DB21-T 3006-2018牛細(xì)管冷凍精液制作與貯存技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.30

B43

備案號(hào)：61300-2019DB21

遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB21/T3006—2018

牛細(xì)管冷凍精液制作與貯存技術(shù)規(guī)程

Technicalregulationontheproductionandstorageofbovinestrawfrozensemen

DB21/T3006—2018

牛細(xì)管冷凍精液制作與貯存技術(shù)規(guī)程

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了牛細(xì)管冷凍精液（以下簡(jiǎn)稱凍精）制作與貯存過程中的術(shù)語(yǔ)和定義、主要器材、器材

清洗和消毒、稀釋液配制、精液品質(zhì)檢查、精液稀釋、灌裝與平衡、精液冷凍、凍精檢查、凍精包裝和

凍精貯存的技術(shù)內(nèi)容。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于牛細(xì)管凍精的制作與貯存。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB4143－2008牛冷凍精液

GB/T30396－2013牛冷凍精液包裝、標(biāo)簽、貯存和運(yùn)輸

NY/T1234－2006牛冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

精液稀釋semendilution

向精液中添加一定數(shù)量按特定配方配制的適宜于精子存活并保持受精能力的溶液。

3.2

一次稀釋法onetimedilutionmethod

將采出的精液用含甘油的同溫稀釋液按比例要求一次加入。

3.3

二次稀釋法twodilutionmethod

常溫下第一次添加無甘油稀釋液，降溫平衡后、冷凍前添加等溫含甘油稀釋液。

3.4

降溫平衡coolingbalance

稀釋后的精液置于4℃的環(huán)境中，經(jīng)1h～1.5h降溫至4℃，在此溫度下保持2h～4h。

3.5

1

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上架shelves

將細(xì)管精液沿同一方向均勻地?cái)[放在托架上。

3.6

初凍溫度Initialfreezingtemperature

精液冷凍前，冷凍容器中精液所在層面的溫度。

4主要器材

相差顯微鏡、恒溫板、密度儀、低溫柜、罐裝機(jī)、全自動(dòng)冷凍儀、簡(jiǎn)易冷凍箱、數(shù)顯測(cè)溫儀、水浴

鍋、恒溫箱、干燥箱、無菌箱、標(biāo)簽打印機(jī)、液氮罐、移液器、托架、搓板、細(xì)管剪、鑷子、液氮、包

裝袋、標(biāo)簽、拇指管、細(xì)管、燒杯、量筒、載玻片、蓋玻片等。

5器材清洗和消毒

5.1玻璃器皿

使用后或新購(gòu)置的玻璃器皿，如集精管、燒杯、量筒、平皿等。洗滌時(shí)，先用清水浸泡30min，再

在加有洗滌劑的溫水中刷試，之后清水沖洗2～3遍，然后放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中，加熱至160℃后恒

溫60min，自然冷卻后待用。

5.2橡膠、塑料制品

不耐高溫的橡膠制品，如膠管等。洗滌時(shí)，先在加有洗滌劑的溫水中清洗，之后用清水沖洗干凈，

膠管內(nèi)75%酒精過慮，膠管表面紫外線照射2h，然后放入無菌箱中待用；膠粒、槍頭、膠塞洗凈干燥后，

用75%酒精浸泡1min～2min撈出，待酒精自然揮發(fā)后放無菌箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

5.3金屬制品

金屬制品，如細(xì)管剪、鑷子等。洗滌時(shí)，先在加有洗滌劑的溫水中洗刷，之后用清水沖洗干凈，干

燥后用75%酒精擦試消毒，然后放入無菌箱中備用。

6稀釋液配制

6.1稀釋液配方

6.1.1一次稀釋液配方相關(guān)信息參見附錄A。

6.1.2兩次稀釋液配方參見NY/T1234-2006中附錄C的內(nèi)容。

6.2稀釋液配制方法

6.2.1進(jìn)口稀釋液

配制方法按照使用說明的要求，如法國(guó)卡蘇Bioxcell稀釋液和德國(guó)米尼圖AndroMed稀釋液。

6.2.2自制稀釋液

2

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配制方法分為：

a)一次稀釋液。稱量藥品，量取蒸餾水，混合溶解、過濾、消毒，自然冷卻后，依次加入甘油、卵

黃和青霉素、鏈霉素，用磁力攪拌器攪拌；

b)兩次稀釋液。第一液，稱量藥品，量取蒸餾水，混合溶解、過濾、消毒，自然冷卻后加入卵黃和

青霉素、鏈霉素，用磁力攪拌器攪拌；第二液，取第一液加入果糖和甘油。

7精液品質(zhì)檢查

7.1外觀檢查

正常的精液為乳白色或淡黃色，精液中無異物，出現(xiàn)以下情況應(yīng)廢棄：

a)呈鮮紅色、粉紅色或暗綠色等異常色澤；

b)混有被毛、脫落上皮、生殖道炎性分泌物或塵土、糞渣等異物。

7.2活力評(píng)定

7.2.1檢查方法

用移液器取10μL精液于載玻片上，加蓋蓋玻片后放在37℃～38℃恒溫板上，在400倍或600倍相

差顯微鏡下觀察，每個(gè)樣品觀察3個(gè)以上視野，并觀察每個(gè)視野內(nèi)不同層面的精子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，求取活力

平均值。精子活力應(yīng)符合GB4143－2008中4.2的相關(guān)規(guī)定。對(duì)于密度大的精液可用生理鹽水1:2或

1:3稀釋后再制成壓片。

7.2.2評(píng)定方法

精子活力用百分率表示或采用“十級(jí)一分制”，如果精液中有80%的精子作前向運(yùn)動(dòng)，精子活力計(jì)

為80%或0.8。

7.3密度測(cè)定

用精子密度測(cè)定儀測(cè)定，測(cè)定方法按照密度儀的操作規(guī)程。精子密度應(yīng)符合GB4143－2008中4.2

的相關(guān)規(guī)定。

7.4精液量測(cè)定

7.4.1目測(cè)法

用肉眼直接觀看集精管刻度讀取數(shù)量值，單位為mL。

7.4.2稱量法

用電子天平稱量精液重量，換算成精液體積。

稱量法測(cè)定精液量按式（1）計(jì)算。

mm

Vt0…………（1）

m1.04

式中：

Vm——精液量，單位為mL；

mt——集精管和精液重量，單位為g；

m0——集精管重量，單位為g；

3

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1.04——精液比重，單位為g/mL。

7.5記錄

在牛凍精生產(chǎn)記錄表中記錄檢測(cè)結(jié)果，相關(guān)信息參見附錄B。

8精液稀釋

8.1稀釋前準(zhǔn)備

接觸精液的器皿放在32℃～35℃恒溫箱中，稀釋液放在34℃恒溫水浴鍋中。

8.2稀釋方法

8.2.1一次稀釋法

室溫條件下，用量筒取稀釋液加入燒杯精液中，輕搖混勻，所加稀釋液量按附錄C中（C.1）計(jì)算。

8.2.2兩次稀釋法

室溫下，先用量筒取34℃的Ⅰ液（第一稀釋液）加入已盛有精液的燒杯中，輕搖混勻，然后把燒杯

置于盛有30℃水的容器后放入4℃低溫柜內(nèi)降溫，與此同時(shí)把Ⅱ液（第二稀釋液）也一同放入，當(dāng)降溫

至4℃時(shí)加入等溫的Ⅱ液至稀釋總量，所加Ⅰ液和Ⅱ液的量分別按附錄C中（C.2）和（C.3）計(jì)算。

8.2.3記錄

在附錄B中記錄稀釋液量。

9灌裝與平衡

9.1細(xì)管標(biāo)記

方法符合NY/T1234－2006中附錄A的規(guī)定。

9.2先灌裝，后平衡

精液一次稀釋后，在室溫下靜置10min，用灌封機(jī)分裝、打印，分裝后的細(xì)管精液放入不透明的塑

料盒內(nèi)，每盒宜盛放300支（如果遇一頭牛的細(xì)管數(shù)量較多，可均勻分放在不同塑料盒中），把塑料盒

放入4℃低溫柜中降溫平衡3h～4h。

9.3先平衡，后灌裝

精液采取先平衡，后灌裝有以下情況：

a)精液一次稀釋后，30℃水浴狀態(tài)下放入4℃低溫柜內(nèi)，降溫、平衡3h～4h，在低溫柜中進(jìn)行精液

分裝（細(xì)管也應(yīng)放入低溫柜內(nèi)降溫）。

b)用等溫的Ⅰ液加入精液中至稀釋總量的一半，水浴狀態(tài)下放入4℃低溫柜內(nèi)，與此同時(shí)把Ⅱ液也

一同放入，降溫、平衡2h～3h，加入等溫的Ⅱ液至稀釋總量，再平衡0.5h～1h，在低溫柜中進(jìn)行精液分

裝。

10精液冷凍

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10.1上架

平衡、灌裝后的細(xì)管精液在4℃低溫柜中上架，上架時(shí)把棉塞端靠近操作者，超聲波封口端遠(yuǎn)離操

作者，每頭牛細(xì)管精液托架應(yīng)擺放在一起，如同一個(gè)托架上有不同牛的細(xì)管精液，要分開碼放，兩頭牛

的細(xì)管精液之間隔開一定距離。

10.2冷凍方法

10.2.1使用全自動(dòng)冷凍儀

冷凍方法按照NY/T1234－2006中8.2.1的要求。

10.2.2使用簡(jiǎn)易冷凍箱

10.2.2.1初凍溫度

應(yīng)控制在-170℃～-160℃。操作步驟：箱內(nèi)倒入液氮，待液氮面平穩(wěn)后放入托架，把測(cè)溫探頭放在

冷凍面位置，當(dāng)測(cè)溫儀顯示-170℃～-160℃時(shí)，測(cè)量液氮面與冷凍面之間高度（一般為2.5cm～3cm），

用記號(hào)筆在箱體內(nèi)壁畫上液氮面標(biāo)記線，作為確定初凍溫度的參考。

10.2.2.2冷凍方法

打開箱蓋，倒入少量液氮讓箱體充分預(yù)冷2min～3min，再次打開箱蓋添加液氮至標(biāo)記線，待液氮

面平穩(wěn)后，把已排滿細(xì)管精液的托架迅速放入箱內(nèi)，（托架在箱內(nèi)應(yīng)單層擺放），蓋嚴(yán)蓋子，8min后

完成冷凍過程。

10.3記錄

在附錄B中記錄每頭牛的生產(chǎn)數(shù)量。

11凍精檢驗(yàn)

11.1凍精解凍

用鑷子隨機(jī)取1支冷凍后的細(xì)管精液迅速浸泡在37℃水中并晃動(dòng)，待溶解后立即取出，用吸水紙

或紗布擦干細(xì)管表面水珠。

11.2活力檢查

水平捏住細(xì)管，用細(xì)管剪剪去細(xì)管兩端，緩慢傾斜細(xì)管一端，讓精液自然滴出，取中間一滴滴于載

玻片上，加蓋蓋玻片后放在37℃～38℃恒溫板上，在100倍或200倍相差顯微鏡下觀察，每個(gè)樣品應(yīng)

觀察3個(gè)以上視野，并觀察每個(gè)視野內(nèi)不同層面的精子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，求取活力平均值。精子活力應(yīng)符合

GB4143－2008中4.5.1的規(guī)定。

11.3記錄

在附錄B中記錄凍精活力。

12凍精包裝

12.1包裝袋及標(biāo)簽

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12.1.1包裝袋制作

12.1.1.1材料和縫制

應(yīng)符合GB/T30396－2013中4.1.2.1和4.1.2.2的規(guī)定。

12.1.1.2規(guī)格

長(zhǎng)度等于170mm，寬度等于45mm；封口繩總長(zhǎng)度不小于300mm、直徑不小于2mm。

12.1.2標(biāo)簽制作符合附錄D的規(guī)定。

12.2包裝前準(zhǔn)備

用條碼打印機(jī)打印標(biāo)簽，標(biāo)簽打印完畢后粘貼在包裝袋上，用縫紉機(jī)固定。

12.3包裝凍精

冷凍完成后，打開冷凍容器，在-140℃以下的環(huán)境中進(jìn)行。首先把細(xì)管棉塞端朝向拇指管底部裝入

拇指管，然后再把拇指管底部朝向包裝袋里面裝入包裝袋。凍精裝入包裝袋后，拴緊封口繩、打個(gè)活節(jié)，

迅速浸泡在液氮中。每個(gè)拇指管包裝數(shù)量不得超過25支；每個(gè)包裝袋包裝數(shù)量不得超過100支。

13凍精貯存

13.1貯存環(huán)境

凍精貯存于液氮罐的液氮中，液氮罐擺放在通風(fēng)、干燥、陰涼的地方。

13.2液氮罐檢查

新罐或久置不用的罐，使用前先充入1/5～1/4液氮，停留10min～15min，若無氣泡上浮，才能使

用。

13.3日常管理

應(yīng)作到以下幾個(gè)方面：

a)貯存數(shù)量不應(yīng)超過罐體容積的4/5，凍精上面應(yīng)有不低于5cm高度的液氮。每周定期充添液氮，確

保凍精始終浸沒在液氮中；

b)經(jīng)常檢查液氮罐的狀況，如發(fā)現(xiàn)液氮罐表面結(jié)白霜、凝結(jié)水珠或液氮消耗明顯超過正常時(shí)，應(yīng)立

即將凍精轉(zhuǎn)移到其他液氮罐內(nèi)保存；

c)取放凍精時(shí)，包裝袋應(yīng)提到液氮罐頸口以下，不得提到外邊；

d)凍精由一個(gè)液氮罐轉(zhuǎn)移到另一個(gè)液氮罐時(shí)，在液氮罐外停留時(shí)間不得超過3s。

e)取存凍精后，應(yīng)及時(shí)蓋好液氮罐罐塞；在取放罐塞時(shí)，垂直輕拿輕放，不得用力過猛。

f)移動(dòng)液氮罐時(shí)，不得在地上拖動(dòng)，應(yīng)提握液氮罐手柄抬起罐體再移動(dòng)。

13.4大型液氮罐使用

用大型液氮罐貯存凍精，要有凍精分類存放位置的詳細(xì)圖表，分別注冊(cè)，登記清楚。

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A器

附錄A

（資料性附錄）

一次稀釋液配方

牛細(xì)管精液一次性稀釋液配方如下：

卵黃20%

Tris（三羥甲基氨基甲烷）2.42%

單水檸檬酸1.38%

果糖1.0%

甘油7.0%

上述稀釋液，每100mL加入青霉素、鏈霉素各5萬IU～10萬IU。

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BB

附錄B

（資料性附錄）

牛細(xì)管凍精生產(chǎn)記錄表

生產(chǎn)日期：年月日

序品批鮮精活力密度采精量稀釋液量生產(chǎn)數(shù)量?jī)鼍盍?/p>

牛號(hào)顏色

號(hào)種次（%）（億/mL）（mL）（mL）（支）（%）

采精員：檢驗(yàn)員：

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附錄C

（規(guī)范性附錄）

稀釋量計(jì)算

C.1一次稀釋

加入稀釋液量

Vm0.23v……………（C.1）

0.08m

式中：

V——應(yīng)加入稀釋液量，單位為mL；

vm——精液量，單位為mL；

ρ——精液密度，單位為億/mL；

α——根據(jù)原精活力預(yù)估測(cè)的凍精活力；

0.08——每支細(xì)管有效精子總數(shù)，單位為億；

0.23——每支細(xì)管可裝入精液量，單位為mL。

C.2兩次稀釋

C.2.1加入Ⅰ液量

Vm0.232v……………（C.2）

10.08m

式中：

V1——第一次應(yīng)加入稀釋液量，單位為mL；

vm——精液量，單位為mL；

ρ——精液密度，單位為億/mL；

α——根據(jù)原精活力預(yù)估測(cè)的凍精活力；

0.08——每支細(xì)管有效精子總數(shù)，單位為億；

0.23——每支細(xì)管可裝入精液量，單位為mL。

C.2.2加入Ⅱ液量

V2V1vm…………………（C.3）

式中：

V2——第二次應(yīng)加入稀釋液量，單位為mL；

V1——第一次應(yīng)加入稀釋液量，單位為mL；

vm——精液量，單位為mL；

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附錄D

（規(guī)范性附錄）

標(biāo)簽制作

D.1材料

合成紙或亞銀PET塑料(滌綸樹脂)。

D.