測定蛋白質(zhì)含量測定方法的比較研究指導(dǎo)

PAGEPAGE3蛋白質(zhì)含量測定方法的比較研究劉曉庚(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院江蘇南京210003)摘要：索氏法。關(guān)鍵詞：Soxhlet法寫作提綱0前言。1測定蛋白質(zhì)方法分類和文獻(xiàn)分析概況。1.1測定蛋白質(zhì)方法分類。1.2蛋白質(zhì)方法測定的文獻(xiàn)概況及分析。2蛋白質(zhì)測定的經(jīng)典方法。2.1蛋白質(zhì)測定的經(jīng)典方法分類。2.2蛋白質(zhì)測定的經(jīng)典方法研究進(jìn)程或發(fā)展歷史。2.3蛋白質(zhì)測定的經(jīng)典方法局限性及改良策略。3蛋白質(zhì)測定的現(xiàn)代方法。3.1蛋白質(zhì)測定的現(xiàn)代方法分類。3.2蛋白質(zhì)測定的現(xiàn)代方法優(yōu)點(diǎn)。3.3蛋白質(zhì)測定的現(xiàn)代方法研究進(jìn)程或發(fā)展歷史蛋白質(zhì)測定的經(jīng)典方法局限性及改良策略。3.4蛋白質(zhì)測定的現(xiàn)代方法的局限性及改良策略。4結(jié)束語。5參考文獻(xiàn):[1]林萍,李蕾.聯(lián)立方程紫外分光光度法測定碘苯甲酸涂劑中苯甲酸、水楊酸的含量[J].華西藥學(xué)雜志,1999,14(4):278~279《蛋白質(zhì)測定方法法的比較研究》的寫作要求是：1、內(nèi)容的選取應(yīng)圍繞文章的中心。2、闡述一定要用自己的語言來進(jìn)行表述，切忌照搬照抄。3、小標(biāo)題也可以根據(jù)你的選材來自擬。4、對每種方法可以從原理、特點(diǎn)（含優(yōu)點(diǎn)）、存在的不足、應(yīng)用實(shí)例或應(yīng)用的實(shí)際效果分析、文獻(xiàn)來源，以及分析分析評論等方面進(jìn)行歸納總結(jié)。形式可以是表格式、文字式或圖文并茂式等，要不拘一格采用多種形式。如下表方式也可嘗試。表2光催化氧化劑的主要制備方法的比較Table2Compareofprimarypreparationmethodsofphotocatalysts方法名稱原理優(yōu)點(diǎn)/技術(shù)關(guān)鍵缺點(diǎn)適用范圍實(shí)例與文獻(xiàn)來源液相法溶膠-凝膠法制備溫度低，容易控制，純度高，成分均勻，分散性好，副反應(yīng)少，操作簡單，成本低廉等；在制備溶膠過程中，由于鈦醇鹽水解反應(yīng)速度很快，所以一般需加抑制劑來減緩其水解速度，常用的抑制劑有鹽酸、氨水和硝酸等效率低、生產(chǎn)自動(dòng)化程度不高、質(zhì)量控制較困難①見文獻(xiàn)[29-31]液相沉淀法設(shè)備簡單、工藝過程容易控制、成本較低等；國偉林等[32]利用超聲化學(xué)效應(yīng)，用鈦醇鹽水解沉淀法得到單分散性較好的銳鈦礦型納米二氧化鈦工藝流程長、廢液多、產(chǎn)物損失較大②見文獻(xiàn)[33]水熱法粒子純度高、分散性好、晶形好且可控制，生產(chǎn)成本低；通過光催化降解品紅的實(shí)驗(yàn)證明，微波水熱條件下制備的催化劑具有較高的光催化性能反應(yīng)環(huán)境要求較高見文獻(xiàn)[34]氣相法氣相沉積法沉積溫度低，均勻性和重復(fù)性較好，純度高，組分易控制，顆粒尺寸小、團(tuán)聚少等；注意控制溫度要求設(shè)備要求很高，溫度控制要求高，成本比較高合成了氮化鉬的纖維棒和中空管,同時(shí)得到了一些新的相[43]氣相水解法純度高，自動(dòng)化程度高，粒徑小，分散性好，表面活性高等；注意水蒸氣濃度的影響設(shè)備要求高，工藝參數(shù)的控制要求很精確見文獻(xiàn)[35]注：①②。5、文章的排版格式要按范文執(zhí)行。特別是要注意參考文獻(xiàn)的標(biāo)注。詳細(xì)內(nèi)容，請參見附件。有問題隨時(shí)反映，我會(huì)及時(shí)告知。最后，愿你能出色地早日完成。謝謝合作！劉曉庚老師2013－4－3附文獻(xiàn)：實(shí)驗(yàn)16 蛋白質(zhì)含量測定一、Folin—酚法(一)目的了解用Folin—酚法測定蛋白質(zhì)的含量。(二)材料用具及儀器藥品植物721型分光光度計(jì)、吸管、試管、試管架、容量瓶、移液管標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白質(zhì)溶液：稱取結(jié)晶酪蛋白100mg，用少量0.5mol/LNaOH溶液濕潤溶解，加蒸餾水定容至100ml，則配成1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液。Folin—酚試劑的配制：試劑A：1gNa2CO3溶于50ml的0.1mol/LNaOH溶液，另將0.5gCuSO4·5H2O溶于100ml的1%酒石酸鉀(或酒石酸鈉)溶液，實(shí)驗(yàn)時(shí)按前者：后者=50：1的比例混合，此混合液最多只能用一天。試劑B：將100g鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O)，25g鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)、700ml蒸餾水、再加50ml85%磷酸及100ml濃鹽酸置于1500ml的磨口圓底燒瓶中，充分混勻后，接上磨口冷凝管，回餾10小時(shí)，再加入硫酸鋰150g，蒸餾水50ml及液體溴數(shù)滴，開口煮沸15分鐘，驅(qū)除過量的溴(在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行)，冷卻，用蒸餾水稀釋至1000ml，過濾，濾液呈現(xiàn)微綠色，貯于棕色瓶中，臨用前，用酚酞作指示劑，用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定，根據(jù)滴定結(jié)果，將試劑稀釋至相當(dāng)于1mol/L酸度，備用。(三)原理Folin—酚法所用的試劑是由兩部分組成的，試劑A相當(dāng)于雙縮脲試劑，可與蛋白質(zhì)中的肽鍵起顯色反應(yīng)，試劑B(磷鎢酸和磷鉬酸混合液)在堿性條件下極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)(鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物)。在一定條件下，藍(lán)色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)的量成正比。(四)方法步驟1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線用標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液配制成濃度分別為：0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20mg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各10ml,將試管編號(hào)，依次向各管中加入上述蛋白質(zhì)溶液0.5ml和Folin—酚試劑A4ml，搖勻，室溫放置10分鐘后，再加入Folin—酚試劑B0.5ml,30分鐘后在分光光度計(jì)650nm波長下比色，測定OD值，以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，光刻度值為縱坐標(biāo)作光刻度一蛋白質(zhì)濃度曲線。2.樣品測定：準(zhǔn)確吸取樣液0.5ml于試管內(nèi)，加試劑A、B及比色等操作步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線操作，測出其OD值。3.計(jì)算用下式進(jìn)行計(jì)算：蛋白質(zhì)含量(mg/ml)=D×N/V式中：D為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的蛋白質(zhì)含量(mg/ml)；N為稀釋倍數(shù)；V為蛋白質(zhì)溶液的體積(ml)。(五)實(shí)驗(yàn)報(bào)告計(jì)算所測材料的蛋白質(zhì)含量。(六)思考題試說明Folin—酚法測定蛋白質(zhì)含量有什么優(yōu)缺點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)19植物組織中可溶性蛋白質(zhì)含量的測定第Ⅰ法考馬斯亮藍(lán)G–250染色法一、原理考馬斯亮藍(lán)G–250(Coomassiebrilliantblue，G-250)法是利用蛋白質(zhì)–染料結(jié)合的原理，定量地測定微量蛋白質(zhì)濃度的快速、靈敏的方法。考馬斯亮藍(lán)G-250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色。它和蛋白質(zhì)通過范德瓦爾鍵結(jié)合，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色由紅色形式轉(zhuǎn)變成藍(lán)色形式，最大光吸收由465nm變成595nm，通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。蛋白質(zhì)和染料結(jié)合是一個(gè)很快的過程，約2min即可反應(yīng)完全，呈現(xiàn)最大光吸收，并可穩(wěn)定1h，之后，蛋白質(zhì)–染料復(fù)合物發(fā)生聚合并沉淀出來。此法靈敏度高(比Lowry法靈敏4倍)，易于操作，干擾物質(zhì)少，是一種比較好的定量法。其缺點(diǎn)是在蛋白質(zhì)含量很高時(shí)線性偏低，且不同來源蛋白質(zhì)與色素結(jié)合狀況有一定差異。二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備(一)實(shí)驗(yàn)材料植物材料。(二)試劑1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(100μg/mL牛血清白蛋白)：稱取牛血清蛋白25mg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸餾水稀釋至100mL即可。2.考馬斯亮藍(lán)試劑：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50mL90%乙醇中，加入100mL85%(W/V)的磷酸，再用蒸餾水定容到1000mL，貯于棕色瓶中。常溫下可保存一個(gè)月。(三)儀器設(shè)備分光光度計(jì)，離心機(jī)，研缽，燒杯，量瓶，移液管，試管等。三、實(shí)驗(yàn)步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取6支試管，按表19–1加入試劑，搖勻，向各管中加入5mL考馬斯亮藍(lán)試劑，搖勻，并放置5min左右，以0號(hào)試管為空白對照，在595nm下比色測定吸光度。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.樣品測定(1)樣品提取稱取鮮樣0.25~0.5g，用5mL蒸餾水或緩沖液研磨成勻漿后，3000r/min離心10min，上清液備用。(2)吸取樣品提取液1.0mL(視蛋白質(zhì)含量適當(dāng)稀釋)，放入試管中(每個(gè)樣品重復(fù)2次)，加入5mL考馬斯亮藍(lán)試劑，搖勻，放置2min后在595nm下比色，測定吸光度，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量。表19-1繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的各試劑加入量試劑管號(hào)012345標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(mL)00.200.400.600.801.00蒸餾水量(mL)1.000.800.600.400.200蛋白質(zhì)含量(μg)020406080100四、結(jié)果計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的含量=(mg/g)式中：c—查標(biāo)準(zhǔn)曲線值，μg；VT—提取液總體積，mL；WF—樣品鮮重，g；VS—測定時(shí)加樣量，mL。第Ⅱ法Lowry法(勞里法)一、原理Lowry法是雙縮脲法(Biuret)和斐林(Folin)–酚法的結(jié)合與發(fā)展，其原理是：蛋白質(zhì)溶液用堿性銅溶液處理后，堿性銅試劑與蛋白質(zhì)中的肽鍵作用產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)，形成銅–蛋白質(zhì)的絡(luò)合鹽。再加入酚試劑后，在堿性條件下，這種被作用的蛋白質(zhì)上的酚類基團(tuán)極不穩(wěn)定，很容易還原酚試劑中的磷鎢酸和磷鉬酸，使之生成磷鎢藍(lán)和磷鉬藍(lán)的混合物。這種溶液藍(lán)色的深淺與蛋白的含量成正相關(guān)，所以可以用于蛋白質(zhì)含量的測定。Lowry法除使肽鏈中絡(luò)氨酸、色氨酸和半胱氨酸等顯色外，還使雙縮脲法中肽鍵的顯色效果更強(qiáng)烈，其顯色效果比單獨(dú)使用酚試劑強(qiáng)3~15倍，約是雙縮脲法的100倍。由于肽鍵顯色效果增強(qiáng)，從而減少了因蛋白質(zhì)種類引起的偏差。Lowry法適于微量蛋白的測定，對多個(gè)樣品同時(shí)測定較為方便。但對于不溶性蛋白和膜結(jié)合蛋白必須進(jìn)行預(yù)處理(如加入少量的SDS)。1.雙縮脲法的原理雙縮脲(NH2–CO–NH–CO–NH2)在堿性溶液中可與銅離子產(chǎn)生紫紅色的絡(luò)合物，這一反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)中有多個(gè)肽鍵，也能與銅離子發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，且顏色深淺與蛋白質(zhì)的含量的關(guān)系在一定范圍內(nèi)符合比爾定律，而與蛋白質(zhì)的氨基酸組成及分子量無關(guān)，所以可用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)的含量。雙縮脲反應(yīng)主要涉及肽鍵，因此受蛋白質(zhì)特異性影響較小。且使用試劑價(jià)廉易得，操作簡便，可測定的范圍為1~10mg蛋白質(zhì)，適于精度要求不太高的蛋白質(zhì)含量的測定，能測出的蛋白質(zhì)含量須在約0.5mg以上。雙縮脲法的缺點(diǎn)是靈敏度差、所需樣品量大。干擾此測定的物質(zhì)包括在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖液，如Tris緩沖液，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生陽性呈色反應(yīng)，銅離子也容易被還原，有時(shí)出現(xiàn)紅色沉淀。2.斐林(Folin)–酚法的原理該方法是雙縮脲法的發(fā)展，包括兩步反應(yīng)：第一步是在堿性條件下，與銅試劑作用生成蛋白質(zhì)–銅絡(luò)合物；第二步是此絡(luò)合物將磷鉬酸、磷鎢酸試劑還原，生成磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)的深藍(lán)色混合物，顏色深淺與蛋白含量成正相關(guān)。在650nm時(shí)比色測定的靈敏度比雙縮脲法高100倍。反應(yīng)約在15min內(nèi)有最大顯色，并至少可穩(wěn)定幾小時(shí)。此法也適用于測定酪氨酸、色氨酸含量。此法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，迅速，不需特殊儀器設(shè)備，靈敏度高。其不足之處是此反應(yīng)受多種因素干擾。在測試時(shí)應(yīng)排除干擾因素或做空白試驗(yàn)消除。二、試劑與儀器設(shè)備(一)試劑Na2WO4·2H2O，Na2MoO4·2H2O，85%H3PO4，濃HCl，Li2SO4·H2O，溴水，酚酞指示劑，Na2CO3，NaOH，CuSO4·5H2O，酒石酸鉀鈉，牛血清白蛋白。1.堿性銅試劑(相當(dāng)于雙縮脲試劑)的制備首先配制A液：4%碳酸鈉(Na2CO3)溶液與0.2mol/L氫氧化鈉(NaOH)溶液等比例混合(2%Na2CO3，0.1molNaOH)；B液：1%硫酸銅(CuSO4·5H2O)溶液與2%酒石酸鉀鈉溶液等比例混合(0.5%CuSO4·5H2O，0.1%酒石酸鉀鈉)。在使用前將A液與B液按50︰1的比例混合即成。此為Folin-酚試劑甲液，此試劑只能使用1天。2.酚試劑(相當(dāng)于Folin試劑)的制備稱取鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O)100g，鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)25g，加蒸餾水700mL溶解于1500mL的圓底燒瓶中。之后加入85%的H3PO450mL，濃HCl100mL，安上回流裝置(使用磨口接頭，若用軟木塞或橡皮塞時(shí)，就必須用錫鉑紙包起來)，使其慢慢沸騰10h。冷卻后加入硫酸鋰(Li2SO4·H2O)150g，水50mL，溴水2~3滴，不用回流裝置開口煮沸15min，以逐出過量的溴。待冷卻后稀釋至1000mL，并過濾入棕色瓶中，密閉于冰箱中保存(冷卻后溶液呈黃色，倘若仍呈綠色，須再滴加數(shù)滴液體溴，繼續(xù)煮沸15min)。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定，以酚酞作為指示劑，滴定終點(diǎn)由藍(lán)變灰。滴定后算出酸的濃度。使用時(shí)大約加水1倍，使最終濃度相當(dāng)于1mol/LH+在測定時(shí)要注意，因?yàn)榉釉噭﹥H在酸性條件下穩(wěn)定，但此實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)只在pH10的情況下發(fā)生，所以當(dāng)加酚試劑時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸–磷鎢酸試劑被破壞前即能發(fā)生還原反應(yīng)，否則會(huì)使顯色程度減弱。3.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的配制稱取25mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸餾水中，使終濃度為250μg/mL。(二)儀器設(shè)備試管，移液管，定量加樣器，圓底燒瓶，冷凝管1套(帶橡膠管)，微量滴定管，小燒杯，微量進(jìn)樣器50μL1支，分光光度計(jì)，恒溫水浴器，研缽，玻棒，離心機(jī)，離心管。三、實(shí)驗(yàn)步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制(1)取7支試管，編號(hào)后，分別加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用蒸餾水補(bǔ)足1mL，使每管含蛋白量分別為0、25、50、100、150、200、250μg(必要時(shí)可做重復(fù))。(2)在每支試管中用定量加樣器加入5mL甲液，混勻，于30℃(3)在每支試管中噴射加入0.5mL乙液，立即振蕩混勻，在30℃(4)準(zhǔn)確到30min后，以不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白試管中的溶液為空白，在500nm下用1cm光徑的比色杯對系列標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液進(jìn)行比色，測定光密度值。以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.樣品的測定(1)樣品的提取與考馬斯亮藍(lán)G-250法相同。取1.0mL(視蛋白質(zhì)含量適當(dāng)稀釋)樣液加入試管中，然后重復(fù)步驟1的(2)~(4)，以標(biāo)準(zhǔn)曲線中的0管為空白，測定吸光值。(2)根據(jù)光密度值查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出比色液中的蛋白質(zhì)含量。四、結(jié)果計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的含量=(mg/g)式中：c—查標(biāo)準(zhǔn)曲線值，μg；VT—提取液總體積，mL；WF—樣品鮮重，g；VS—測定時(shí)加樣量，mL。注意：還原物質(zhì)，其他酚類物質(zhì)及檸檬酸對此反應(yīng)有干擾。第Ⅲ法紫外吸收法一、原理由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，吸收高峰在280nm波長處。在此波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值(A280)與其含量呈正比關(guān)系，可用作定量測定。利用紫外線吸收法測定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點(diǎn)是迅速、簡便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。因此，在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中(特別是在柱層析分離中)廣泛應(yīng)用。此法的缺點(diǎn)是：(1)對于測定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差；(2)若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外線的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外線吸收是不相同的，即使經(jīng)過校正，測定結(jié)果也還存在一定的誤差。但可作為初步定量的依據(jù)。二、試劑與儀器設(shè)備(一)試劑0.1mol/LpH7.0磷酸緩沖液。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取經(jīng)微量凱氏定氮法校正的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，配制成濃度為1mg/mL的溶液。(二)儀器設(shè)備紫外分光光度計(jì)，離心機(jī)，刻度移液管。三、實(shí)驗(yàn)步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取8支試管，按表19–2分別向每支試管加入各種試劑，搖勻。選用光程1cm的石英比色杯，在280nm波長處分別測定各管溶液的A280值。以A280值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表19–2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線各試劑加入量試劑管號(hào)12345678標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(mL)00.51.01.52.02.53.04.0蒸餾水(mL)4.03.53.02.52.01.51.00蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)00.1250.2500.3750.5000.6250.7501.00(2)樣品測定樣品提取與考馬斯亮藍(lán)G-250法相同。取待測蛋白質(zhì)溶液1mL，加入蒸餾水3mL，搖勻，按上述方法在280nm波長處測定光吸收并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測蛋白質(zhì)的濃度。2.其他方法(1)取適量的樣品提取液，根據(jù)蛋白質(zhì)濃度，用0.1mol/LpH7.0磷酸緩沖液適當(dāng)稀釋后，用紫外分光光度計(jì)分別在280nm和260nm波長下讀取吸光度，以pH7.0磷酸緩沖液為空白調(diào)零。3.計(jì)算：蛋白質(zhì)濃度=1.45A280–0.74A260(mg/mL)式中：1.45和0.74—校正值；A280—蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度；A260—蛋白質(zhì)溶液在260nm處的吸光度。此外，也可先計(jì)算出A280/A260的比值后，從表19–3中查出校正因子“F”值，同時(shí)可查出樣品中混雜的核酸的百分含量，將“F”值代入，再由下述經(jīng)驗(yàn)公式直接計(jì)算出該溶液的蛋白質(zhì)濃度。表19–3紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量的校正因子A280/A260核酸(%)因子(F)A280/A260核酸(%)因子(F)1.750.001.1160.8465.500.6561.630.251.0810.8226.000.6321.520.501.0540.8046.500.6071.400.751.0230.7847.000.5851.361.000.9940.7677.500.5651.301.250.9700.7538.000.5451.251.500.9440.7309.000.5081.162.000.8990.70510.000.4781.092.500.8520.67112.000.4221.033.000.8140.64414.000.3770.9793.500.7760.61517.000.3220.9394.000.7430.59520.000.2780.8745.000.682注：一般純蛋白質(zhì)的光吸收比值(A280/A260)約為1.8，而純核酸的比值約為0.5。蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)=F×A280×N式中：F—校正因子；A280—該溶液在280nm下測得的光吸收值；N—溶液的稀釋倍數(shù)。(2)對于稀蛋白質(zhì)溶液，還可用215nm和225nm的吸收差來測定濃度。從吸收差(△A)與蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出濃度?！鰽=A215–A225式中：A215、A225—分別是蛋白質(zhì)溶液在215nm和225nm波長下測得的光吸收值。此法在蛋白質(zhì)含量達(dá)20~100μg/mL的范圍內(nèi)，是服從Beer定律的。氯化鈉、硫酸銨以及0.1mol/L磷酸、硼酸和三羥甲基氨基甲烷等緩沖液都無顯著干擾作用。但是0.1mol/L乙酸、琥珀酸、鄰苯二甲酸以及巴比妥等緩沖液在215nm波長下的吸收較大，不能應(yīng)用，必須降至0.005mol/L才無顯著影響。由于蛋白質(zhì)的紫外吸收高峰常因pH的改變而有高低，故應(yīng)用紫外吸收法時(shí)要注意溶液的pH，最好與標(biāo)準(zhǔn)曲線制訂時(shí)的pH一致。(3)如果已知某一蛋白質(zhì)在280nm波長處的吸收值，則取該蛋白質(zhì)溶液于280nm處測定光吸收值后，便可直接求出蛋白質(zhì)的濃度。[思考題]1.測定植物體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量有什么意義和用途？試舉二例說明。2.三種測定方法各有何優(yōu)缺點(diǎn)？在實(shí)驗(yàn)中如何選擇合適的方法并克服其缺點(diǎn)？3.斐林酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量的原理是什么？測定中應(yīng)注意什么問題？測定蛋白質(zhì)含量之常規(guī)方法介紹一、微量凱氏(kjeldahl)定氮法樣品與濃硫酸共熱。含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨(消化)，氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計(jì)算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如下：NH2CH2COOH+3H2SO4――2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)2NH3+H2SO4――(NH4)2SO4(2)(NH4)2SO4+2NaOH――2H2O+Na2SO4+2NH3(3)反應(yīng)(1)、(2)在凱氏瓶內(nèi)完成，反應(yīng)(3)在凱氏蒸餾裝置中進(jìn)行。為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，K2SO4以提高溶液的沸點(diǎn)。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強(qiáng)酸。實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法這里從略。計(jì)算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應(yīng)將總氮量減去非蛋白氮即得。如欲進(jìn)一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量，即用樣品中蛋白氮乘以6.25即得。二、雙縮脲法(Biuret法)(一)實(shí)驗(yàn)原理雙縮脲(NH3CONHCONH3)是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為1~10mg蛋白質(zhì)。干擾此測定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。(二)試劑與器材1.試劑(1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白(bsa)或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用bsa濃度1mg/mL的A280為0.66來校正其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計(jì)算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/LNaOH配制。(2)雙縮脲試劑稱以1.50g硫酸銅(CuSO4?5H2O)和6.0g酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6?4H2O)，用500mL水溶解，在攪拌下加入300mL10%NaOH溶液，用水稀釋到1L，貯存于塑料瓶中(2.器材可見光分光光度計(jì)、大試管15支、旋渦混合器等。(三)操作方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足到1mL，然后加入4mL雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫(20~25℃)下放置30min，于5402.樣品的測定取2~3支試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。注意樣品濃度≤10mg/mL。三、Folin-酚試劑法(Lowry法)(一)實(shí)驗(yàn)原理這種蛋白質(zhì)測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難(現(xiàn)在已可以訂購)，近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin-酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。Folin-酚試劑中的磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色(鉬蘭和鎢蘭的混合物)。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。Folin-酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。該法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應(yīng)。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素(0.5%)，硫酸納(1%)，硝酸納(1%)，三氯乙酸(0.5%)，乙醇(5%)，乙醚(5%)，丙酮(0.5%)等溶液對顯色無影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉-氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會(huì)色淺，則必須提高碳酸鈉-氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍。進(jìn)行測定時(shí)，加Folin-酚試劑時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)Folin-酚試劑加到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。此法可檢測的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測定范圍是20~250mg。文獻(xiàn)計(jì)量分析揭示我國番茄紅素研究現(xiàn)狀潘藝元,凌日云,陳全斌(廣西師范大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院,廣西桂林541004)潘藝元,凌日云,陳全斌.文獻(xiàn)計(jì)量分析揭示我國番茄紅素研究現(xiàn)狀[J].廣西輕工業(yè).2006(5):46-47摘要采用文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)的方法，對我國近30年來在學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表的番茄紅素研究文獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對我國番茄紅素研究文獻(xiàn)類型、年代分布及研究內(nèi)容等方面進(jìn)行計(jì)量分析，從而揭示我國對番茄紅素研究的現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢。關(guān)鍵詞番茄紅素；文獻(xiàn)；計(jì)量分析番茄(LycopersiconesculentumMill)又名西紅柿、番柿、洋柿子等，原產(chǎn)于南美西部高原，屬喜溫性蔬菜。它既可作菜熟食，又可當(dāng)作水果生吃，味道甜中微酸，望之生津止渴，食之沁人脾胃，是我國人民普遍喜食的蔬菜之一[1-2]。番茄成分很多，如番茄紅素、糖、維生素A、B、C、D以及有機(jī)酸和酶等。最近幾年番茄紅素(Lycopene)引起了人們越來越多的興趣。番茄紅素最早從番茄中提取出來，是一類非常重要的類胡蘿卜素，主要存在于番茄、南瓜、西瓜、柿子、桃、芒果、葡萄、草莓、柑桔等果實(shí)中。研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素具有優(yōu)越的生理活性，可高效猝滅單線態(tài)氧、清除自由基、防止脂質(zhì)過氧化、保護(hù)機(jī)體免受損傷，其抗氧化性在類胡蘿卜素物質(zhì)中最強(qiáng)。它不僅具有抗癌防癌，預(yù)防心腦血管疾病、防止動(dòng)脈硬化、抗腫瘤等功效，還可增強(qiáng)人體免疫力以及延緩衰老。筆者對我國近年出版的研究番茄紅素的文獻(xiàn)，就其類型、年限分布、刊物分布等方面進(jìn)行計(jì)量分析。目的是通過分析番茄紅素的研究文獻(xiàn)狀況，了解我國番茄紅素研究的主要特點(diǎn)和所處現(xiàn)狀。1文獻(xiàn)收集有關(guān)番茄紅素的文獻(xiàn)是在2006年2月在清華同方《中國期刊全文數(shù)據(jù)庫》以“番茄紅素”為篇名檢索所得。這些文獻(xiàn)反映了我國2005年以前番茄紅素研究的主要成就，其內(nèi)容包括綜合論述、基礎(chǔ)研究、提取制備研究、藥理研究、分析測定、開發(fā)應(yīng)用。2文獻(xiàn)分析2.1番茄紅素研究總文獻(xiàn)量的分析剔除非學(xué)術(shù)性論文，共收集1975年以來的中文期刊上有關(guān)番茄紅素的文獻(xiàn)284篇，年平均文獻(xiàn)量為10.9篇，對其所涉及的學(xué)科分別進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。由表1看出，基礎(chǔ)、藥理研究及制取工藝研究文獻(xiàn)所占比例較為均衡，分別為22.54%、18.66%、24.30%，它們在番茄紅素研究中占了主要地位?；A(chǔ)研究的側(cè)重點(diǎn)在生物學(xué)，文獻(xiàn)量占基礎(chǔ)研究文獻(xiàn)量的48.4%。對番茄紅素的穩(wěn)定性研究的文獻(xiàn)也較多，文獻(xiàn)量占基礎(chǔ)研究文獻(xiàn)量的32.8%，為番茄紅素的應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。表1番茄紅素文獻(xiàn)在各學(xué)科中的分布研究方向各項(xiàng)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)研究藥理研究制取工藝分析測定產(chǎn)品開發(fā)綜述總計(jì)生物學(xué)穩(wěn)定性其他抗氧化抗癌其他植物提取人工合成分支學(xué)科文獻(xiàn)量/篇312112201320609文獻(xiàn)量/篇645369261458284分支占該和48.432.819.837.724.837.786.913.1各科占總文獻(xiàn)%22.5418.8824.309.154.9320.42100在提取制備工藝研究中，側(cè)重于從果實(shí)提取，多數(shù)研究有關(guān)提取效率的影響因素，如溫度、溶劑用量、提取時(shí)間等。在提取方法上，酶法提取法[3]、超臨界二氧化碳萃取法[4-7]、微波輻射萃取法[8]、超聲波萃取法[9]等提取工藝是近幾年發(fā)展起來的，從文獻(xiàn)內(nèi)容看，這幾種新提取工藝已運(yùn)用到番茄紅素的提取中，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，預(yù)計(jì)它們將取代傳統(tǒng)提取工藝，使提取效率達(dá)到更高的水平。人工合成番茄紅素的研究文獻(xiàn)很少，僅9篇。2.2番茄紅素研究文獻(xiàn)的年限分布表2顯示，80年代前共發(fā)表番茄紅素12篇，占總文獻(xiàn)量的4.23%，主要研究方向是基礎(chǔ)研究；90年代共發(fā)表20篇，占總文獻(xiàn)量的7.04%，主要研究提取制備工藝；進(jìn)入21世紀(jì)后，文獻(xiàn)量逐年增加，尤其是近3年，文獻(xiàn)量呈直線上升趨勢。僅2000-2005年就發(fā)表文獻(xiàn)252篇，占總文獻(xiàn)量的88.73%，為80年代的21倍多，內(nèi)容側(cè)重于藥理研究與提取制備的新工藝研究。究其原因，人們對番茄紅素的保健功能得到了進(jìn)一步的論證，尤其是抗癌防癌作用日益被國內(nèi)外所認(rèn)識(shí)并開始得到廣泛研究和開發(fā)。表2番茄紅素研究文獻(xiàn)的年限分布1975-1989年1990-1999年2000-2005年文獻(xiàn)數(shù)(篇)占年代段百分比(%)文獻(xiàn)數(shù)(篇)占年代段百分比(%)文獻(xiàn)數(shù)(篇)占年代段百分比(%)基礎(chǔ)研究541.67420.05722.62藥理研究--15.05220.63制取工藝--525.06224.60分析測定65015.0197.55產(chǎn)品開發(fā)18.3315.0124.76綜述--35.05019.84總文獻(xiàn)量1220252占總文獻(xiàn)%4.237.0488.732.3番茄紅素文獻(xiàn)的主要期刊刊載番茄紅素文獻(xiàn)的期刊共151種，表3列出了番茄紅素文獻(xiàn)在期刊中的分布情況，表4列出了14種刊載番茄紅素文獻(xiàn)的期刊。由表3、表4看出，番茄紅素文獻(xiàn)的離散性較大，刊載番茄紅素文獻(xiàn)的離散性較大，刊載番茄紅素文獻(xiàn)2篇以上的期刊有43種，占期刊總數(shù)28.48%，文獻(xiàn)量為176，占總文獻(xiàn)量的61.97%，這說明番茄紅素文獻(xiàn)大體集中在43種期刊中。從表3還可看出，番茄紅素的文獻(xiàn)主要分布在食品行業(yè)與醫(yī)學(xué)保健的期刊上。分析其原因，隨著社會(huì)高節(jié)奏的發(fā)展和人民生活水平的提高人類的疾病譜正在發(fā)生改變，現(xiàn)代文明病，亞健康狀態(tài)等慢性疾病逐漸上升；與此相適應(yīng)，富養(yǎng)生、預(yù)防、治療、醫(yī)學(xué)保健于一體的醫(yī)療模式已成為人們的主導(dǎo)觀念，進(jìn)一步影響人們的飲食觀念。表3番茄紅素文獻(xiàn)期刊的集中與離散刊載文獻(xiàn)量(篇)12~34~68~22總計(jì)期刊總數(shù)1083265151文獻(xiàn)量(篇)108723173284占總文獻(xiàn)量%38.0325.3510.9225.70100.03我國番茄紅素研