關(guān)于PAR-2基因在EBV轉(zhuǎn)化人胃上皮細(xì)胞中的作用

關(guān)于PAR-2基因在EBV轉(zhuǎn)化人胃上皮細(xì)胞中的作用

劉換新陳娟劉梅葉春【摘要】目的研究EBV感染人胃上皮細(xì)胞系GFS-1后PAR-2基因的表達(dá)狀況及轉(zhuǎn)化作用，以探討PAR-2基因在Epstein-Baar病毒(EBV)相關(guān)胃癌發(fā)生中所起的作用。方法用攜帶NEO基因的重組EBV產(chǎn)生細(xì)胞系A(chǔ)kata1061以密切接觸法感染人胃上皮細(xì)胞系GF5-1，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將PAR-2基因轉(zhuǎn)染至同一細(xì)胞，以pcDNA3空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染同一細(xì)胞為對(duì)照;經(jīng)G418篩選獲得感染或轉(zhuǎn)染的抗性細(xì)胞克隆;采用免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定EBNA1的表達(dá)以鑒定EBV感染細(xì)胞克隆，測(cè)定EBV感染和PAR-2基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞中PAR-2蛋白的表達(dá);通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定及流式細(xì)胞分析等方法觀察細(xì)胞生物學(xué)特性的變化。結(jié)果與對(duì)照組相比，EBV感染及PAR-2轉(zhuǎn)染后細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化，生長(zhǎng)速度明顯加快，S期細(xì)胞比例顯著提高，分別為(70.35±0.91)%、(60.67±3.06)%和(34.74±1.03)%，差異有顯著性(P<0.05)，表明EBV感染及PAR-2基因轉(zhuǎn)染均使細(xì)胞增殖加快。結(jié)論EBV感染及PAR-2基因轉(zhuǎn)染可使人胃上皮細(xì)胞的增殖速度加快，細(xì)胞惡性程度增強(qiáng)，但并未導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。EBV對(duì)人胃上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用可能與PAR-2基因的過(guò)度表達(dá)有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】Epstein-Barr病毒(EBV);PAR-2;人胃上皮細(xì)胞;基因轉(zhuǎn)染;細(xì)胞周期RoleofPAR-2geneinEBV-transformedhumangastricepititelialcellsLIUHuan-xin，CHENJuan，LIUMei，etal.TheHospitalofArmedPoliceofGuangdong，Guangzhou510507，China[Abstract]ObjectiveTodefinetheroleofPAR-2geneinthecarcinogenesisofEBV-associatedgastriccarcinoma，weexaminedtheexpressionofPAR-2inthehumanepithelialcelllineGES1infectedwithEBVandtestedifEBVcouldinducecelltransformation.MethodsAkata1061wasusedtoinfectGES-1theintimatecontactmeth-od.pcDNA3-PAR-2washansfectedintocellstheUpofectAMINEmethod，whereaspcDNA3vectorwasusedasthecontrol.Geneticin418(G418)wasadoptedtoselectpositiveclonesthatwereeitherEBVorPAR-2positive.Immuno-histochemicalstainingmethodwasusedtodetectEBNAIexpressionincellclonesinfectedwithEBVandtheexpressionofPAR-2proteininEBV-infectedorPAR-2-transfectedcellclones.Morphologicalobservations，cellgrowthcurvede-terminations，softagargelformationtests，andflowcytometrywereemployedtomeasurechangesincellproliferationandcellcycleprogress.ResultsComparedtothecontrol，EBV-infectedorPAR-2-transfectedcellsrevealedsignificantmorphologicalchangesthatwereaccompaniedasignificantincreaseinthecellgrowthvelocity.ThenumbersofSasecellsweresignificantlyincreased(P<0.05)，bothEBV-infection(70.35±0.91%)andPAR-2-transfection(60.67%±3.06%)，comparedtothecontrol(34.74%±1.03%).Cellcolonyformationwasnotdetectedthesoftagargelcloneformationtest.ConclusionBothEBVinfectionandPAR-2transfectionpromotetheproliferationofgastricepithelialcellsresultinanincreasedtendencyofmalignance.However，thebotheventsfailedtoinducecarcinoma.Thesedatasuggestthatanover-expressionofPAR-2mayplayaroleinEBVinducedtransformationonhumangastricepithelialcells.[Keywords]Epstein-Barrvirus(EBV);PAR-2;Humangastricepithelialcell;Genetransfection;Cellcycle胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率在世界范圍內(nèi)的惡性腫瘤中占第二位，其發(fā)病機(jī)制目前并不十分清楚。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，胃癌的發(fā)生是物理、化學(xué)、生物等多因素、多階段的發(fā)展過(guò)程。1990年Burke等[1]首次報(bào)道了1例EBV陽(yáng)性胃癌，自此EBV感染與胃癌的關(guān)系受到關(guān)注[2]。EBV最初是由Epstein和Barr從非洲伯基特淋巴瘤(BL)培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)的，它與多種人類腫瘤有關(guān)。目前，對(duì)EBV相關(guān)胃癌的研究主要在臨床病理方面，而EBV感染后胃上皮細(xì)胞變化的分子機(jī)制尚不明確。筆者采用EBV感染和PAR-2基因轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的胃上皮細(xì)胞系GES-1，對(duì)比分析細(xì)胞生物學(xué)特性的變化，從而探討PAR-2基因在EBV致胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。1材料與方法1.1主要試劑脂質(zhì)體LipofectAMINETM2000regent，G418購(gòu)自Invitrogen公司;小量質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶、XDNA/Hindmmaker，200byDNAstepladder、瓊脂糖購(gòu)自華美生物技術(shù)工程公司;RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;胎牛血清(FCS)購(gòu)自基因公司;免疫細(xì)胞化學(xué)染色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;胃癌病人血清為來(lái)自本院腫瘤科;載體和細(xì)胞株：pcDNA3空載體質(zhì)粒、pcDNA3-c-myC重組質(zhì)粒及攜帶NEW基因的重組EBV產(chǎn)生細(xì)胞系A(chǔ)kata1061均為廣州安必平生物科技有限公司提供;人胃上皮細(xì)胞系GFS-1由南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供;大腸桿菌HB101由安必平生物科技有限公司提供。1.2細(xì)胞的培養(yǎng)人胃上皮細(xì)胞系GES-1用含10%FCS，100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞2~3天換1次液，細(xì)胞融合約達(dá)80%時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。Akata細(xì)胞為懸浮生長(zhǎng)的淋巴細(xì)胞，具有G418抗性。常規(guī)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)方法，另含700mg/LG418。1.3pcDNA3-PAR-2重組質(zhì)粒及pcDNA3空載體質(zhì)粒的獲得取感受態(tài)的大腸桿菌，按質(zhì)粒小量提取方法進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取和純化，用BamHI酶切后電泳鑒定，用Quantityone圖像分析軟件進(jìn)行灰度測(cè)定，計(jì)算提取質(zhì)粒的濃度，并根據(jù)此濃度確定轉(zhuǎn)染所需的量。1.4基因轉(zhuǎn)染及陽(yáng)性克隆篩選將pcDNA3-c-myc重組質(zhì)粒及pcDNA3空載體質(zhì)粒按1：2~1：3的量用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染24孔板中90%~93%融合的GES-1細(xì)胞，按試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行。37℃轉(zhuǎn)染5h后，加人FCS至終濃度10%。48h后用有限稀釋法進(jìn)行陽(yáng)性克隆，并置于含300mg/LG418(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果而定)的選擇培養(yǎng)基中，篩選培養(yǎng)2周，待抗性單克隆長(zhǎng)至足夠大，挑取單克隆集落，擴(kuò)大培養(yǎng)，制備細(xì)胞片。EBV感染及陽(yáng)性克隆篩選：感染前3天，Akata1061細(xì)胞稀釋至2×103/ml，加入終濃度為0.5%山羊抗人降解血清，于37℃培養(yǎng)2h，不時(shí)輕輕搖動(dòng)，然后以PBS洗2次，以含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。感染前1天，將GES-1細(xì)胞以2mmol/LEIYI'A/PBS消化下來(lái)，置于12孔培養(yǎng)板中，每孔2ml培養(yǎng)基，含5×103細(xì)胞。轉(zhuǎn)染當(dāng)天更換等體積培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染時(shí)每孔加人1mlAkata細(xì)胞懸液，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)3天。在第2天更新一半培養(yǎng)基，使FCS濃度降至5%。此過(guò)程結(jié)束后，以PBS洗4次，加人2ml含10%FCS的培養(yǎng)基。感染后第5天，將細(xì)胞消化下來(lái)，稀釋至2×102/ml，接種于96孔板中培養(yǎng)至克隆形成。此過(guò)程中，培養(yǎng)基中加入終濃度為300mmol/L的G418和終濃度為1mmol/L的更昔洛韋(僅第1周)。將所獲得的細(xì)胞克隆常規(guī)培養(yǎng)并制備細(xì)胞片。1.5EBNAl及PAR-2蛋白的檢測(cè)將EBV感染細(xì)胞片用FTIC標(biāo)記的免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)EBNAI的表達(dá);感染和轉(zhuǎn)染細(xì)胞片檢測(cè)PAR-2蛋白的表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)方法按說(shuō)明書(shū)操作，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明確亮綠色判定為陽(yáng)性結(jié)果。1.6細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定取EBV感染、c-myc基因轉(zhuǎn)染及對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用0.25%胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)計(jì)數(shù)后以3×103個(gè)/孔接種于24孔板，每孔加人無(wú)血清培養(yǎng)基2ml培養(yǎng)1天使細(xì)胞同步化，換入含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基2ml繼續(xù)培養(yǎng)。每天取4孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每孔重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取其平均值，連續(xù)計(jì)數(shù)7天，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。1.7軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔先加入0.66%底層瓊脂3ml(1.5ml1.3%瓊脂冷卻至55℃左右，與1.5ml預(yù)溫的37℃含2×RPMI1640培養(yǎng)基混勻)，待凝固后，加入0.33%的含細(xì)胞的上層瓊脂3ml，每組細(xì)胞均做復(fù)孔。置濕盒，在37℃，5%CO2及飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)2~3周，觀察軟瓊脂中細(xì)胞集落的形成。1.8細(xì)胞周期的測(cè)定分別收集各組細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化，離心收集細(xì)胞，冷PBS洗滌2次。加入預(yù)冷的70%酒精，4℃固定過(guò)夜。800~1000×g離心棄上清，冷PBS離心洗滌2次并重懸，制成單細(xì)胞懸液，注意離心速度不宜過(guò)快。等體積細(xì)胞懸液和碘化丙啶(PI)染液混合，4℃放置20min×300目尼龍過(guò)濾，加樣入流式細(xì)胞分析儀樣品室，進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。設(shè)定P<0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1PWNA3-PAR-2重組質(zhì)粒的鑒定擴(kuò)增純化的pcDNA3-PAR-2重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ酶切、電泳，可見(jiàn)PAR-2基因大小為1.3kb，pcDNA3載體為5.4kb，恰好在pcDNA3的BamHⅠ位點(diǎn)，與所提供的質(zhì)粒圖譜相符(圖1)和PAR-2蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染了PAR-2基因的GES-1細(xì)胞有PAR-2蛋白表達(dá)，細(xì)胞均被染成亮綠色，陽(yáng)性結(jié)果主要出現(xiàn)在細(xì)胞核，部分在細(xì)胞質(zhì)，而空載體轉(zhuǎn)染組及正常GES-1細(xì)胞均為陰性(圖2、圖3)。2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化正常的GES-1細(xì)胞呈短梭形，大小較為一致，核較小呈圓形或橢圓形;感染及轉(zhuǎn)染組細(xì)胞體積變大，呈橢圓形或多角形，核變大，核漿比增大，折光性增強(qiáng)，與正常GES-1細(xì)胞相比較，細(xì)胞增殖迅速，細(xì)胞生長(zhǎng)的接觸性抑制不明顯，出現(xiàn)“成瘤性”生長(zhǎng)(圖4)。2.3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果FlTC標(biāo)記免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，感染了EBV的GES-1細(xì)胞有EBNA1。2.4細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線如圖3，可見(jiàn)EBV感染細(xì)胞及c-myc基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)量均顯著高于空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并隨培養(yǎng)時(shí)間增加，這一差異越來(lái)越明顯;空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)與正常GES-1細(xì)胞相比差異無(wú)顯著性(圖3)。2.5細(xì)胞周期測(cè)定經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，EBV感染和c-myc基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞S期細(xì)胞比例[(70.%±0.91%)和(67%±3.06%)]顯著高于pcDNA3轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞(34.74%±1.03%)，差異有顯著性(P<0.05)。而EBV感染與PAR-2基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞之間，以及pcDNA3轉(zhuǎn)染細(xì)胞與正常GES-1細(xì)胞(49.35%±1.16%)之間差異無(wú)顯著性。3討論EBV是人類皰疹病毒N型，屬DNA腫瘤病毒，EBV在人群中廣泛存在，多數(shù)人幼兒期就感染EBV，且終生攜帶。EBV與BL、鼻咽癌(NPC)的關(guān)系最為明確，近年來(lái)EBV在上皮源性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用備受關(guān)注。1990年等[1]Burke首次報(bào)道了1例EBV陽(yáng)性胃癌以來(lái)，EBV感染與胃癌的關(guān)系受到關(guān)注。c-myc原癌基因在多種人類腫瘤細(xì)胞中均有擴(kuò)增和高表達(dá)。有研究表明，在EBV相關(guān)的多種腫瘤如BL、NPC中都存在。my基因高表達(dá)[3]，而PAR-2基因過(guò)度表達(dá)可以改變細(xì)胞內(nèi)基因調(diào)控，引起其他癌基因的活化或抑癌基因的失活，使細(xì)胞易于轉(zhuǎn)化為惡性表型，從而啟動(dòng)或加速腫瘤發(fā)生[4，5]。在對(duì)人鼻咽上皮細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，c-my基因表達(dá)增高能激活端粒酶活性，從而誘發(fā)腫瘤。有報(bào)道EBV陽(yáng)性胃癌表達(dá)EBNA1、BARFO、BARE1和EBERs[6~8]，將BARE1基因?qū)敕侵铝鲂詌ouckes淋巴細(xì)胞中可活化PAR-2原癌基因[9]。另外，臨床病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)患有PAR-2產(chǎn)物陽(yáng)性浸潤(rùn)性胃癌的病人預(yù)后明顯差于PAR-2產(chǎn)物陰性腫瘤的病人[10]。因此推測(cè)PAR-2基因在EBV相關(guān)胃癌的形成過(guò)程中起到一定的作用。實(shí)驗(yàn)中用的GES-1細(xì)胞為SV40感染原代培養(yǎng)的胎兒正常胃黏膜上皮細(xì)胞建立的細(xì)胞系，染色體為近三倍體(50~60之間)。除了轉(zhuǎn)化特性之外，GES-1細(xì)胞基本保留了正常的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，角蛋白反應(yīng)陽(yáng)性，接種在裸鼠中6個(gè)月觀察無(wú)致瘤性，此細(xì)胞系為研究胃上皮細(xì)胞癌變提供重要的模式系統(tǒng)。Akata細(xì)胞來(lái)源于EBV陽(yáng)性BL病人，通過(guò)同源重組插入一個(gè)新霉素抗性基因(Neo)，因此具有G418抗性。經(jīng)抗免疫球蛋白處理后，能產(chǎn)生大量重組EBV(每個(gè)細(xì)胞含EBV質(zhì)粒20個(gè)拷貝)。Akata細(xì)胞適合重組EBV克隆繁殖，是探測(cè)EBV遺傳學(xué)的有效工具，使EBV作為基因治療的載體成為可能[10]。本實(shí)驗(yàn)中，感染上皮細(xì)胞前，Akata細(xì)胞以0.5%山羊抗人降解血清預(yù)處理，目的即是產(chǎn)生大量重組EBV。由于Akata細(xì)胞中含另一個(gè)藥物敏感基因(大T基因)，因此培養(yǎng)基中加人1pmol的更昔洛韋后，Akata細(xì)胞被除去。用Imai等[11]創(chuàng)立的密切接觸法使人胃上皮細(xì)胞系GES-1感染重組EBV，用堿裂解法獲得質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)酶切鑒定后采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將PAR-2基因轉(zhuǎn)入GES-1細(xì)胞，以pcDNA3空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染同一細(xì)胞為對(duì)照，由于pcDNA3攜帶GADPH基因，因此也具有G418抗性。經(jīng)過(guò)G418篩選得到EBV感染和PAR-2基因轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性克隆。對(duì)感染和轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行鑒定，用熒光(ME)和辣根過(guò)氧化物酶(HIiP)兩種標(biāo)記方法，細(xì)胞均被染成亮綠色或棕褐色，說(shuō)明感染和轉(zhuǎn)染獲得成功，細(xì)胞均為陽(yáng)性克隆。本實(shí)驗(yàn)中，用細(xì)胞計(jì)數(shù)和Mil兩種方法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，結(jié)果均顯示從第3天開(kāi)始EBV感染組與c-myc基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)速度與對(duì)照組相比明顯加快，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，這一差距越來(lái)越明顯，到第7天EBV感染組細(xì)胞達(dá)到3.85×105個(gè)，幾乎為對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量的2倍，PAR-2基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞數(shù)為3.14×105個(gè)，與感染組相比差異無(wú)顯著性。細(xì)胞周期測(cè)定顯示感染與轉(zhuǎn)染組細(xì)胞S期細(xì)胞數(shù)目增多，兩組之間差異無(wú)顯著性