支原體污染-細胞培養(yǎng)技術

支原體污染及防治從門外漢角度談—11支原體污染易被忽視1.培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁2.細胞病理變化輕微或不顯著3.細微變化也可由于傳代，換液而緩解。4.個別嚴重者，可致細胞增殖緩慢，甚至從培養(yǎng)器皿脫落22支原體高污染率國內外研究表明，在細胞培養(yǎng)中，支原體感染率達到30-60%支原體污染已成為世界問題！33333333支原體的生物特性◆是目前發(fā)現(xiàn)的最小細胞，直徑約為0.13-0.18μm?！魺o細胞壁，不能維持固定的形態(tài)，變形能力大?！舾锾m氏染色不易著色或呈陰性。◆胞膜中含有膽固醇或其他甾醇?！舳鄶?shù)支原體適合在偏堿性條件下生存（pH值7．6~8．0），對酸耐受性差。◆對熱比較敏感，對一般抗生素不敏感。4支原體污染的類型口腔支原體(M.orale)精氨酸支原體(M.arginini)豬鼻支原體(M.hyorhinis)發(fā)酵支原體(M.fermentans)梨支原體(M.pirum)萊氏無膽甾原體(A.laidlawi）5支原體污染的來源操作者無菌操作技術不當、污染之培養(yǎng)基、血清、細胞等。操作室環(huán)境不佳、實驗器具不潔。6科研人員的困惑有些實驗結果僅能在支原體陽性的細胞中得到也曾有利用腫瘤細胞制備的單克隆抗體實為針對所污染的支原體的抗體。還有的科研成果,他人無法重復,也因所用細胞有支原體污染所致。實驗結果真實性和可靠性大大下降7支原體污染對細胞的影響

1、影響細胞的生長狀態(tài)及形態(tài)支原體可使培液中支持細胞生長的營養(yǎng)物質含量減少，造成細胞生長緩慢甚至停止；另外還會導致細胞微管解聚，引起細胞一系列病變，表現(xiàn)為細胞收縮、貼壁細胞脫落、裂解等。8支原體污染對細胞的影響9

支原體污染對細胞的影響2.影響細胞的代謝和功能（1）培液中的精氨酸被支原體大量消耗，引起細胞蛋白質、DNA、rRNA、mRNA的合成障礙；（2）支原體活動使培液成分發(fā)生改變（如發(fā)酵型支原體降解糖類產生酸性物質），影響細胞代謝。（3）支原體吸附在細胞表面，破壞細胞膜的完整性，影響細胞信號傳遞；10支原體污染對細胞的影響（4）支原體消耗細胞的核苷庫—染色體異常1112支原體污染對細胞的影響3、其他此外，支原體污染還會影響一些病毒在細胞中的產量、使惡性細胞致癌能力下降、影響淋巴細胞分化等。13支原體污染的檢測方法培養(yǎng)法DNA熒光染色法聚合酶鏈反應(PCR)法電子顯微鏡法相差顯微鏡檢測3-H胸腺嘧啶摻入法酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫熒光法低張?zhí)幚淼匾录t染色觀察14支原體污染的常用檢測方法

1.培養(yǎng)法：原理是利用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基,直接對待檢細胞、血清等進行支原體培養(yǎng)。支原體集落呈“油煎蛋”樣缺點：靈敏度低，試驗周期長，不能檢測到種且不適用于檢測所有支原體。15支原體污染的常用檢測方法DNA熒光染色法利用熒光Hoechst33258標記細胞和支原體DNA,在紫外光(波長為630nm)激發(fā)下產生黃綠色熒光,利用熒光顯微鏡觀察支原體是否存在。16支原體污染的常用檢測方法缺點：有時易出現(xiàn)假陰性和假陽性17支原體污染的常用檢測方法PCR法：通過擴增被檢測標本中的支原體DNA,再進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳完畢,將電泳膠在紫外投射儀下觀察,根據(jù)標準分子量及陽性對照、內對照條帶,觀察待測樣品中是否有陽性條帶。18應對支原體污染的策略一

細胞一旦發(fā)生了支原體污染,應當棄之。雖然已有了針對支原體的抗生素及最近出現(xiàn)的所謂支原體清除劑,這些方法只能殺滅細胞外的支原體。除非是不可替代或無法重新獲得的細胞一，般沒有必要進行支原體清除工作。19支原體的清除方法20支原體的清除方法新一代支原體抗生素M-Plasmocin其含有兩種殺菌成分,一種成分通過干擾核糖體的翻譯功能而使蛋白合成受阻。另一種成分則通過干擾復制叉的形成而阻止DNA的復制?？梢詮娦怪гw及相關的無胞壁的細菌,同時又不影響細胞本身的代謝,且處理過的細胞不會重新感染支原體,是目前對抗支原體最理想的方法。21M-Plasmocin支原體感染的細胞經M-Plasmocin處理過的細胞22應對支原體污染的策略二

1.從可靠來源引進、使用細胞,特別是知名的信譽良好的專門機構,如ATCC、基礎醫(yī)學細胞中心等,這些機構對細胞質量進行一系列檢測。2.預防為主:細胞培養(yǎng)實驗室應制定嚴格的管理制度,按照規(guī)范