(全國百強校)江西新余第第一中學(xué)學(xué)蘇版高中生物一資料：微生物的實驗室培養(yǎng)

課題1微生物的實驗室培養(yǎng)專題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用（一）培養(yǎng)基

1、定義：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。2、培養(yǎng)基成分:碳源、氮源、水和無機鹽等4類★另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì),以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。如:培養(yǎng)乳酸菌時需添加維生素、霉菌PH調(diào)成酸性、細(xì)菌PH調(diào)成中性或微堿性、厭氧微生物提供無菌條件?！?類成分齊全的培養(yǎng)基叫基本培養(yǎng)基，例如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

3、培養(yǎng)基的種類和用途液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基據(jù)物理性質(zhì)分天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基據(jù)化學(xué)成分分選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基據(jù)用途分①常用于工業(yè)生產(chǎn)②實驗室對菌種的選擇和擴大培養(yǎng)形成菌落，用于微生物的分離、鑒定、計數(shù)常用于工業(yè)生產(chǎn)常用于分類、鑒定在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長，促進所需要的微生物的生長。根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成，用以鑒別不同種類的微生物。半固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長固體培養(yǎng)基：菌落單個或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。菌落特征是鑒定菌種的重要依據(jù)。半固體培養(yǎng)基：無動力有動力(彌散)(是否運動)

選擇培養(yǎng)基:從微生物群中選擇具有特定表型的細(xì)胞.使之進行繁殖所用的培養(yǎng)基,稱為選擇培養(yǎng)基.

加入青霉素的培養(yǎng)基:

分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:

分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基:

分離固氮菌

不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基:

分離自養(yǎng)型微生物加尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基分離能合成脲酶，分解尿素的細(xì)菌加纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基分離能分解纖維素的微生物例如，在培養(yǎng)基中加伊紅和美藍，用來鑒別飲用水和乳制品中是否存在大腸桿菌等細(xì)菌：如果有大腸桿菌，其代謝產(chǎn)物就與伊紅和美藍結(jié)合，使菌落呈黑色在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)分解尿素的細(xì)菌，尿素-氨，PH升高，指示劑變紅色在以纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基加剛果紅，產(chǎn)纖維素酶的菌落周圍會出現(xiàn)透明圈鑒別培養(yǎng)基:在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成，用以鑒別不同種類的微生物。

大腸桿菌呈黑色中心,有或無金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂(EMB)上典型特征

（二）無菌技術(shù)1.成功地培養(yǎng)微生物的關(guān)鍵：無菌技術(shù)包括：

（1）對實驗操作空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒；

（2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌（干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌）；

（3）為避免周圍微生物污染，實驗操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進行；（無菌操作）

（4）避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸。防止外來雜菌的入侵無菌技術(shù)目的具體方法消毒使用較為溫和的化學(xué)或物理方法，殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物營養(yǎng)體的過程（不包括芽孢-休眠體和孢子-繁殖體）煮沸消毒法巴氏消毒法化學(xué)藥劑消毒法100℃煮沸5-6min70-75℃下煮30min或80℃下煮15min（不耐高溫的液體）用75%酒精皮膚消毒;氯氣消毒水源、消毒水滅菌用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括。包括芽孢和孢子，而達到完全無菌的過程灼燒滅菌干熱滅菌高壓蒸氣滅菌熏蒸滅菌細(xì)菌過濾器滅菌接種環(huán)、接種針、試管口金屬工具、玻璃器皿等160-170℃下加熱1-2h100kPa、121℃下維持15-30min滅菌與消毒技術(shù)是微生物工作中最普通也是最重要的技術(shù)1.無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實驗操作者的雙手答：有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。旁欄思考（三）.基本操作程序：培養(yǎng)基配制、接種、菌種保藏1、培養(yǎng)基的配制計算→稱量→溶化→調(diào)pH→分裝→滅菌→倒平板→無菌檢查溶化后分裝前錐形瓶或試管中培養(yǎng)基高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～30min。培養(yǎng)皿用舊報紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃下滅菌2h。待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時，在酒精燈附近倒平板。防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。平板冷凝后，倒置①使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，②防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24—48小時，以檢查滅菌是否徹底。倒平板技術(shù)（三）.基本操作程序2、微生物接種的方法平板劃線法：通過接種環(huán)（操作的第一步及每次劃線前、劃線結(jié)束時都要灼燒接種環(huán)、冷卻）在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線（每次劃線都從上一次劃線的末端開始，最后區(qū)域的劃線不要與第一區(qū)域相連）將聚集的菌種逐步稀釋分散，數(shù)次劃線后可獲得由一個細(xì)胞繁殖而來的單個菌落，不能用于計數(shù)平板劃線法難以根據(jù)稀釋體積計算每克樣品中的細(xì)菌數(shù)稀釋涂布平板法：將菌液進行梯度稀釋，不同稀釋度的菌液分別用涂布器涂布到固體培養(yǎng)基表面，稀釋度足夠高時，聚集在一起的微生物將被分散成單個細(xì)胞，能培養(yǎng)成單個菌落，常用于計數(shù)，一般選擇菌落數(shù)在30-300的平板進行技術(shù)，統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌數(shù)低：當(dāng)兩個或多個菌連在一起時，觀察到的是一個菌落（三）.基本操作程序2、微生物接種的方法平板劃線法：通過接種環(huán)（操作的第一步及每次劃線前、劃線結(jié)束時都要灼燒接種環(huán)、冷卻）在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線（每次劃線都從上一次劃線的末端開始，最后區(qū)域的劃線不要與第一區(qū)域相連）將聚集的菌種逐步稀釋分散，數(shù)次劃線后可獲得由一個細(xì)胞繁殖而來的單個菌落，不能用于計數(shù)平板劃線法難以根據(jù)稀釋體積計算每克樣品中的細(xì)菌數(shù)稀釋涂布平板法：將菌液進行梯度稀釋，不同稀釋度的菌液分別用涂布器涂布到固體培養(yǎng)基表面，稀釋度足夠高時，聚集在一起的微生物將被分散成單個細(xì)胞，能培養(yǎng)成單個菌落，常用于計數(shù)，一般選擇菌落數(shù)在30-300的平板進行技術(shù)，統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌數(shù)低：當(dāng)兩個或多個菌連在一起時，觀察到的是一個菌落注意事項①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進行計數(shù)。②為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。因為當(dāng)兩個或多個細(xì)胞在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。

④涂布平板法所選擇的稀釋度很重要3、菌種的保存（1）、臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。（2）、甘油管藏法四、課題成果評價

（一）培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。

（二）接種操作是否符合無菌要求如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。（三）分離純化大腸桿菌，練習(xí)平板劃線法總結(jié)微生物培養(yǎng)的基本程序一.研究思路㈠.篩選菌株㈡.統(tǒng)計菌落數(shù)目㈢.設(shè)置對照㈠.篩選菌株1、自然界中：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。2、實驗室中微生物的篩選原理（方法）：（1）提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)（2）抑制或阻止其他微生物生長。要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等；配置合適的培養(yǎng)基3、可以用液體培養(yǎng)基：選擇培養(yǎng)（擴大培養(yǎng)）增菌后，稀釋涂布到固體培養(yǎng)基：分離、純化---計數(shù)、鑒定1.間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）（1）常用方法：每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。

當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。（2）原理：稀釋涂布平板法㈡.統(tǒng)計菌落數(shù)目：2、顯微鏡直接計數(shù)：利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細(xì)菌的計數(shù)；個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；需要相對高的細(xì)菌濃度；缺點設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。㈢.設(shè)置對照：㈣.樣品稀釋◆如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30——300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)（如果三個數(shù)據(jù)差異不大）；◆如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，不能用于計算平均值，因為它不接近真實值，應(yīng)重新實驗并注意：將菌液搖勻后再接種P22㈤.微生物的培養(yǎng)與觀察在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細(xì)菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d放線菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d霉菌：25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征：包括菌落的形狀、大小、隆起程度、顏色等微生物的培養(yǎng)與觀察二.實驗的具體操作

㈠.制備培養(yǎng)基：㈡.土壤取樣[三]也可以有選擇培養(yǎng)這一步[三]樣品的稀釋制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基?！魬?yīng)在火焰旁稱取土壤10g。◆在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進行◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保證獲得菌落數(shù)在30～300之間、得到適于計數(shù)的平板通過選擇培養(yǎng)：選擇出并擴大培養(yǎng)）4、課題目的①從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌②統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌10-5㈢.設(shè)置對照：設(shè)置對照的方法：A同學(xué)的結(jié)果與其他同學(xué)不同，可能的解釋有兩種。一是由于土樣不同；二是A同學(xué)的由于培養(yǎng)基污染三是操作失誤，培養(yǎng)基混入其它氮源方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進行實驗方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測：如結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；否則，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。方案三：培養(yǎng)基混入其它氮源：重新配制培養(yǎng)基，除了不加尿素，其他物質(zhì)與尿素培養(yǎng)基完全相同，接種菌種，培養(yǎng)觀察是否有菌落出現(xiàn)，有→則培養(yǎng)基混入其它氮源四.課外延伸對分離的菌種做進一步鑒定，還需借助生物化學(xué)的方法

在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細(xì)菌能夠分解尿素。（選擇并鑒定）原理：在細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)中，細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成了氨。氨會使培養(yǎng)基堿性增強，PH升高。分離原理：（一）纖維素與纖維素酶纖維素：一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，廣泛地存在于植物的根、莖、葉等器官中。地球上含量最豐富的多糖。纖維素酶：由微生物分泌的一種復(fù)合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，由于它們的協(xié)同作用，最終將纖維素分解成葡萄糖。纖維素C1酶Cx酶纖維二糖葡萄糖苷酶葡萄糖課題3分解纖維素的微生物的分離剛果紅（CR）染色法

剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。（二）纖維素分解菌的篩選與鑒定

用加入剛果紅的纖維素培養(yǎng)基去培養(yǎng)微生物時，如果培養(yǎng)基中出現(xiàn)以菌落為中心的透明圈時，可說明該菌落是纖維素分解菌，因為它已將被剛果紅染成紅色的纖維素分解了。一、實驗設(shè)計土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋

將樣品涂布在鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上

篩選產(chǎn)生透明圈的菌落①要在富含纖維素或落葉較多的環(huán)境中尋找纖維素分解菌②將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚集①通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖，②液體培養(yǎng)基，因為沒有添加瓊脂。P29①剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)②如果培養(yǎng)基中出現(xiàn)以菌落為中心的透明圈時，可說明該菌落是纖維素分解菌P29二、結(jié)果分析與評價1.培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落

對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。

2.分離的結(jié)果是否一致

由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠遠高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細(xì)菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，不同同學(xué)也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。1．纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，因培養(yǎng)基中無凝固劑，利用液體選擇培養(yǎng)基以增加纖維素分解菌的濃度。2．為確定得到的菌是否是纖維素分解菌，還需進行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的實驗。纖維素酶的發(fā)酵方法有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種。纖維素酶的測定方法，一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的葡萄糖進行定量測定。3．流程中的“選擇培養(yǎng)”是否需要，應(yīng)根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量的多少來確定。三、課題延伸（2）滅菌的定義：是指使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括。包括芽孢和孢子，而達到完全無菌的過程。

滅菌與消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工作中最普通也是最重要的技術(shù)。2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別使用較為溫和的化學(xué)或物理方法，殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物營養(yǎng)體的過程（不包括芽孢-休眠體和孢子-繁殖體）（１）消毒定義：

用75%酒精皮膚消毒;氯氣消毒水源、消毒水(1)消毒的方法：3.常用的消毒與滅菌的方法1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min（不耐高溫的液體）3、化學(xué)藥劑消毒法:1、灼燒滅菌接種環(huán)、接種針、試管口(2)滅菌的方法：2、干熱滅菌：金屬工具、玻璃器皿等160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min4、紫外線滅菌-30分鐘，殺死物體表面或空氣中的微生物……5、熏蒸滅菌6、細(xì)菌過濾器滅菌3.微生物實驗室培養(yǎng)的基本操作程序培養(yǎng)基的配制接種純化大腸桿菌菌種的保藏計算稱量溶化調(diào)pH分裝滅菌倒平板無菌檢查按配方比例計算稱量紙、吸潮、迅速、蓋蓋稱量紙一起放、攪拌防止瓊脂糊底、補水至100ml溶化后分裝前培養(yǎng)基高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，