昆明山海棠化學(xué)成分、生物活性及相關(guān)指紋圖譜初探

昆明山海棠化學(xué)成分、生物活性及相關(guān)指紋圖譜初探本論文共分為五章：第一章綜述雷公藤屬植物的化學(xué)成分與生物活性研究進(jìn)展；第二章詳細(xì)敘述雷公藤屬植物昆明山海棠的化學(xué)成分研究：第三章對(duì)分離的化學(xué)成分進(jìn)行生物活性評(píng)價(jià)；第四章對(duì)雷公藤屬藥物的色譜指紋圖譜進(jìn)行了初步研究；第五章對(duì)本論文所做工作進(jìn)行總結(jié)和討論。植物毒素是一種重要的生命現(xiàn)象,蘊(yùn)涵著大量奧妙復(fù)雜的重要生物學(xué)信息。在許多傳統(tǒng)的有毒藥用植物中,毒性成分即其活性成分,只要控制好用法和用量,能在一些疑難雜癥如癌癥中起到很好的治療作用。因此,我們對(duì)傳統(tǒng)有毒藥用植物昆明山海棠的化學(xué)成分及生物活性進(jìn)行研究,配合其毒性找出活性成分,以期獲得具有顯著生物活性的先導(dǎo)化合物。衛(wèi)矛科(Celastraceae)雷公藤屬(Tripterygium)植物為有毒木質(zhì)藤本植物。該屬植物在我國(guó)共有三種：雷公藤(Tripterygiumwilfordii),昆明山海棠(T.hypoglaucum)和東北雷公藤(T.regelii),分別分布于長(zhǎng)江流域、西南及東北地區(qū)。該屬植物民間應(yīng)用歷史悠久,用于治療各種腫脹、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及其它炎癥、腫瘤、各種皮膚病等,還可用作植物殺蟲(chóng)劑。昆明山海棠與雷公藤的化學(xué)成分十分相似,但毒性略低于雷公藤,相較于后者的大量研究,前者研究相對(duì)較少,故實(shí)驗(yàn)選取昆明山海棠為研究對(duì)象,進(jìn)一步研究其化學(xué)成分及活性。本論文對(duì)采自云南大理蒼山的昆明山海棠的化學(xué)成分與生物活性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。綜合利用各種色譜分離材料,如硅膠、凝膠LH-20、反相鍵合材料RP-18、Toyopear1、ODS等對(duì)昆明山海棠莖葉進(jìn)行化學(xué)成分的分離純化,并應(yīng)用現(xiàn)代波譜學(xué)手段,包括核磁共振技術(shù)(NMR)、質(zhì)譜(MS)、紫外(UV)等對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。共分離鑒定了45個(gè)化合物。包括5個(gè)新化合物,分別命名為：19-O-β-D-glucopyranosyl-labda-8(17),14-dien-13-ol(1),3-oxo-14,15-dihydroxy-abieta-8,11,13-trien-19-ol(2),isopimara-8(14),15-diene-11β,19-diol(3),isopimara-8(14),15-diene-12α,19-diol(4),和2α,16α-hydroxy-ent-kauran-19,20-olide(5);2個(gè)新天然產(chǎn)物,分別鑒定為：20β-β-D-glucopregn-4-en-3-one(32),20α-β-D-glucopregn-4-en-3-one(33),為兩個(gè)甾體糖苷類(lèi)化合物；此外還包括已知二萜7個(gè),分別鑒定為：雷公藤甲素(triptolide)(6),2-表雷公藤乙素(2-epitripdiolide)(7),wilforolF(8),triptobenzeneA(9),isopimara-8(14),15-diene-17,19-diol(10),tripterinin(11)和tripterifordin(12);三萜類(lèi)12個(gè),均為齊嫩果烷型三萜：木脂素類(lèi)7個(gè),為雙四氫呋喃型木脂素和倍半木脂素；甾體3個(gè)；其它類(lèi)型化合物9個(gè),含芳香小分子、脂肪酸甘油酯等。化合物1為一半日花烷型二萜苷,C-19位上的甲基被β-D-葡萄糖取代；化合物2是雷公藤屬植物中較常見(jiàn)的松香烷型二萜,該類(lèi)型二萜約占所有二萜類(lèi)成分的三分之二,2的C-15位發(fā)生羥基取代；化合物3和4屬異海松烷型二萜,分別在C環(huán)上C-11和12位有羥基取代,且兩者A環(huán)上的19位甲基也被羥基取代；化合物5為貝殼杉烷型二萜,與己知二萜不同的是A環(huán)上C-2位的羥基取代。我們對(duì)從昆明山海棠中分離得到的化合物進(jìn)行了體外抗腫瘤活性與抗炎活性評(píng)價(jià)?？鼓[瘤活性試驗(yàn)采用5種人腫瘤細(xì)胞模型,分別為A549(肺癌細(xì)胞)、DU145(前列腺癌細(xì)胞)、KB(口腔表皮樣癌細(xì)胞)、KBvin(口腔上表皮細(xì)胞癌耐藥株)和MDA-MB-231(乳腺癌細(xì)胞),使用臨床抗腫瘤藥物紫杉醇作為陽(yáng)性對(duì)照品。試驗(yàn)結(jié)果提示,化合物6和7對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的抗腫瘤活性,IC50值為0.0012-0.1306μM,對(duì)KB腫瘤耐藥細(xì)胞株KBvin也有良好的細(xì)胞毒活性,而紫杉醇則完全失效,IC50值分別為0.1306和0.0044μM?？寡谆钚灾饕ㄟ^(guò)自由基清除率和彈性蛋白酶釋放抑制率來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,三個(gè)齊墩果烷型三萜酸類(lèi)化合物13、14、15具有較好的抗炎活性。結(jié)合文獻(xiàn),提示昆明山海棠中的齊墩果烷型三萜酸在植物的整體抗炎活性中具有重要作用。以上活性評(píng)價(jià)結(jié)果表明,萜類(lèi)成分是昆明山海棠的主要活性成分,其它類(lèi)型成分也起到一定的協(xié)同作用。論文第四章對(duì)三種雷公藤屬藥材木質(zhì)部和三種雷公藤制劑進(jìn)行了初步指紋圖譜研究,并對(duì)幾種實(shí)驗(yàn)分離得到的單體成分在原藥材圖譜中進(jìn)行指認(rèn)。采用液相色譜系統(tǒng),配合二極管陣列檢測(cè)器(DAD)和蒸發(fā)光檢測(cè)器(ELSD)兩種檢測(cè)方式,KromasilC18色譜柱(4.6mm×25cm,5μm),以乙腈：水為流動(dòng)相梯度洗脫,流速為1mL/min。方法學(xué)考察表明,該色譜系統(tǒng)具有良好的精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。通過(guò)指紋圖譜對(duì)比,發(fā)現(xiàn)三種藥材中產(chǎn)地同為云南的昆明山海棠和雷公藤的化學(xué)成分更加接近,只是含量有所差異,而東北雷公藤的化學(xué)成分與前兩者區(qū)別相對(duì)較大。三種片劑的化學(xué)成分相似度較高,可能與其藥材來(lái)源、部位相似以及使用相似的生產(chǎn)工藝有關(guān)。最后,用HPLC法對(duì)三種藥材中的主要活性成分雷公藤甲素進(jìn)行了含量測(cè)定,分別為7.38、7.16和9.15μg/g。通過(guò)對(duì)昆明山海棠莖葉的研究結(jié)果及與文獻(xiàn)的對(duì)比發(fā)現(xiàn)：昆明山海棠根皮、木質(zhì)部、莖葉的化學(xué)成分差異較大,莖葉部分所含的雷公藤甲素及萜