第五章-雙水相萃取技術(shù)

第五章雙水相萃取技術(shù)

(AqueousTwoPhaseExtraction)雙水相萃取(aqueoustwo-phasepartitioning)是1896年Beijerinck把瓊脂和可溶性淀粉或明膠相混合時最早發(fā)現(xiàn)的。1956年，瑞典倫德大學(xué)的Albertsson重新發(fā)現(xiàn)此體系并第一次用來提取生物物質(zhì)。1979年，Kula和Kroner等人將雙水相體系用于從細胞勻漿液中提取酶和蛋白質(zhì)，使胞內(nèi)酶的提取過程大為改善。此后，對于雙水相體系的研究和應(yīng)用逐步展開并取得很大進展。在提純有生理活性的生物物質(zhì)方面，與其他提取方法相比，它具有許多優(yōu)勢。現(xiàn)在雙水相萃取已被廣泛用于蛋白質(zhì)、酶、核酸、病毒、細胞、細胞器等生物產(chǎn)品的別離和純化，并逐步向工業(yè)化生產(chǎn)邁進，展現(xiàn)了在食品工業(yè)、生物學(xué)研究和生物工程方面的巨大應(yīng)用前景。雙水相現(xiàn)象是當(dāng)兩種聚合物或一種聚合物與一種鹽溶于同一溶劑時，由于聚合物之間或聚合物與鹽之間的不相容性，當(dāng)聚合物或無機鹽濃度到達一定值時，就會分成不互溶的兩相。因使用的溶劑是水，因此稱為雙水相，在這兩相中水分都占很大比例(85％~95％)，活性蛋白或細胞在這種環(huán)境中不會失活，但可以不同比例分配于兩相，這就克服了有機溶劑萃取中蛋白容易失活和強親水性蛋白難溶于有機溶劑的缺點?，F(xiàn)代生物技術(shù)中，基因工程產(chǎn)品如蛋白質(zhì)和酶往往是胞內(nèi)產(chǎn)品，需經(jīng)細胞破碎后才能提取、純化，細胞顆粒尺寸的變化給固-液別離帶來了困難，同時這類產(chǎn)品的活性和功能對pH值、溫度和離子強度等環(huán)境因素特別敏感。由于它們在有機溶劑中的溶解度低并且會變性，因此傳統(tǒng)的溶劑萃取法并不適合。采用在有機相中添加外表活性劑產(chǎn)生反膠束的方法可克服這些問題，但同樣存在相的別離問題。因此基因工程產(chǎn)品的商業(yè)化迫切需要開發(fā)適合大規(guī)模生產(chǎn)的、經(jīng)濟簡便的、快速高效的別離純化技術(shù)。其中雙水相萃取技術(shù)(又稱水溶液兩相分配技術(shù))是近年來出現(xiàn)的引人注目、極有前途的新型別離技術(shù)。一、雙水相萃取的根本特性2種天然的或合成的親水性聚合物的水溶液相互混合時，最常見的現(xiàn)象是，由于2種聚合物間存在較強的斥力或空間阻礙，使2者無法相互滲透，不能形成均一相，故到達平衡后形成兩相，這2種聚合物分別位于互不相溶的兩相中，即形成聚合物/聚合物雙水相體系。另外，某些聚合物溶液和一些無機鹽溶液相混時，在一定濃度下，由于鹽析作用，也會形成兩相，即聚合物/無機鹽雙水相體系，常用的無機鹽有磷酸鹽和硫酸鹽。除高聚物、無機鹽外，能形成雙水相體系的物質(zhì)還有高分子電解質(zhì)、低分子量化合物。可形成雙水相的雙聚合物體系很多，如聚乙二醇(polyethyleneglycol,

PEG)/葡聚糖(dextran，Dx)，聚丙二醇(polypropyleneglycol)/聚乙二醇和甲基纖維素(methylcellulose)/葡聚糖等。雙水相萃取中常采用的雙聚合物系統(tǒng)為PEG/Dx，該雙水相的上相富含PEG，下相富含Dx。除雙聚合物系統(tǒng)外，聚合物與無機鹽的混合溶液也可形成雙水相，例如，PEG/磷酸鉀(KPi)、PEG/磷酸銨、PEG/硫酸鈉等常用于生物產(chǎn)物的雙水相萃取。PEG/無機鹽系統(tǒng)的上相富含PEG，下相富含無機鹽。各種類型的雙水相體系類型形成上相的聚合物形成下相的聚合物非離子型聚合物/非離子型聚合物聚乙二醇葡聚糖聚乙烯醇聚丙二醇聚乙二醇聚乙烯吡咯烷酮高分子電解質(zhì)/非離子型聚合物羧甲基纖維素鈉聚乙二醇高分子電解質(zhì)/高分子電解質(zhì)葡聚糖硫酸鈉羧甲基纖維素鈉聚合物/低分子量化合物葡聚糖丙醇聚合物/無機鹽聚乙二醇磷酸鉀硫酸銨常用的雙水相體系是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(dextran)體系和PEG/磷酸鹽體系。PEG/dextran體系一般用于小規(guī)模地別離生物大分子、膜、細胞等，PEG/無機鹽體系主要用來大規(guī)模地提純酶，這是因為PEG/無機鹽體系的萃取專一性更高，葡聚糖價格昂貴的緣故。物質(zhì)在兩相中的選擇性分配是疏水鍵、氫鍵和離子鍵等相互作用的結(jié)果，可溶性物質(zhì)的分配情況可由分配系數(shù)K來表征，細胞這些更大顆粒的分配情況那么由分配比P來表征。影響蛋白質(zhì)及細胞碎片在雙水相體系中分配行為的主要參數(shù)有成相聚合物的種類、成相聚合物的分子質(zhì)量和總濃度、無機鹽的種類和濃度、pH值、溫度等。雙水相萃取的根本特點(1)體系有生物親和性。兩相中的水分含量通常高達65%～90%，所用的PEG、dextran等高聚物或磷酸鹽、硫酸鹽等無機鹽對蛋白質(zhì)、核酸等生物活性物質(zhì)無毒害，甚至還有穩(wěn)定保護作用，而且相界面張力比水-有機或有機-有機兩相體系的界面張力要小1～3個數(shù)量級。由于生物活性物質(zhì)在有機溶劑中易變性，再加上有的生物活性物質(zhì)親水性很強，不溶于有機溶劑，有機溶劑萃取等別離技術(shù)難以在生物活性物質(zhì)的別離中發(fā)揮其效能。(2)與常用的親和層析相比，雙水相萃取能夠在較少的溶液量和較短的操作時間內(nèi)獲得較高產(chǎn)量的產(chǎn)品。另外，操作能夠容易、精確地按比例放大，非常適合大規(guī)模應(yīng)用，可進行連續(xù)生產(chǎn)。而親和層析由于操作難于放大，應(yīng)用受到限制。(3)聚合物的濃度和分子質(zhì)量、無機鹽的種類和濃度、pH以及溫度等均能影響被分配物質(zhì)在兩相間的分配，所以操作容易進行控制，進而到達目的產(chǎn)物的最正確萃取條件。(4)可與細胞破碎相結(jié)合，即細胞懸浮液中參加PEG和無機鹽后再通入珠磨機進行破碎，然后用離心機分相。既節(jié)省了萃取設(shè)備和時間，又防止了胞內(nèi)酶的損失。(5)能進行萃取性的生物轉(zhuǎn)化。在一些雙水相體系中可將發(fā)酵生產(chǎn)過程中的生物轉(zhuǎn)化與下游處理的第1步相結(jié)合，即生物反響在其中一相中進行，同時生成的反響產(chǎn)物被連續(xù)萃取到另一相中。不僅解決了產(chǎn)物反響抑制作用造成的產(chǎn)量低的問題，而且酶在高聚物溶液中比在緩沖液中更穩(wěn)定，活性更大。因為生物反響和生物產(chǎn)物的提取同時進行，尤其適于連續(xù)生產(chǎn)。(6)親和萃取(親和分配)可大大提高分配系數(shù)和萃取專一性。由于目標(biāo)蛋白質(zhì)與其他雜蛋白的理化性質(zhì)相近，造成其萃取專一性不高。親和萃取就是將一種和目標(biāo)蛋白質(zhì)有很強親和力的配基與一種成相聚合物共價結(jié)合，該成相聚合物與另一種成相聚合物形成雙水相體系進行萃取時，目標(biāo)蛋白質(zhì)專一性地進入結(jié)合有配基的那種成相聚合物所在相中，其它雜蛋白那么進入另一相。此技術(shù)已用于乙醇脫氫酶、丙酮酸激酶和核酸內(nèi)切酶等酶以及細胞、細胞器、膜等粒子的提取。雙水相萃取法的特點是能夠保存產(chǎn)物的活性，整個操作可以連續(xù)化，在除去細胞或細胞碎片時，還可以純化蛋白質(zhì)2～5倍，與傳統(tǒng)的過濾法和離心法去除細胞碎片相比，無論在收率上還是本錢上都要優(yōu)越得多。比傳統(tǒng)的別離方法(如鹽析或有機溶劑沉淀等)相有很大的優(yōu)勢，因此已被廣泛地應(yīng)用在生物化學(xué)、細胞生物學(xué)和生物化工領(lǐng)域，進行生物轉(zhuǎn)化、蛋白質(zhì)、核酸和病毒等產(chǎn)品的別離純化和分析等。用此法提純的酶已達數(shù)十種，其別離過程也到達相當(dāng)規(guī)模，如乙醇脫氫酶的別離已到達幾十千克濕細胞規(guī)模，β-半乳糖苷酶的提取也到了中試規(guī)模等。雙水相萃取的優(yōu)點操作條件溫和，在常溫常壓下進行。兩相的界面張力小，一般在10-4N/cm量級，兩相易分散。兩相的相比隨操作條件而變化。上下兩相密度差小，一般在10g/L。因此兩相別離較困難，目前這方面研究較多。易于連續(xù)操作，處理量大，適合工業(yè)應(yīng)用。二、雙水相萃取的原理依據(jù)懸浮粒子與其周圍物質(zhì)具有的復(fù)雜的相互作用：氫鍵電荷力疏水作用范德華力構(gòu)象效應(yīng)聚合物的不相溶性(incompatibility)：當(dāng)兩種高分子聚合物之間存在相互排斥作用時，由于相對分子質(zhì)量較大，分子間的相互排斥作用與混合過程的熵增加相比占主導(dǎo)地位，一種聚合物分子的周圍將聚集同種分子而排斥異種分子，當(dāng)?shù)竭_平衡時，即形成分別富含不同聚合物的兩相。這種含有聚合物分子的溶液發(fā)生分相的現(xiàn)象稱為聚合物的不相容性。圖a和b分別為PEG/Dx和PEG/KPi系統(tǒng)的典型相圖1雙水相系統(tǒng)a雙節(jié)線系線b雙節(jié)線均相區(qū)均相區(qū)兩相區(qū)兩相區(qū)系線臨界點在系線上各點處系統(tǒng)的總濃度不同，但均分成組成相同而體積不同的兩相。兩相的體積近似服從杠桿規(guī)那么，即系線的長度是衡量兩相間相對差異的尺度，系線越長，兩相間的性質(zhì)差異越大，反之那么越小。當(dāng)系線長度趨向于零時，即在圖b的雙節(jié)線上K點，兩相差異消失，任何溶質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)均為1，因此K點稱為臨界點(criticalpoint)。2雙水相中的分配平衡與溶劑萃取相同，溶質(zhì)在雙水相中的分配系數(shù)也用m=c2/c1表示。為簡便起見，用c1和c2分別表示平衡狀態(tài)下下相和上相中溶質(zhì)的總濃度。

生物分子的分配系數(shù)取決于溶質(zhì)與雙水相系統(tǒng)間的各種相互作用，其中主要有靜電作用、疏水作用和生物親和作用等。因此，分配系數(shù)是各種相互作用的和:lnm=lnme+lnmh+lnmlme，mh，ml分別為靜電作用、疏水作用和生物親和作用對溶質(zhì)分配系數(shù)的奉獻。1）靜電作用非電解質(zhì)型溶質(zhì)的分配系數(shù)不受靜電作用的影響，利用相平衡熱力學(xué)理論可推導(dǎo)下述分配系數(shù)表達式：lnm=-Mλ/RT

m-分配系數(shù)；M-溶質(zhì)的相對分子質(zhì)量；λ-與溶質(zhì)表面性質(zhì)和成相系統(tǒng)有關(guān)的常數(shù);R-氣體常數(shù)，J/(mo1．K)；T-絕對溫度，K。

因此，溶質(zhì)的分配系數(shù)的對數(shù)與相對分子質(zhì)量之間呈線性關(guān)系，在同一個雙水相系統(tǒng)中，若λ>0，不同溶質(zhì)的分配系數(shù)隨相對分子質(zhì)量的增大而減小。同一溶質(zhì)的分配系數(shù)隨雙水相系統(tǒng)的不同而改變，這是因為式中的λ隨雙水相系統(tǒng)而異。實際的雙水相系統(tǒng)中通常含有緩沖液和無機鹽等電解質(zhì)，當(dāng)這些離子在兩相中分配濃度不同時(即分配系數(shù)≠1)，將在兩相間產(chǎn)生電位差，此時，荷電溶質(zhì)的分配平衡將受相間電位的影響，從相平衡熱力學(xué)理論推導(dǎo)溶質(zhì)的分配系數(shù)表達式為:lnm=lnmo+ΔφFZ/RT因此，荷電溶質(zhì)的分配系數(shù)的對數(shù)與溶質(zhì)的凈電荷數(shù)成正比,由于同一雙水相系統(tǒng)中添加不同的鹽產(chǎn)生的相間電位不同，故分配系數(shù)與靜電荷數(shù)的關(guān)系因無機鹽而異.2〕疏水作用一般蛋白質(zhì)外表均存在疏水區(qū)，疏水區(qū)占總外表積的比例越大，疏水性越強。所以，不同蛋白質(zhì)具有不同的相對疏水性。在pH為等電點的雙水相中，蛋白質(zhì)主要根據(jù)外表疏水性的差異產(chǎn)生各自的分配平衡。同時，疏水性一定的蛋白質(zhì)的分配系數(shù)受雙水相系統(tǒng)疏水性的影響。因此，有必要確定雙水相系統(tǒng)的疏水性尺度，以便在萃取操作時調(diào)整和設(shè)計蛋白質(zhì)的分配系數(shù)。PEG/Dx和PEG/無機鹽等雙水相系統(tǒng)的上相(PEG相)疏水性較大，相間的疏水性差用疏水性因子HF(hydrophoblcfactor)表示。HF可通過測定疏水性的氨基酸在其等電點處的分配系數(shù)maa測算lnmaa=HF(RH+B)其中，RH為氨基酸的相對疏水性(relativehydrophobicity)，是通過測定氨基酸在水和乙醇中溶解度的差異確定的，并設(shè)疏水性最小的甘氨酸的RH＝0。B=lnmGly/HF所以，pH＝pI時氨基酸在雙水相系統(tǒng)中的分配系數(shù)與其RH值呈線性關(guān)系，直線的斜率就是該雙水相系統(tǒng)的HF值。利用前式可確定不同雙水相系統(tǒng)的HF值。如果在pH為等電點的雙水相中蛋白質(zhì)的分配系數(shù)(m0)與HF值之間呈線性關(guān)系，那么直線的斜率定義為該蛋白質(zhì)的外表疏水性，用HFS(hydrophobicfactorofsolutes)表示lnm0=HF×HFS一般形式lnm=HF(HFS+ΔHFS)+ΔφFZ/RT該式較全面地描述了雙水相系統(tǒng)的疏水性和相間電位、蛋白質(zhì)的疏水性和凈電荷數(shù)對分配系數(shù)的影響，同時也間接地通過鹽對蛋白質(zhì)外表疏水性和相間電位的影響表現(xiàn)了鹽對蛋白質(zhì)分配系數(shù)的作用。3雙水相系統(tǒng)中目標(biāo)物分配系數(shù)的影響因素成相高聚物濃度－－界面張力成相高聚物的相對分子量一般來說，蛋白等高分子量物質(zhì)易集中于低分子量相電化學(xué)分配雙水相萃取時，蛋白質(zhì)的分配系數(shù)受離子強度的影響很小疏水反響生物親和分配溫度及其它因素

雙水相系統(tǒng)的聚合物組成(包括聚合物類型、平均分子量)，鹽類(包括離子的類型和濃度、離子強度、pH值)，溶質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)(包括分子量、等電點)以及體系的溫度等。這些參數(shù)并不是獨立地起作用。所以要預(yù)測溶質(zhì)在雙水相系統(tǒng)間的分配系數(shù)是困難的。這些系統(tǒng)復(fù)雜性表現(xiàn)在如下的一些例子中：在一相中引入疏水性基團會影響離子的分配和電位，在大分子(親水聚合物或蛋白質(zhì)溶質(zhì))結(jié)構(gòu)中構(gòu)象的變化，能使另一些原子暴露在微環(huán)境中。這些事實導(dǎo)致只能用實驗的方法來確定滿足分配要求的操作條件。1〕雙水相中聚合物組成的影響雙水相系統(tǒng)作為一種成功的萃取方法，很大程度上取決于使用的聚合物類型，當(dāng)兩種不同聚合物的溶液混合時，可能存在三種情況：a完全混溶性(勻相溶液)；b物理的不相溶性(相別離)；c復(fù)雜的凝聚(相別離,聚合物聚集在同一相中，純?nèi)軇?水聚集在另一相中)。離子和非離子聚合物都可以使用在雙水相系統(tǒng)的構(gòu)成上，但是，當(dāng)這兩種聚合物是離子化合物并帶有相反電荷時，它們互相吸引并發(fā)生復(fù)雜的凝聚。2〕雙水相系統(tǒng)物理化學(xué)性質(zhì)的影響雙水相系統(tǒng)的性質(zhì)主要取決于以下物理化學(xué)參數(shù)：密度(ρ)和兩相間的密度差，黏度(μ)和兩相間的黏度差以及外表張力(σ)。系線長度代表了系統(tǒng)到達平衡時上、下相和總組成的關(guān)系，在臨界點附近系線的長度趨向于零，上相和下相的組成相同，因此,分配系數(shù)應(yīng)該是1。隨著聚合物和成相鹽濃度增大，系線的長度增加,上相和下相相對組成的差異就增大，產(chǎn)物如酶在兩相中的界面張力差異也增大，這將會極大地影響分配系數(shù)，使酶富集于上相。3〕鹽和緩沖液的影響鹽的種類和濃度對分配系數(shù)的影響主要反映在對相間電位和蛋白質(zhì)疏水性的影響。在雙聚合物系統(tǒng)中，無機離子具有各自的分配系數(shù)，不同電解質(zhì)的正負離子的分配系數(shù)不同，當(dāng)雙水相系統(tǒng)中含有這些電解質(zhì)時，由于兩相均應(yīng)各自保持電中性，從而產(chǎn)生不同的相間電位，因此，鹽的種類(離子組成)影響蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的分配系數(shù)，鹽濃度不僅影響蛋白質(zhì)的外表疏水性，而且擾亂雙水相系統(tǒng)，改變各相中成相物質(zhì)的組成和相體積比。例如，PEG/KPi系統(tǒng)中上、下相(或稱輕重相)的PEG和磷酸鉀濃度以及Cl離子在上、下相中的分配平衡隨添加NaCl濃度的增大而改變。這種相組成即相性質(zhì)的改變直接影響蛋白質(zhì)的分配系數(shù)。離子強度對不同蛋白質(zhì)的影響程度不同，利用這一特點，通過調(diào)節(jié)雙水相系統(tǒng)中的鹽濃度，可有效地萃取別離不同的蛋白質(zhì)。溫度影響雙水相系統(tǒng)的相圖，因而影響蛋白質(zhì)的分配系數(shù)。但一般來說，當(dāng)雙水相系統(tǒng)離雙節(jié)線足夠遠時，溫度的影響很小，1-2度的溫度改變不影響目標(biāo)產(chǎn)物的萃取別離。大規(guī)模雙水相萃取操作一般在室溫下進行，不需冷卻。這是基于以下原因：(1)成相聚合物PEG對蛋白質(zhì)有穩(wěn)定作用，常溫下蛋白質(zhì)一般不會發(fā)生失活或變性；(2)常溫下溶液粘度較低，容易相別離；(3)常溫操作節(jié)省冷卻費用。4〕溫度的影響溫度對雙水相系統(tǒng)的影響三、雙水相萃取的工藝流程雙水相體系在工業(yè)上主要用于從發(fā)酵液、細胞培養(yǎng)液中別離細胞碎片，提取酶或蛋白質(zhì)。圖是用PEG/無機鹽體系通過2步萃取從產(chǎn)氨短桿菌中回收延胡索酸酶的流程，主要由3局部組成：(1目的產(chǎn)物的萃取；(2)PEG的循環(huán)；(3)無機鹽的循環(huán)。圖1連續(xù)錯流萃取回收酶的流程圖1〕目的產(chǎn)物的萃取細胞懸浮液經(jīng)珠磨機破碎細胞后，與PEG和無機鹽在萃取器中混合，然后進入離心機分相。通過選擇適宜的雙水相組成，一般使目標(biāo)蛋白質(zhì)分配到上相(PEG相)，而細胞碎片、核酸、多糖和雜蛋白等分配到下相(富鹽相)。主要原因有：(1)核酸和多糖由于其親水性，易分配到富鹽相，目標(biāo)蛋白質(zhì)只有分配到富PEG相才能到達別離目的。(2)下相的高鹽濃度易造成蛋白質(zhì)失活或沉淀，而PEG對蛋白質(zhì)有保護作用。(3)細胞碎片分配在下相有利于連續(xù)式離心機別離，如在上相易堵塞離心機出口。第1步萃取后的上相中還含有較多雜蛋白及一些核酸、多糖和色素(色素因其疏水性分配在上相)等，可通過參加適量的鹽，再次形成PEG/無機鹽體系來進行純化。目標(biāo)蛋白質(zhì)仍留在PEG相中。圖2用雙水相萃取法提純酶的流程圖在第3步萃取中那么將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入富鹽相，從而將蛋白質(zhì)與PEG別離開(圖2)。但從經(jīng)濟角度考慮，一般用2步萃取，即在第2步將目標(biāo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入富鹽相。2〕PEG的循環(huán)在大規(guī)模雙水相萃取過程中，成相材料的回收和循環(huán)使用，不僅可以減少廢水處理的費用，還可以節(jié)約化學(xué)試劑，降低本錢。PEG回收有2種方法：一種即前面所述的參加鹽使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入富鹽相來回收PEG(圖2)，一種是將PEG通過離子交換樹脂，洗脫劑先洗出PEG，再洗出蛋白質(zhì)?，F(xiàn)在常用的方法是將第1步萃取的PEG相或除去局部蛋白質(zhì)的PEG相循環(huán)利用(圖1)。3〕無機鹽的循環(huán)一種方法是將含磷酸鈉的鹽相冷卻到6℃，使鹽結(jié)晶析出，然后用離心機別離收集；另一種是用電滲析法、膜別離法回收鹽類或除去PEG相的鹽。雙水相萃取所用的設(shè)備一般都是其他兩相體系如水-有機溶劑體系所通用的設(shè)備，商業(yè)化的混合器-沉淀器系統(tǒng)以及離心別離機已成功應(yīng)用于雙水相萃取。用磁性別離等新技術(shù)也可提高兩相別離。盡管剛開始應(yīng)用時，大多數(shù)雙水相萃取是間歇式的，但此技術(shù)更適合于錯流萃取的連續(xù)生產(chǎn)，這樣可有效利用空間和時間，尤其是在與其他別離技術(shù)如凝膠過濾、膜別離等相結(jié)合使用時。1988年，Hustedt等人證明在工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模上可將雙水相體系用于連續(xù)錯流萃取延胡索酸酶和青霉素配基轉(zhuǎn)移酶。雙水相萃取技術(shù)與層析技術(shù)間的相互關(guān)系工業(yè)上一般先用超濾等方法濃縮發(fā)酵液，再用雙水相萃取酶和蛋白質(zhì)，這樣能提高對生物活性物質(zhì)的萃取效率。最后，用層析等技術(shù)進一步提純以得到產(chǎn)品。所以，雙水相萃取技術(shù)是對層析等高度專一性提純方法的補充，而不是代替。四、雙水相萃取技術(shù)在生物、食品工業(yè)中的應(yīng)用雙水相萃取在生物和食品工業(yè)等領(lǐng)域的研究和應(yīng)用開展較快。到目前為止，雙水相萃取應(yīng)用及研究主要集中在以下幾個方面：(1)提取酶和蛋白質(zhì)。這是雙水相體系研究和應(yīng)用最多的方面，發(fā)酵液、細胞培養(yǎng)液、植物、動物組織中細胞內(nèi)、外的酶和蛋白質(zhì)均可用雙水相體系來提取。工業(yè)上已有幾種雙水相體系用于從發(fā)酵液中別離提取蛋白質(zhì)和酶，絕大多數(shù)是用PEG作上相成相聚合物，葡聚糖、鹽溶液和羥甲基淀粉的其中一種作下相成相物質(zhì)。Lin等用雙水相親和萃取技術(shù)從兔肌中提取乳酸脫氫酶(LDH)，實現(xiàn)了實驗室規(guī)模的提取，純化因子達7，收率80%以上，萃取過程穩(wěn)定可靠，并且聚合物和染料得以充分地循環(huán)使用。Johnsson等曾利用接有染料配基的PEG/葡聚糖雙水相系統(tǒng)從豬肉中提取LDH。經(jīng)提取和純化得到的LDH，比活可達456~494U/mg，他們還對這一技術(shù)的放大進行了摸索和探討。(2)進行萃取性生物轉(zhuǎn)化。應(yīng)用實例有：利用葡萄糖和淀粉生產(chǎn)乙醇、利用葡萄糖生產(chǎn)丙酮丁醇、利用淀粉和纖維素水解生產(chǎn)葡萄糖、水解酪蛋白、發(fā)酵生產(chǎn)乳酸、將青霉素G轉(zhuǎn)化為6-氨基青霉烷酸等。(3)食品工業(yè)中用來從酸水解產(chǎn)物中提取二肽、氨基酸、核苷酸等風(fēng)味物質(zhì)。在生物技術(shù)方面，可用來提取DNA。(4)萃取細胞、細胞器、膜等粒子。大多數(shù)都是用親和萃取方法來到達目的的。(5)應(yīng)用于液-液分配層析(LLPC)。將一種聚合物連接在固體顆粒(支持物)上，另一種聚合物的溶液作為流動相，這種柱層析技術(shù)可別離蛋白質(zhì)、核酸以及細胞混合物。(6)中草藥中有效成分的提取：近年來有關(guān)雙水相提取天然藥物中有效成分的報道逐年增多。以乙醇-磷酸氮二鉀-水雙水相體系萃取甘草有效成分，在最正確條件下，分配系數(shù)(K)達12.8，收率(Y)高達98.3%。用雙水相萃取體系富集別離銀杏葉浸取液的研究，也有良好的分配系數(shù)和別離效果。(7)雙水相在金屬離子別離中的應(yīng)用：傳統(tǒng)的金屬離子溶劑萃取方法存在著溶劑污染環(huán)境、對人體有害、運行本錢高、工藝復(fù)雜等缺點。近年來，利用雙水相技術(shù)萃取別離金屬離子到達了較高的水平。新型雙水相系統(tǒng)的開發(fā)：在生物物質(zhì)別離過程中得到應(yīng)用的雙水相系統(tǒng)有2類：非離子型聚合物/非離子型聚合物/水系統(tǒng)和非離子型聚合物/無機鹽/水系統(tǒng)。因為這2類系統(tǒng)所用的聚合物無毒性,己被許多國家的藥典所收錄,而且其多元醇、多元糖結(jié)構(gòu)能使生物大分子穩(wěn)定。但在實際應(yīng)用中,這2類雙水相系統(tǒng)各有優(yōu)缺點,前者體系對生物活性物質(zhì)變性作用低,界面吸附少,但是所用的聚合物如葡聚糖價格較高,而且體系黏度大,影響工業(yè)規(guī)模應(yīng)用的進展；后者本錢相