逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)%28RT-PCR%29

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)的原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方法逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)材料組織或細(xì)胞樣品試劑、試劑盒RNA提取試劑dNTP混合物TaqDNA聚合酶第一鏈cDNA合成試劑盒儀器、耗材離心管離心機(jī)水浴鍋PCR管電泳儀凝膠圖像分析系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)的原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。一、反轉(zhuǎn)錄酶的選擇1．Money鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37℃2．禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃3．Thermusthermophilus、Thermusflavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：在Mn2+存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA，以消除RNA模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)。4．MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH-突變體：商品名為Superscript和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，這一特性允許從含二級(jí)結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。二、合成cDNA引物的選擇1．

隨機(jī)六聚體引物：當(dāng)特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時(shí)，可采用隨機(jī)六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時(shí)，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴(kuò)增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。2．

Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機(jī)六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。3．

特異性引物：最特異的引發(fā)方法是用含目標(biāo)RNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應(yīng)用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA3’端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴(kuò)增。三、試劑準(zhǔn)備1．RMA提取試劑2．第一鏈cDNA合成試劑盒3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM4．TaqDNA聚合酶四、操作步驟1.總RNA的提?。阂娤嚓P(guān)內(nèi)容。2.cDNA第一鏈的合成：目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一?，F(xiàn)以GIBICOL公司提供的SuperScriptTMPreamplificationSystem

forFirstStrandcDNASynthesis試劑盒為例。①在0.5ml微量離心管中，加入總RNA1-5μg，補(bǔ)充適量的DEPCH2O使總體積達(dá)11μl。在管中加10μMOligo（dT）12-181μl，輕輕混勻、離心。②70℃然后加入下列試劑的混合物：10×PCRbuffer

2μl；25mMMgCl2

2μl；10mMdNTPmix1μl；0.1MDTT

2μl輕輕混勻，離心。42℃③加入SuperscriptⅡ1μl，在42℃④于70℃⑤將管插入冰中，加入RNaseH1μl，37℃孵育20min，降解殘留的RNA。-203．PCR：①取0.5mlPCR管，依次加入下列試劑：第一鏈cDNA

2μl；上游引物（10pM）2μl；下游引物（10pM）2μl；dNTP(2mM)4μl；10×PCRbuffer5μl；Taq酶（2u/μl）1μl。②加入適量的ddH2O，使總體積達(dá)50μl。輕輕混勻，離心。③設(shè)定PCR程序。在適當(dāng)?shù)臏囟葏?shù)下擴(kuò)增28-32個(gè)循環(huán)。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠與準(zhǔn)確，可在PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，加入一對內(nèi)參（如G3PD）的特異性引物，同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)參DNA，作為對照。④電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。⑤密度掃描、結(jié)果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對電泳條帶進(jìn)行密度掃描。五、注意事項(xiàng)1．在實(shí)驗(yàn)過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂。2．為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對照。3．內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動(dòng)蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。4．PCR不能進(jìn)入平臺(tái)期，出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的