高效液相色譜HPLC基本原理

關(guān)于高效液相色譜HPLC基本原理1）高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜方法的比較高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速大增加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需時(shí)數(shù)小時(shí)。高效：填充物顆粒極細(xì)且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻力小，因而柱效很高?？梢栽跀?shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的分離。高靈敏度：檢測(cè)器靈敏度極高：UV—10-9g,熒光檢測(cè)器—10-11g。2）HPLC與GC的比較分析對(duì)象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點(diǎn)的穩(wěn)定化合物，而這些物質(zhì)只點(diǎn)有機(jī)物總數(shù)的20%；HPLC可以分析高沸點(diǎn)、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，這類物質(zhì)占有機(jī)物總數(shù)的80%。流動(dòng)相的選擇：GC采用的流動(dòng)相中為有限的幾種“惰性”氣體，只起運(yùn)載作用，對(duì)組分作用??；HPLC采用的流動(dòng)相為液體或各種液體的混合，可供選擇的機(jī)會(huì)多。它除了起運(yùn)載作用外，還可與組分作用，并與固定相對(duì)組分的作用產(chǎn)生競(jìng)爭，即流動(dòng)相對(duì)分離的貢獻(xiàn)很大，可通過溶劑來控制和改進(jìn)分離。操作溫度：GC需高溫；HPLC通常在室溫下進(jìn)行。第2頁,共47頁，2024年2月25日，星期天極性增加不溶于水溶于水非極性離子非離子極性吸附反向分配分配正向分配離子交換尺寸排阻凝膠滲透凝膠過濾分子量3）應(yīng)用由于HPLC分離分析的高靈敏度、定量的準(zhǔn)確性、適于非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定組分的分析，因此，在工業(yè)、科學(xué)研究，尤其是在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等方面應(yīng)用極為廣泛。如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、烴、碳水化合物、藥品、多糖、高聚物、農(nóng)藥、抗生素、膽固醇、金屬有機(jī)物等分析，大多是通過HPLC來完成的。右圖是各種HPLC方法的應(yīng)用范圍及對(duì)象第3頁,共47頁，2024年2月25日，星期天二、HPLC儀器

HPLC儀器包括：高壓輸液裝置;

進(jìn)樣系統(tǒng);

分離系統(tǒng);

檢測(cè)系統(tǒng);

此外還配有梯度淋洗、自動(dòng)進(jìn)樣和數(shù)據(jù)處理裝置。其工作過程如圖所示。第4頁,共47頁，2024年2月25日，星期天He儲(chǔ)液瓶分布器過濾2

m高壓泵入口檢查出口檢查脈流消除抽氣過濾器反壓調(diào)節(jié)壓力計(jì)注樣閥分離柱到檢測(cè)器第5頁,共47頁，2024年2月25日，星期天1.高壓輸液系統(tǒng)1）貯液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過濾器(Ni合金)，其孔徑約2m，可防止顆粒物進(jìn)行泵內(nèi)。第6頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2）溶劑脫氣系統(tǒng)：為什么需要脫氣防止在檢測(cè)器中產(chǎn)生氣泡，引起噪音。除去氧氣的影響。超聲波脫氣真空加熱脫氣

He氣鼓泡脫氣在線脫氣機(jī)脫氣

溶劑通過脫氣器中的脫氣膜，相對(duì)分子量小的氣體透過膜從溶劑中除去。第7頁,共47頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共47頁，2024年2月25日，星期天在線真空脫氣和He脫氣對(duì)保留時(shí)間在現(xiàn)性的影響第9頁,共47頁，2024年2月25日，星期天3）泵：

對(duì)輸液泵的要求：密封性好、輸液流量穩(wěn)定無脈動(dòng)、可調(diào)范圍寬、耐腐蝕。輸液泵種類：恒壓型和恒流型。恒壓泵(類似于風(fēng)箱)可迅速獲得高壓，適于柱的勻漿填充。但因泵腔體積大，在往復(fù)推動(dòng)時(shí)，會(huì)引起脈動(dòng)，且輸出流量隨色譜系統(tǒng)阻力（主要是柱填充物）變化而變化，現(xiàn)已較少使用。恒流型溶劑流量恒定，與柱填充情況無關(guān)，使用較多。有機(jī)械注射式和機(jī)械往復(fù)式兩種。應(yīng)用最多的是機(jī)械往復(fù)式恒流泵(見下圖。每分鐘往復(fù)25~100次，因此脈動(dòng)小。對(duì)流量變化敏感的檢測(cè)器也會(huì)有噪聲干擾，此時(shí)可連接一脈動(dòng)阻尼器)。第10頁,共47頁，2024年2月25日，星期天串聯(lián)泵單元泵原理第11頁,共47頁，2024年2月25日，星期天單元泵工作原理AuthoringDivisionNameFileNameSecurityNotice(ifrequired)Damper阻尼器Seal密封墊Piston活塞桿BallScrewDriveGearOutletBallValve出口單向閥ActiveInletValve入口單向閥Purgevalve沖洗閥第12頁,共47頁，2024年2月25日，星期天溶劑傳輸系統(tǒng)工作原理往復(fù)活塞泵(單向閥)（密封金墊）GoldSealSapphireInsertRubyBallSpringInsert入口出口自溶劑瓶至液相系統(tǒng)第13頁,共47頁，2024年2月25日，星期天4）梯度洗脫裝置：在分離過程中逐漸改變流動(dòng)相組成的裝置。如果只有一個(gè)泵，可采用低壓混合設(shè)計(jì)（將兩種或以上的溶劑按一定比例混合，再由高壓泵輸出）；如果有兩個(gè)或以上泵，調(diào)節(jié)各自的流量，在高壓下混合。第14頁,共47頁，2024年2月25日，星期天低壓梯度第15頁,共47頁，2024年2月25日，星期天高壓梯度第16頁,共47頁，2024年2月25日，星期天第17頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2.進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣裝置包括兩種：1）手動(dòng)進(jìn)樣器：目前最常用的為六通閥。由于進(jìn)樣量可由樣品管控制，因此進(jìn)樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好，如圖。裝入樣品出口進(jìn)樣采樣環(huán)泵入溶劑進(jìn)色譜柱第18頁,共47頁，2024年2月25日，星期天ToWasteSampleLoop(FixedVolume)FromToColumnSampleSyringeLoadInjectToColumnPumpFromPumpToWaste手動(dòng)進(jìn)樣器－六通閥第19頁,共47頁，2024年2月25日，星期天第20頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2）自動(dòng)進(jìn)樣器第21頁,共47頁，2024年2月25日，星期天工作原理第22頁,共47頁，2024年2月25日，星期天第23頁,共47頁，2024年2月25日，星期天3.色譜柱1）對(duì)色譜柱的要求：內(nèi)壁光滑的優(yōu)質(zhì)不銹鋼柱，柱接頭的死體積盡可能小。柱長多為15~30cm，內(nèi)徑為4~5mm(尺寸排阻色譜柱常大于5mm，制備色譜柱內(nèi)徑更大)；2）柱的填充：主要采用勻漿法。根據(jù)使用勻漿試劑的性質(zhì)不同可分為：平衡密度法：即使溶劑密度和填充顆粒密度相近，此時(shí)顆粒沉降速度趨于0。常用的勻漿試劑有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；非平衡密度法：當(dāng)采用粘度較大的試劑，如CC4，CH3OH,丙酮，二氧雜環(huán)已烷、THF等。填充方法：填充時(shí)，按上述方法制作勻漿液，用流動(dòng)相充滿色譜柱及其延長管中，然后將勻漿液倒入勻漿填充器，在較高壓力下迅速將其注入色譜柱內(nèi)。要求填充速度快(防凝聚、沉降或結(jié)塊)、且無空氣進(jìn)入(影響填充均勻性)。第24頁,共47頁，2024年2月25日，星期天0.090in.0.130in.0.090in.0.170in.SwagelokWatersParkerRheodyneValcoUptight0.090in.0.080in.第25頁,共47頁，2024年2月25日，星期天柱溫箱第26頁,共47頁，2024年2月25日，星期天第27頁,共47頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共47頁，2024年2月25日，星期天第29頁,共47頁，2024年2月25日，星期天第30頁,共47頁，2024年2月25日，星期天4.檢測(cè)器液相色譜檢測(cè)器包括紫外吸收、熒光發(fā)射、示差折光和安培檢測(cè)器等。1）紫外檢測(cè)器其檢測(cè)原理和UV-Vis方法一樣。只是，此時(shí)所采用的吸收池為微量吸收池，通常其光程為2-10mm,體積約為1~10

L。

HPLC分析中，約有80%的物質(zhì)可以在254nm或280nm處產(chǎn)生紫外吸收。因此該類檢測(cè)器應(yīng)用很廣。

在選擇測(cè)量波長時(shí)注意：溶劑必須能讓所選擇的光透過，即所選波長不能小于溶劑的最低使用波長。石英窗接色譜柱UV光電倍增管廢液第31頁,共47頁，2024年2月25日，星期天LampOpticalmirrorsGratingDetectorcellSlitBeamsplitter第32頁,共47頁，2024年2月25日，星期天TungstenlampLensDeuteriumlampLenssystemHolmiumfilterDetectorcellOpticalslitGratingDiodeArray第33頁,共47頁，2024年2月25日，星期天TimeWavelengthmsecnmLIGHTSHIFTREGISTERSWITCHVIDEOLINEREADOUTCYCLEPHOTODIODECAPACITORTRANSISTOR第34頁,共47頁，2024年2月25日，星期天第35頁,共47頁，2024年2月25日，星期天第36頁,共47頁，2024年2月25日，星期天TakepeakspectrumComparewithlibraryMatch:998Chlortoluron?250300Wavelength(nm)250300Wavelength(nm)*LibrarySearchingmaybeperformedinanautomatedfashion.SpectralLibraries:Principle第37頁,共47頁，2024年2月25日，星期天2）熒光檢測(cè)器許多有機(jī)物具熒光活性，尤其是芳香族化合物具有很強(qiáng)的活性。熒光檢測(cè)器是一種選擇性很強(qiáng)的檢測(cè)器，其靈敏度比UV檢測(cè)器高2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。第38頁,共47頁，2024年2月25日，星期天第39頁,共47頁，2024年2月25日，星期天3）示差折光檢測(cè)器原理：利用兩束相同角度的光照射溶劑相和樣品+溶劑相，利用二者對(duì)光的折射率不同，其中一束（通常是通過樣品+溶劑相）光因?yàn)榘l(fā)生偏轉(zhuǎn)造成兩束光的強(qiáng)度差發(fā)生變化，將此差示信號(hào)放大并記錄，該信號(hào)代表樣品的濃度。為通用型檢測(cè)器，靈敏度為10-7g/mL。但對(duì)溫度變化敏感，且不適于梯度淋洗。第40頁,共47頁，2024年2月25日，星期天第41頁,共47頁，2024年2月25日，星期天第42頁,共47頁，2024年2月25日，星期天第43頁,共47頁，2024年2月25日，星期天第44頁,共47頁，2024年2月25日，星期天第45頁,共47頁，2024年2月25日，星期天4）安培檢測(cè)器由恒電位儀和一薄層反應(yīng)池（體積