L)約1ml，振搖后靜置片刻，如在鹽酸液層內(nèi)出現(xiàn)粉紅色、即為陽性反應(yīng)，無粉紅色出現(xiàn)為陰性反應(yīng)。如培養(yǎng)基斜面無色素產(chǎn)生，應(yīng)于室溫培養(yǎng)1～2天再按上法試驗。凡經(jīng)再次檢驗，綠膿菌素試驗仍為陰性者應(yīng)繼續(xù)以下試驗第96頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室973.4.442℃生長試驗將菌懸液劃線接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，立即置42±1℃的恒溫水浴箱內(nèi)，務(wù)使整個斜面浸沒在水浴中，培養(yǎng)24～48h，斜面如有菌苔生長者為陽性反應(yīng)；無菌苔生長為陰性反應(yīng)第97頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室984生化試驗第98頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室994.1硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗以接種環(huán)沾取少許營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中，置36±1℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。如果在培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中有氣體產(chǎn)生，即為陽性反應(yīng)，表明該培養(yǎng)物能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮氣。小倒管內(nèi)無氣泡者為陰性反應(yīng)第99頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室1004.2明膠液化試驗以接種針沾取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，穿刺接種于明膠培養(yǎng)基中，穿刺深度應(yīng)接近培養(yǎng)基的底部于36±1℃培養(yǎng)24h取出放入冰箱內(nèi)10～30min如培養(yǎng)基呈溶液狀，即為明膠液化試驗陽性反應(yīng)；如明膠呈凝固狀，為陰性反應(yīng)第100頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室101本試驗應(yīng)注意：(1)本試驗接種前，培養(yǎng)基應(yīng)為固態(tài)，否則需將培養(yǎng)基置冰箱內(nèi)使之凝固后，再穿刺接種(2)試驗應(yīng)同時設(shè)未接種細菌的陰性對照管，與試驗管同時培養(yǎng)并觀察結(jié)果第101頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室1025結(jié)果報告5.1供試品培養(yǎng)物經(jīng)證實為革蘭陰性桿菌，氧化酶試驗及綠膿菌素試驗皆為陽性者，即報告1g或1ml供試品檢出銅綠假單胞菌5.2供試品培養(yǎng)物氧化酶試驗陽性，鏡檢為革蘭陰性桿菌的培養(yǎng)物，綠膿菌素試驗陰性時，其硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗、41℃生長試驗及明膠液化試驗皆為陽性時，亦報告1g或1ml供試品檢出銅綠假單胞菌5.3凡與5.1與5.2結(jié)果不符時報告1g或1ml供試品未檢出銅綠假單胞菌第102頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室1035.4疑似菌落也可以采用自動化菌種鑒定系統(tǒng)進行菌種鑒定，對疑似菌落如果鑒定為銅綠假單胞菌可以報告從供試品中檢出銅綠假單胞菌第103頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室1046注意事項第104頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室1056.1非典型形態(tài)銅綠假單胞菌污染藥品后，因生產(chǎn)工藝和藥物的影響，在溴代十六烷基三甲胺平板上的菌落形態(tài)可產(chǎn)生非典型形態(tài)。為防止漏檢，在挑取疑似菌落時，宜取2～3個以上菌落，分別進行檢驗，以提高銅綠假單胞菌的檢出率第105頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室1066.2綠膿菌素是銅綠假單胞菌鑒定的重要特征，但色素的產(chǎn)生受許多因素的影響，除菌株差異及變異外，培養(yǎng)條件是重要因素，溫度、培養(yǎng)基成分等皆可影響色素產(chǎn)生培養(yǎng)基中瓊脂、蛋白胨等均應(yīng)事先測試，選用適宜品牌試驗時用陽性菌株作對照試驗第106頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室1076.4疑似菌落也可以采用自動化菌種鑒定系統(tǒng)進行菌種鑒定如果用自動化儀器對多個可以菌落進行鑒定會增加很多檢出成本，做一些菌種鑒定初步篩選試驗是非常必要的第107頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室108四、金黃色葡萄球菌檢查法第108頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室1091簡述金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為葡萄球菌屬中的一種廣泛分布于自然界，空氣、土壤、水及物品上，人和動物皮膚及與外界相通的腔道中，也經(jīng)常有本菌存在本菌可產(chǎn)生多種毒素及酶，這些毒性物質(zhì)能引起局部及全身化膿性炎癥，嚴重時可發(fā)展成為敗血癥和膿毒血癥，是人類化膿性感染中重要的病原菌本菌抵抗力較強干燥情況下能生存數(shù)月80℃30min的條件下尚能存活5%石碳酸或0.1%升汞溶液10～15min才會被殺死葡萄球菌屬在新版Bergey手冊中共收載為28種，在微生物菌種鑒定中目前應(yīng)用較多的2003年出版的第八版美國臨床微生物手冊共收錄35個菌種，44個菌型。常見有金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌三種金黃色葡萄球菌檢查按增菌、分離、純培養(yǎng)、革蘭染色鏡檢和血漿凝固酶試驗等步驟進行本法適用于外用藥品及一般滴眼劑、眼膏劑的檢查第109頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室1102對照用菌液金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］營養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許，接種至5ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，36℃±1℃培養(yǎng)18～24h，用0.9%無菌氯化鈉溶液，按10倍遞增稀釋至1：106，加入含50～100個cfu的對照菌菌液(一般用量為1：1060.1ml)，同時用營養(yǎng)瓊脂平板計數(shù)第110頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室1113操作方法第111頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室1123.1增菌培養(yǎng)取營養(yǎng)肉湯(或亞碲酸鈉肉湯)培養(yǎng)基3瓶，每瓶100ml，2瓶分別加入10ml供試液，其中1瓶加入含50～100個cfu的對照菌菌液作為陽性對照，第3瓶加入與供試液等量的0.9%無菌氯化鈉溶液或磷酸鹽緩沖液(pH7.2)作為陰性對照置36℃±1℃培養(yǎng)18～24h(必要時可延至48h)第112頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室1133.2分離培養(yǎng)將上述供試品增菌培養(yǎng)液及陽性對照增菌液輕輕搖動，以接種環(huán)沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液，劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂平板或甘露醇氯化鈉瓊脂平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)24～72h。當陽性對照平板呈典型菌落生長時，供試品分離平板無菌落生長，或有菌落生長但不同于所列特征，可報告為1g或1ml供試品未檢出金黃色葡萄球菌3.2.1當供試品分離平板生長菌落與表1所列特征相似的典型形態(tài)，應(yīng)挑取該菌落作純培養(yǎng)，對非典型形態(tài)的菌落，可增加血瓊脂平板分離鑒別。金黃色葡萄球菌在三種選擇性培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征見下表第113頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室114金黃色葡萄球菌在三種選擇性培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)特征卵黃氯化納瓊脂

金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，光滑濕潤，外周有分解卵磷脂后產(chǎn)生的乳濁圈，菌落直徑1～2mm甘露醇氯化納瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，光滑濕潤，外周有黃色環(huán)，菌落直徑0.7～1mm

血瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，光滑濕潤，外周有溶解紅細胞后產(chǎn)生的透明溶血環(huán)，菌落直徑較大，2～4mm第114頁,共124頁，2024年2月25日，星期天2005年4月16日星期六中國藥品生物制品鑒定所抗生素室1153.3純培養(yǎng)當供試品分離平板生長菌落與表中所列菌落特征相