細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)及檢測(cè)邊曄

Hela細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)及檢測(cè)生05邊曄2010030026周二班同組同學(xué)：解智博實(shí)驗(yàn)背景細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(apoptosis)或程序化細(xì)胞死亡(programmedcelldeath,PCD)，是多細(xì)胞有機(jī)體為調(diào)控機(jī)體發(fā)育，維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程，是細(xì)胞衰老自然死亡的主要方式之一，并強(qiáng)調(diào)這一過(guò)程是一種自然的生理學(xué)過(guò)程。由于細(xì)胞凋亡受到嚴(yán)格的由遺傳機(jī)制決定的程序性調(diào)控，所以又被稱為程序化細(xì)胞死亡。DAPI染色DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)﹐為一種熒光染料，可以穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞核中的雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)揮標(biāo)記的作用，可以產(chǎn)生比DAPI自身強(qiáng)20多倍的熒光。顯微鏡下可以看到顯藍(lán)色熒光的細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞標(biāo)記的效率高(幾乎為100%)，且對(duì)活細(xì)胞無(wú)毒副作用。實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)取Hela細(xì)胞（35mm平皿中培養(yǎng)）鏡檢，觀察細(xì)胞形狀、數(shù)目、密度、污染狀況等。吸棄皿中的培養(yǎng)基，再加入1mlPBS溶液洗去殘余培養(yǎng)基，棄掉培養(yǎng)皿中液體。加入1.5ml新鮮的完全培養(yǎng)基，加入150lH2O2，至終濃度為0.8mmol/L。標(biāo)記，放入1號(hào)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡檢測(cè)取前一天加過(guò)氧化氫培養(yǎng)的hela細(xì)胞，加入200l胰酶消化3分鐘，再加入適量PBS溶液并反復(fù)吹吸至細(xì)胞分散，轉(zhuǎn)移到1.5mLEP管中，1000rpm離心5分鐘吸出上清，于沉淀中加入100l甲醇，冰箱中固定10分鐘1000rpm離心5分鐘棄上清，加100lPBS洗滌沉淀細(xì)胞1000rpm離心5分鐘棄上清，加50lPBS溶液，0.5lDAPI染液，室溫染色10分鐘1000rpm離心5分鐘棄上清，加100lPBS洗滌1000rpm離心5分鐘棄上清，加15lPBS重懸細(xì)胞取15l懸液于玻片上并于正置熒光顯微鏡下觀察并拍照實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析細(xì)胞凋亡檢測(cè)圖1：細(xì)胞凋亡檢測(cè)（10x40）圖2：細(xì)胞凋亡檢測(cè)（10x40）如圖所示細(xì)胞中，可以見(jiàn)到較為分散且數(shù)量較少的染色亮斑；而且染色較深的區(qū)域呈彌散狀，散布在細(xì)胞的各個(gè)位置，經(jīng)確認(rèn)應(yīng)為處于凋亡細(xì)胞。但由于從誘導(dǎo)到檢測(cè)的培養(yǎng)時(shí)間不足20小時(shí)，所以觀察到的凋亡細(xì)胞比例較低。如果24小時(shí)后再檢測(cè)，可能觀察到的凋亡細(xì)胞會(huì)變多。討論凋亡檢測(cè)注意事項(xiàng)為使得細(xì)胞充分接觸固定液，應(yīng)輕柔用移液器混合、懸浮細(xì)胞，以獲得較好的固定效果。經(jīng)過(guò)多步離心，經(jīng)常出現(xiàn)到了某一步就看不到沉淀在哪兒的情況了，但只要記住離心管放置位置，這樣就能知道細(xì)胞被離到哪一側(cè)，用槍頭吸去液體的時(shí)候就不用擔(dān)心誤把細(xì)胞吸走了。染色時(shí)時(shí)間可以稍長(zhǎng)一些，并注意避光，這樣染色效果較好。制片時(shí)為防止長(zhǎng)時(shí)間等待拍照而干片，可多取一些懸液，15~20l左右即可。完成細(xì)胞染色到最終的觀察中間經(jīng)歷的時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，否則可能導(dǎo)致染色的效果不好；細(xì)胞不應(yīng)當(dāng)在紫外燈下經(jīng)歷太長(zhǎng)時(shí)間，否則可能導(dǎo)致熒光淬滅。實(shí)驗(yàn)總結(jié)本實(shí)驗(yàn)是以細(xì)胞傳代培養(yǎng)為基礎(chǔ)，緊接著HE染色做的。因此主要的培養(yǎng)操作已在前一報(bào)告中記錄。本次試驗(yàn)的重點(diǎn)是凋亡的檢測(cè)，包括一系列離心步驟及染色，熒光觀察等等。學(xué)習(xí)了DAPI染色技術(shù)，了解了對(duì)DNA染色的方法，對(duì)細(xì)胞凋亡有了更直觀的了解，也熟悉了熒光顯微鏡的使用，更進(jìn)一步熟悉了顯微拍照技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)中由于離心后操作不當(dāng)，導(dǎo)致細(xì)