分子生物學平臺上的食品微生物快速檢測及鑒定技術課件

分子生物學平臺上的食品微生物快速檢測及鑒定技術在分子生物學技術上引領前行1LifeTechnologiesProfile

美國生命技術公司營業(yè)收入~$3.2B產(chǎn)品種類~50,000國家160員工數(shù)量9,600客戶數(shù)量~75,000專利許可~3,600Note:LTMrevenueasofSeptember30,2009;doesnotincludeMassSpecJVrevenue2臨床分子診斷基因治療藥物再生醫(yī)學工業(yè)生物制藥法醫(yī)食品安全動物健康科研PCR技術測序技術細胞(分離,操作，分析)“ToolsProvider”提供工具“SolutionsProvider”提供解決方案AppliedBiosystems–分子生物學技術的領導者超過25年的分子生物學產(chǎn)品開發(fā)歷程1982年,全球第一臺蛋白質測序儀；1986年，全球第一臺核酸測序儀1986年，全球第一個實時熒光定量技術和TaqMan?技術全球>30,000個實驗室的>220,000儀器正在被使用3LifeTechnology食品微生物系統(tǒng)解決方案樣品前處理Dynabead?磁珠富集MagMAX?Express核酸自動提取快速檢測RapidFinder?常規(guī)qPCR檢測超高通量的篩查OpenArray?芯片鑒定與分型MicroSEQ?ID基因分析靈活的組合方案，滿足不同層次的應用需求4病原微生物樣品制備

PrepSEQ?

快速離心核酸提取試劑盒AB專利的離心柱材料較化學法，更加有效去除PCR抑制劑步驟少、操作簡單可處理多達750uL的樣品無需額外的設備適合少量樣品采用PrepSEQ?快速離心試劑盒，結果明顯優(yōu)于普通直接裂解；尤其對于存在PCR抑制劑的樣品，普通裂解法可能無法檢出，而PrepSEQ?快速離心法可以得到一致的結果樣品：巧克力檢測項目：沙門氏菌樣品：布里奶酪檢測項目：李斯特菌*標注的是因PCR抑制劑的存在導致樣品中待測菌無法檢出5病原微生物樣品制備

SamplePCRcompatibleNAsolutionLysisMagneticParticles+BindingSolutionWash2XMagneticSeparationMagneticSeparationElutionMME-96核酸提取儀自動化高通量自動化的理想選擇PrepSEQ?

核酸提取試劑盒提高核酸回收率有效去除抑制劑食品，環(huán)境及臨床樣品+自動化的核酸提取流程，一次最多處理96個樣品6食品致病菌檢測解決方案樣品制備軟件

RapidFinder?Express軟件PrepSEQ?RapidSpin樣品制備系統(tǒng)檢測試劑MicroSEQ?

食品致病菌檢測試劑盒儀器7500快速實時熒光定量PCR儀器PrepSEQ?NAExtraction

樣品制備系統(tǒng)7食品及環(huán)境病原微生物檢測致病菌系列沙門氏菌（AOACcertificated）單增李斯特菌（AOACcertificated）李斯特菌屬（AOACcertificated）大腸桿菌O157:H7（AOACcertificated）阪崎腸桿菌空腸彎曲桿菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌彎曲桿菌多重檢測：空腸/大腸/紅嘴鷗金黃色葡萄球菌創(chuàng)傷、霍亂和副溶血性弧菌的多重檢測定制設計環(huán)境和生物安全系列軍團菌屬定量檢測試劑盒嗜肺軍團菌定量檢測試劑盒土拉弗朗西斯菌檢測試劑盒炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒布魯氏菌屬檢測試劑盒鼠疫耶爾森菌檢測試劑盒8最新O157:H7檢測試劑盒：提升特異性引物、探針設計：基于SOLiD?測序技術分析結果新的設計，針對O157:H7特有的序列，避免O55:H7被測出-雙重目標基因設計，提高特異性-將O55全基因組測序，并與O157相比較ORFs(bothstrands)GCcontentper1000bpO157:H7(EDL933)referencesequenceO157:H7SOLiD?coverageO55:H7SOLiD?coverageO157:H7uniquesequences9TaqMan實驗數(shù)據(jù)驗證：包括低濃度的O157:H7/HM不同菌株包括對非O157:H7的大腸桿菌菌株的檢測不含O157的真實牛肉樣品最新O157:H7檢測試劑盒：提升特異性10O157:H7檢測試劑盒：8小時內獲得結果6小時BHI增菌60分鐘DNA提取40分鐘PCR25g牛肉手工操作時間<1小時10分鐘10分鐘整個流程~8小時MicroSEQ?

大腸桿菌

O157:H7工作流程10分鐘樣品制備設置10分鐘10分鐘PCR設置市場上最快的檢測方法已經(jīng)獲得AOAC及AFNOR的認可11MicroSEQ?

沙門氏菌檢測操作流程–

快速獲得結果，最少的手工操作時間<18小時獲得結果過夜增菌提取反應設置

運行及分析1216SrDNA雙氮養(yǎng)弧菌與創(chuàng)傷弧菌，解蛋白弧菌與副溶血性弧菌，最小弧菌與霍亂弧菌的親緣關系很近基于公共數(shù)據(jù)庫，AB自有數(shù)據(jù)庫，特定基因測序分析，篩選出針對三個目標菌種的8個不同基因的19個AssayMicroSEQ微生物鑒定系統(tǒng)快速同時檢測創(chuàng)傷弧菌，副溶血性弧菌，霍亂弧菌13弧菌多重PCR設計考慮到多重檢測在一起的相互影響，三個不同的種分別設計了1-2套不同的Assay14優(yōu)化配方，最終實現(xiàn)弧菌的多重檢測通過不同的熒光標記，將副弧、霍亂、創(chuàng)傷這三個不同種的弧菌區(qū)分開來15開放的系統(tǒng):滿足不同的食品檢測需求致病菌檢測試劑盒沙門氏菌，單增李斯特菌大腸桿菌O157:H7空腸彎曲桿菌，金葡菌綠膿桿菌，副弧/霍亂/創(chuàng)傷軍團菌,坂崎桿菌個性化訂制引物、探針合成服務轉基因檢測試劑盒玉米轉基因檢測試劑盒大豆轉基因檢測試劑盒動物健康檢測試劑盒禽流感，新城疫藍耳病，豬胎毛滴蟲豬肺炎支原體，豬瘟藍舌病，副結核牛病毒性腹瀉病毒牛呼吸道合胞體病毒

客戶實驗室設計合成實驗室設計人類傳染病檢測試劑盒甲型H1N1檢測甲型流感通用型流感亞型H5/H7/N1炭疽芽孢桿菌/布魯氏菌鼠疫耶爾森土拉弗朗西斯菌肉類ID鑒定試劑盒豬肉ID鑒定牛肉ID鑒定雞肉ID鑒定1617OpenArray?定量PCR微流體芯片

HydrophilicHydrophobicDataPointsperdaywithOpenArray基因分型基因表達70,00032,000OpenArrayPlateLayout子陣48(12x4)通孔:33nl64通孔/子陣(8x8)SPATIALMULTIPLEXING…3072個通孔：相當于32x96孔板或者8x384微孔板18TaqManOpenArray玻片:格式SNP位點數(shù)163212864192256樣本數(shù)1449648241612XXXXXXOpenArray?SNP芯片：格式19為什么使用OpenArray做病原體檢測一次實驗，檢測并定量多種病原體生物

一次檢測多樣本

快速出結果

靈敏度和準確性優(yōu)于標準的培養(yǎng)法和免疫法LifeTech可以幫助用戶設計所需的芯片20應用案例：人類病原體檢測來自RobertSlinger小組在加拿大安大略省兒童醫(yī)院的實驗結果從臨床樣品(咽喉拭子棒）快速檢測多種呼吸道病毒或病菌.

驗證在OpenArray平臺上檢測納升級別的qPCR反應的適用性“WewantedtoseeifwecoulduseqPCRtofigureoutthecauseofinfections,andthoughttheOpenArrayplatformhadthemostpotentialbecausewecoulddothousandsofreactionsatonce,”–RobertSlinger,CHEO21Viral

InfluenzaA-panInfluenzaAH3,H1&H5InfluenzaAH1Swine2009strainInfluenzaAN1oseltamivir-resistancemutationInfluenzaBRespiratorysyncytialvirusAandBParainfluenzavirus1-4RhinovirusEnterovirusCoronavirusOC43,NL63,HKU1,229EHumanmetapneumovirusBocavirusAdenovirus一張芯片整合多種呼吸道病原體檢測BacterialMycoplasmapneumoniaeChlamydophilapneumoniaeLegionellapneumophilaMycobacteriumtuberculosisStreptococcuspneumoniaeStreptococcuspyogenesStaphylococcusaureusMethicillin-resistantStaphylococcusaureusStreptococcusdysgalactiaesubsp.Equisimilis(GroupCandGstreptococci)Streptococcusagalactiae(GroupBstreptococcus)HaemophilusinfluenzaeMoraxellacararrhalisBordetellapertussisBordetellaparapertussisOnesample每個樣本檢測22種呼吸道病毒和16種呼吸道細菌

每張芯片檢測12個樣本

每個檢測3重復

每個病毒檢測3個target

每個和樣品8個空白對照內參人工合成對照qPCRAssays22MicroSEQ?微生物鑒定系統(tǒng)23微生物鑒定分型發(fā)展的三個階段

第一階段：依據(jù)表型鑒定分型培養(yǎng)、格蘭氏染色、生理生化、形態(tài)學等黃金時代：上世紀80年代-本世紀初

第二階段：片段長度多態(tài)性分析

限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機擴增的多態(tài)性DNA(RAPD)、脈沖場凝膠電泳(PFGE)、細菌的核糖體基因分型(Ribotyping)、多位點序列分析(MLST)、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)、重復序列擴增(rep-PCR)黃金時代：本世紀初-至今

第三階段：基因序列分析（分子生物學的方法）采用測序技術，確定目標基因的每個堿基黃金時代：現(xiàn)在-未來5-10年/下一代單分子測序技術產(chǎn)生24

基于16S核糖體基因測序的鑒定方法

伯杰氏手冊推薦細菌命名學的新標準《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》采用16SrDNA測序提供更高的分類學信息

快速準確提供鑒定結果客觀性，重現(xiàn)性好方便不同團體、實驗室間信息共享和交流正在成為微生物鑒定的金標準25MicroSEQTM微生物鑒定系統(tǒng)不需要事前掌握微生物的信息

微小的可見的單菌落即可無需革蘭氏染色無需生化試驗無需鑒定的經(jīng)驗Easy5-stepWorkflow26結果–數(shù)據(jù)比對結果種最高匹配同源性–遺傳進化樹差異27

MicroSEQ?ID經(jīng)過驗證的強大數(shù)據(jù)庫全部經(jīng)過驗證16S

500: 2020entries16S全基因: 1261entriesD2(真菌): 1113entries每隔一年半定期更新新增加的菌最新的命名原則包括諸多環(huán)境分離菌的信息使用者可以登錄公司網(wǎng)站提供建議最大，最全面且經(jīng)過驗證的細菌和真菌數(shù)據(jù)庫28MicroSEQID鑒定技術的特點

MicroSEQID的方法準確重現(xiàn)性好穩(wěn)定簡單將不能或難以鑒定的微生物種類從20％下降到2％！29微生物鑒定及菌株分子分型

滿足不同層次的應用需求MicroSEQ?微生物鑒定系統(tǒng)基于16SrRNA序列測定實現(xiàn)細菌在種水平的鑒定

基于核糖體大亞基(LSU)序列測定實現(xiàn)真菌在種水平的鑒定菌株分型的分子平臺測序檢測MLST片段分析AFLPMLVA微生物耐藥機理的研究SNaPshotMultiplex SSCP30遺傳分析儀在MLVA研究中的應用多重PCR選擇正確的擴增引物是取得成功的關鍵16個甚至更多的STR位點同時被擴增7repeats8repeatsSTR位點由特定引物延伸的旁側序列具有保守性不同菌株的串聯(lián)重復序列拷貝數(shù)存在差異AMELD3TH01TPOXPentaDPentaEFGAD21D18CSFD16D7D13D5VWAD8由遺傳分析儀電泳分離PCR擴增產(chǎn)物/片段結合不同的熒光染料標記和遷移率的修飾技術，實現(xiàn)多重分析31STECO157/SalmonellaTyphimuriumProtocolMLVA是食源性微生物分型國際組織Pulsenet推薦的食品微生物分型方法，中國CDC及各省級CDC均設立相關機構參與其中.32大腸桿菌7個位點的MLVA，實現(xiàn)對O157:H7的分型Lindstedt,etal.(2003)Ann.Clin.Microbiol.Antimicr.,2,12.SevenlocusMLVAschemeinasingledyechannelIdentified47distinctMLVApatternsamong73O157:H7strainsSequencealignmentoftheVhec4VNTRlocifromisolatesG5300andIHE5344.TheresultsfromthesequencingshowthattheelectrophoreticmobilityshiftbetweenisolatesIHE5344(upperstrand)andG5300(lowerstrand)iscausedbydifferentnumbersofAAATAGrepeatunitsaloneEscherichiacoliO1