宮頸細(xì)胞DNA倍體分析檢測(cè)宮頸病變的臨床價(jià)值主要內(nèi)容

宮頸細(xì)胞DNA倍體分析檢測(cè)宮頸病變的臨床價(jià)值主要內(nèi)容50年來宮頸癌篩查雖然大大減少了發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)達(dá)地區(qū)宮頸癌的發(fā)病率與死亡率，而在發(fā)展中國(guó)家以及經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)等衛(wèi)生資源缺乏的地區(qū)，宮頸癌的發(fā)病率與死亡率雖有所減低，但實(shí)際上仍比發(fā)達(dá)國(guó)家高許多。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)，28年，在發(fā)展中國(guó)家，宮頸癌的新發(fā)病例則位于第二位［28］。2012年，WHO估計(jì)世界范圍內(nèi)的宮頸癌新發(fā)病例為52.8萬(wàn)，85%發(fā)生于經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)，中國(guó)新增患者6.20萬(wàn)［10］。在這些國(guó)家和地區(qū)，普遍存在著人基數(shù)大、衛(wèi)生資源缺乏、病理醫(yī)生缺乏，尤其是出色的細(xì)胞病理學(xué)醫(yī)生，以及經(jīng)濟(jì)基礎(chǔ)和實(shí)力不夠的情況，這些情況無疑放大了細(xì)胞學(xué)檢查的不標(biāo)準(zhǔn)性、不確定性、不穩(wěn)定性。由于病理醫(yī)師缺乏以及水平低下，一些地區(qū)甚至摒棄細(xì)胞學(xué)檢查，而采用靈敏度較低的宮頸醋酸白染色（VLI）以及宮頸盧戈氏碘染色（VILI）作為宮頸癌的初篩［26,29］。近年來國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道細(xì)胞DNA倍體分析作為新的光電自動(dòng)檢測(cè)法來行宮頸癌癌前評(píng)價(jià)［1，3~6］。宮頸脫落細(xì)胞DNA倍體分析較宮頸細(xì)胞的TBS分類診斷用于宮頸癌篩查是否有更高或者相當(dāng)?shù)撵`敏度，能否在三階梯篩查中取代TCT,實(shí)現(xiàn)宮頸癌篩查的自動(dòng)化、智能化以及標(biāo)準(zhǔn)化是本研究的目的。1.對(duì)象與方法1.1研究對(duì)象選取2013年2月至2013年10月在夷陵婦幼保健院婦科門診及住院接受宮頸癌篩查的942例患者，同時(shí)進(jìn)行宮頸細(xì)胞DNA倍體分析和TCT檢查，其中96例因?qū)m頸細(xì)胞DNA倍體分析異常、98例因TCT檢查異常、94例因上述兩項(xiàng)檢查均異常行陰道鏡引導(dǎo)下宮頸活檢，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。108例因功能失調(diào)性子宮出血或子宮腺肌病或多發(fā)子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)而獲得宮頸病理檢查結(jié)果，而DNA倍體分析以及TCT檢查均未提示異常。這四種情況共396例患者中，年齡最大69歲，最小21歲，平均年齡40.32+8.3歲。1.2研究方法1.2.1取材常規(guī)暴露宮頸，用武漢蘭丁醫(yī)學(xué)高科技有限公司配套的一次性宮頸細(xì)胞采集刷插入宮頸1-1.5cm，直到采樣器的外部刷毛接觸到宮頸，以順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)5-10周后慢慢取出，收集宮頸及宮頸管內(nèi)脫落細(xì)胞，將其放入相應(yīng)的含有固定液的樣本保存管中，下推其刷頭入管，擰緊瓶蓋。1.2.2制片、染色充分振蕩樣本保存管，以減少宮頸脫落細(xì)胞在宮頸采樣刷上的黏附，取出宮頸采樣刷。將標(biāo)本由樣本保存管移至含有30ml固定液的標(biāo)本收集管中，加入酶消化液，振蕩120min（150次/min），離心5min（8rpm），50%乙醇清洗，離心2次，棄上清液，加固定劑2-3ml，振蕩，混勻，加2ul細(xì)胞懸液入細(xì)胞離心管，離心、甩片5min，制成液基薄層細(xì)胞片2張。1張采用巴氏染色做常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查，另1張采用Feulgen染色進(jìn)行DNA倍體分析。1.2.3檢測(cè)方法DNA倍體分析使用LDDNA-ICM系統(tǒng)進(jìn)行分析，后者由奧林巴斯BX41顯微鏡、浪潮NP370D2服務(wù)器、自動(dòng)控制平臺(tái)以及控制系統(tǒng)、ueyeM2240攝像頭以及相應(yīng)的輔助配件組成。在軟件方面安裝了武漢蘭丁醫(yī)學(xué)高科技有限公司自行研制的細(xì)胞圖像分析軟件。操作人員為一般的技術(shù)人員。細(xì)胞學(xué)檢查由具有資質(zhì)的病理醫(yī)生閱片，采用TBS系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分級(jí)判斷，細(xì)胞學(xué)結(jié)果異常的需經(jīng)病理主任醫(yī)師確認(rèn)。1.2.4陰道鏡檢查及病理學(xué)檢查凡是宮頸常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果為未明確診斷意義的不典型鱗狀上皮細(xì)胞（ASCUS）及以上，包括ASCUS、低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）、不排除高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變的ASCUS（ASC-H）、不典型腺細(xì)胞（AGC）、鱗癌、腺癌，均認(rèn)為細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果異常；當(dāng)細(xì)胞DNA值>5時(shí)，即可認(rèn)為是DNA異倍體細(xì)胞，DNA倍體分析結(jié)果可分為未見DNA異倍體細(xì)胞、見少量DNA異倍體細(xì)胞（有1~2個(gè)異倍體細(xì)胞）、可見DNA異倍體細(xì)胞（有3~14個(gè)異倍體細(xì)胞）、大量DNA異倍體細(xì)胞（有異倍體細(xì)胞15個(gè)及以上）。凡DNA倍體分析提示有DNA倍體異常細(xì)胞，均認(rèn)為DNA倍體分析檢查結(jié)果異常。兩項(xiàng)檢查有一結(jié)果異常，則行陰道鏡檢查并多點(diǎn)活檢。部分病例雖然上述檢查未提示異常，但是肉眼觀察宮頸顆粒樣外觀、網(wǎng)格狀血管走行等情況下，也行陰道鏡引導(dǎo)下的宮頸活檢。病理診斷分為無病變組（NILM,包括慢性宮頸炎伴或不伴鱗狀上皮增生、濕疣樣改變、乳頭狀糜爛及息肉樣增生等改變）、CINI（包括CINI累腺）、CINII（包括CINI~II級(jí)、CINII級(jí)、以及兩者的累腺情況）、CINII<包括CINII~I級(jí)、CINIII級(jí)、以及兩者的累腺情況）、宮頸癌（原位癌、鱗癌、腺癌、腺鱗癌等）。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2.結(jié)果DNA倍體分析結(jié)果與宮頸活檢組織病理學(xué)診斷的關(guān)系有一例因上皮細(xì)胞過少，DNA無法判讀，故行陰道鏡引導(dǎo)下宮頸組織活檢的396例病例中只有395個(gè)DNA倍體的分析報(bào)告。35例為CINII+病變，其中28例DNA倍體分析結(jié)果提示為異常。結(jié)果見表1。表1DNA倍體分析與宮頸組織病理結(jié)果的比較Tab1ComparisonofDNAploidyanalysisandcervicalbiopsyhistopathologyDNA異組織學(xué)診斷倍體無病宮頸合計(jì)細(xì)胞數(shù)CINICINIICINIII變癌（N）N=0185123400N=1~21057420118N=3~1439361049N=15~8169024合計(jì)3372319160395對(duì)DNA倍體分析與病理診斷結(jié)果做Spearman等級(jí)相關(guān)的SPSS計(jì)算結(jié)果顯示：相關(guān)系數(shù)rs=0.374>0，P=0.0<0.01，相關(guān)系數(shù)rs有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即隨著dna倍體分析級(jí)別的升高，病理診斷異常的可能也有逐漸提高的趨勢(shì)。見表2及圖1。表2：DNA診斷與病理診斷關(guān)系表2：DNA診斷與病理診斷關(guān)系DNA診斷病理診斷DNA診Pearson1.374**斷CorrelationSig.(2-tailed).0N395395病理診斷Pearson.374**1CorrelationSig.(2-tailed).0N395396**.Correlationissignificantatthe0.01level(2-tailed).圖1：DNA異倍體分析與病理診斷結(jié)果為CINII+之間的關(guān)系TCT結(jié)果與宮頸活檢組織病理學(xué)診斷的關(guān)系因血液成分過多TCT結(jié)果無法判讀，故396例中只有380個(gè)細(xì)胞學(xué)檢查報(bào)告。在CINII+病變中，TCT結(jié)果異常的有21例。結(jié)果見表2。隨著TBS診斷級(jí)別的升高，病理診斷CINII+的比例總體是不斷增加的，但是細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果為NILM與ASCUS的患者，其病理診斷CINII+的比例并無明顯區(qū)別(7.45%VS6.89%)。見表3，圖2。表3TCT與宮頸活檢組織病理結(jié)果的比較Tab3ComparisonofTCTandcervicalbiopsyhistopathology常規(guī)細(xì)胞學(xué)診斷NILM組織學(xué)診斷CINCINICINIIIII宮頸癌合計(jì)正常1668950188ASCUSIL530109ASCUS-H200002HSIL102407AGC000000合計(jì)3231716038024圖2：TBS診斷與病理診斷結(jié)果為CINII+之間的關(guān)系對(duì)TBS診斷與病理診斷結(jié)果做Spearman等級(jí)相關(guān)的SPSS計(jì)算結(jié)果顯示：相關(guān)系數(shù)rs=0.136>0，P=0.0<0.01，相關(guān)系數(shù)rs有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即隨著tbs診斷級(jí)別的升高，病理診斷異常的可能也有逐漸提高的趨勢(shì)。<span="">DNA倍體分析結(jié)果與宮頸細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果比較隨著細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果級(jí)別的升高，DNA異倍體細(xì)胞的比例也不斷升高。在細(xì)胞學(xué)結(jié)果為ASCUS中，有DNA異倍體細(xì)胞的比例為46.82%，而在細(xì)胞學(xué)結(jié)果為HSIL中，存在DNA異倍體細(xì)胞的比例高達(dá)1%。兩者的關(guān)系見圖3。圖3：宮頸細(xì)胞學(xué)檢查與DNA倍體分析結(jié)果的關(guān)系分別取細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果為ASCUS+為細(xì)胞學(xué)檢查陽(yáng)性、查見異倍體細(xì)胞即為DNA倍體分析陽(yáng)性，對(duì)此兩種檢測(cè)方法做配對(duì)卡方檢驗(yàn)，McNemar'sTest的結(jié)果為：P=0.659>0.05（ExcatSig（2-sided））,兩種方法診斷結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.4兩種宮頸癌篩查方法診斷試驗(yàn)的評(píng)價(jià)結(jié)果TCT診斷CINII+（宮頸高度病變及宮頸癌）的敏感度為57.6%，準(zhǔn)確度為50.8%；DNA倍體分析診斷CIN11+的敏感度為80%，準(zhǔn)確度為56.9%。詳見表4。表43種方案診斷宮頸CIN11+的比較TCTDNA倍體分析TCT+DNA倍體分析敏感度（%）57.68081.3特異度（%）50.154.726.8準(zhǔn)確度（%）50.856.931.4陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（%）9.914.79.3陰性預(yù)測(cè)值（%）92.696.693.9約登指數(shù)0.080.350.08陽(yáng)性似然比1.151.771.11陰性似然比0.850.370.7IRgCdiVawSlwSlUn

Cm—nHA湖HApIBS 村WiurK:。Ln圖4：DNA倍體分析與細(xì)胞學(xué)檢查以及兩者聯(lián)合診斷CINII+病變的ROC曲線圖4為DNA倍體分析、細(xì)胞學(xué)TBS診斷以及兩種方法聯(lián)合診斷CIN11+病變的ROC曲線，三者的曲線下面積分別為0.769、0.580、0.732結(jié)果提示，DNA倍體分析診斷CIN11+病變優(yōu)于單獨(dú)細(xì)胞學(xué)TBS診斷以及兩種的聯(lián)合應(yīng)用。3.討論細(xì)胞DNA定量分析技術(shù)主要通過對(duì)細(xì)胞核內(nèi)DNA含量或倍體的測(cè)定來判斷細(xì)胞的生理狀態(tài)和病理改變。目前主要是使用全自動(dòng)DNA圖像分析系統(tǒng)(DNA-ICM)。定量分析細(xì)胞DNA具有如下特點(diǎn)[30]:①檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)的相對(duì)DNA含量，而不是絕對(duì)值。常用c(content)作為單位來衡量DNA的含量。1個(gè)c為正常G0/G1細(xì)胞DNA含量的一半。②Feulgen染色使DNA特異性著色。其染色的深淺與DNA的含量成正比。③通過測(cè)量光密度（灰階）計(jì)算被測(cè)細(xì)胞細(xì)胞核的積分光密度值（IOD,integratedopticaldensity）④用DNA指數(shù)來表示DNA含量。DNA指數(shù)=被測(cè)細(xì)胞DNAIOD值/正常細(xì)胞DNAIOD平均值。⑤由于淋巴細(xì)胞內(nèi)DNA含量及形態(tài)較為穩(wěn)定，細(xì)胞DNA倍體分析時(shí)常用同一標(biāo)本的淋巴細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。⑤分析每個(gè)細(xì)胞的DNA含量，并用DNA直方圖，散點(diǎn)圖顯示標(biāo)本惡性度。按細(xì)胞DNA含量高低，由高到低自動(dòng)排序，將核酸含量高的前20個(gè)細(xì)胞核酸含量值直接報(bào)告，高于正常值為癌變細(xì)胞。（如圖5）。圖5：細(xì)胞DNA倍體分析報(bào)告圖ON,含量國(guó)止常心。淋巴垠偵茸

L附堀點(diǎn)赫泌圖5：細(xì)胞DNA倍體分析報(bào)告圖ON,含量國(guó)止常心。淋巴垠偵茸

L附堀點(diǎn)赫泌

頑卻杯.廣*坍M熟；由偷I.JT23.I26-芟,G.EJ2T[T>.?11329BG*045515.605715.523715.522^.,,<.153TO911.2^2215.T1D319.6咫9F.皈佻???1W1111.7214.8039UTSS'...,?14.1Qbf3 4flR7施宣告胃正?！碋C宮頸細(xì)胞的惡變由胞核染色質(zhì)首先改變，高危型HPV的DNA整合到宮頸細(xì)胞核DNA上，病毒蛋白E6/E7分別通過與抑癌蛋白P53、RB相作用，干擾中心體合成，紡錘絲缺陷，出現(xiàn)異倍體細(xì)胞核，最終才發(fā)展到晚期癌變細(xì)胞。這是細(xì)胞DNA定量分析技術(shù)可用于宮頸癌篩查的理論依據(jù)，也是全自動(dòng)DNA圖像分析系統(tǒng)在診斷CIN病變有可能較常規(guī)細(xì)胞學(xué)敏感的理論基礎(chǔ)。1924年Feulgen和Rossenbcek發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞核內(nèi)DNA染色技術(shù)后［25］，使得這一理論轉(zhuǎn)為實(shí)際應(yīng)用。這一技術(shù)才得以開展、應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室及臨床。早在24年，TheEuropeanSocietyoftheAnalyticalCellularPatholo就對(duì)DNA倍體分析適用于輔助診斷宮頸病變達(dá)成共識(shí)［11］。近十多年，不斷有DNA倍體分析技術(shù)用于臨床的報(bào)到［2,5,12-15,19］在婦產(chǎn)科，多限于對(duì)宮頸癌及癌前病變的DNA倍體分析［1,7,8,18,22,］而用于宮頸癌普查則報(bào)道的較少［3,6,21］本研究結(jié)果顯示，隨著細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果級(jí)別的升高，DNA異倍體細(xì)胞的比例也不斷升高，與NguyenVQ等［8］研究結(jié)果相似，同時(shí)，隨著DNA倍體分析級(jí)別的升高，病理診斷異常的可能也有逐漸提高的趨勢(shì)］此外，相對(duì)于單項(xiàng)篩查，宮頸細(xì)胞DNA倍體分析檢測(cè)出CIN11+病變的敏感性要高于細(xì)胞學(xué)的TBS診斷(80%VS57.6%)，兩者的特異度差別不大(54.7%VS50.1%)。就篩查方案而言，DNA倍體分析診斷CIN11+病變優(yōu)于單獨(dú)細(xì)胞學(xué)TBS診斷以及兩種的聯(lián)合應(yīng)用。當(dāng)然，宮頸細(xì)胞DNA倍體分析也有其不足之處［30］。目前宮頸癌的趨勢(shì)之一腺癌的比例，而腺癌細(xì)胞比起鱗癌細(xì)胞，更容易重疊，聚集成團(tuán)，造成一定程度的分割困難，DNA圖像分析系統(tǒng)極易將這類細(xì)胞視為垃圾細(xì)胞，不能做出診斷，增加了誤診和漏診率。此外，維生素B12缺乏、放療、化療、HPV病毒感染等因素均可能影響DNA含量的測(cè)定，目前實(shí)際所測(cè)得的數(shù)據(jù)并不能將這些影響因素加