第二代測(cè)序簡(jiǎn)介

第二代測(cè)序簡(jiǎn)介

劉云山第一代測(cè)序第一代技術(shù)主要采用1977年Sanger發(fā)明的末端終止測(cè)序法在每一輪的Sanger測(cè)序反應(yīng)中，在鏈延伸的同時(shí)加入熒光標(biāo)記過的ddNTP，被結(jié)合的鏈將終止合成反應(yīng)，沒有被結(jié)合的將繼續(xù)根據(jù)模板鏈合成，一直重復(fù)這樣的過程直到所有的合成反應(yīng)都被終止。這樣將得到大量長(zhǎng)短—末端被同熒光標(biāo)記的序列，通過電泳對(duì)以將不同長(zhǎng)度的序列分離開，這樣就可以逐個(gè)堿基的讀出整個(gè)序列了。一個(gè)反應(yīng)所測(cè)的序列不可能太長(zhǎng)，通常為1000個(gè)核苷酸左右，測(cè)序通量不大，且測(cè)序反應(yīng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力；由于DNA聚合酶造成的堿基錯(cuò)配，因此測(cè)序的準(zhǔn)確度并不高；基于技術(shù)的基因組測(cè)序十分昂貴，從基因組中預(yù)測(cè)基因的方法也十分有限。測(cè)序技術(shù)的發(fā)展90年代：DNA芯片技術(shù)21世紀(jì)：第二代高通量測(cè)序技術(shù)第二代測(cè)序第二代測(cè)序，即大規(guī)模平行測(cè)序平臺(tái)，具有通量大，讀長(zhǎng)短的特點(diǎn)。代表技術(shù)： Illumina公司遺傳分析儀

(Solexa)

：邊合成邊測(cè)序法; Roche公司的４５４平臺(tái):焦磷酸合成測(cè)序法; ABI公司推出的SOLiD系統(tǒng):邊連接邊測(cè)序法。Illumina-Solexa基本流程：1.構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。提取基因組ＤＮＡ，隨機(jī)打斷成100~200bp片段，末端加上接頭；2.橋式擴(kuò)增。解鏈后的單鏈ＤＮＡ片段兩端被分別固定于芯片上，形成橋狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)行橋式ＰＣＲ擴(kuò)增。經(jīng)過ＰＣＲ擴(kuò)增，產(chǎn)生數(shù)百萬(wàn)條待測(cè)的ＤＮＡ片段，隨后被線性化；3.測(cè)序。將熒光標(biāo)記的ｄＮＴＰ、聚合酶、引物加入到測(cè)序通道啟動(dòng)測(cè)序循環(huán)。ＤＮＡ合成時(shí)，伴隨著堿基的加入會(huì)有焦磷酸被釋放，從而發(fā)出熒光，不同堿基用不同熒光標(biāo)記，讀取到核苷酸發(fā)出的熒光后，將３′羥基末端切割，隨后加入第２個(gè)核苷酸，重復(fù)第一個(gè)核苷酸的步驟，直到模板序列全部被合成雙鏈ＤＮＡ。特點(diǎn)：測(cè)序通量大、速度快、成本低；性價(jià)比最高。Illumina-SolexaFlow-cellRoche-454基本流程：1.構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。將基因組ＤＮＡ打碎成300~800bp的片段后，在兩端加上錨定接頭；2.乳液ＰＣＲ擴(kuò)增。每個(gè)含有接頭的ＤＮＡ片段被固定在特定的磁珠上，進(jìn)行乳液ＰＣＲ擴(kuò)增。多個(gè)循環(huán)后，磁珠表面被打破，擴(kuò)增產(chǎn)生的成千上萬(wàn)個(gè)拷貝仍然在磁珠表面；3.焦磷酸測(cè)序。將磁珠轉(zhuǎn)移到ＰＴＰ板上，每個(gè)ＰＴＰ板上的小孔只能容下１個(gè)磁珠。分別裝有A、T、C、G４種堿基的試劑瓶，依次進(jìn)入ＰＴＰ板，每次只進(jìn)１個(gè)堿基，如果發(fā)生配對(duì)，就會(huì)釋放１個(gè)焦磷酸，釋放出的熒光信號(hào)會(huì)被ＣＣＤ捕獲到。每個(gè)堿基反應(yīng)都會(huì)捕獲到１個(gè)熒光信號(hào)，由此一一對(duì)應(yīng)，模板的堿基序列由此獲得。特點(diǎn)：讀長(zhǎng)長(zhǎng)，但是準(zhǔn)確率低、成本高。Roche-454乳化：形成油包水的混合物。ABI-SOLiD基本流程：

1.文庫(kù)制備。將基因組ＤＮＡ打斷，在其兩頭加上接頭，構(gòu)建成文庫(kù)；2.乳液ＰＣＲ／磁珠富集。此過程與454測(cè)序技術(shù)類似，不過SOLiD的微珠只有１μｍ；3.連接測(cè)序?；旌系模笁A基單鏈熒光探針為連接反應(yīng)的底物，探針的５′端用４色熒光標(biāo)記，３′端第１、２位堿基對(duì)應(yīng)５′端熒光信號(hào)的顏色。因?yàn)橹挥兴纳珶晒猓矀€(gè)堿基卻有１６個(gè)組合情況，故４種堿基對(duì)應(yīng)一種顏色的熒光。單次測(cè)序由５輪測(cè)序反應(yīng)組成，反應(yīng)后得到的為原始顏色序列。特點(diǎn)：通量最大，最準(zhǔn)確（>99.94%）;但讀長(zhǎng)最短，雙末端測(cè)序困難。ABI-SOLiDSingle-read,Paired-end,Mate-pair單末端測(cè)序（Single-read）：,首先將DNA樣本進(jìn)行片段化處理形成200-500bp的片段，引物序列連接到DNA片段的一端，然后末端加上接頭，將片段固定在flowcell上生成DNA簇，上機(jī)測(cè)序單端讀取序列。這種方法較簡(jiǎn)單,但是它只有一端有拼接信息,不利于拼裝;Single-read,Paired-end,Mate-pair雙末端測(cè)序（Paired-end）：構(gòu)建待測(cè)DNA文庫(kù)時(shí)在兩端的接頭上都加上測(cè)序引物結(jié)合位點(diǎn)，在第一輪測(cè)序完成后，去除第一輪測(cè)序的模板鏈，用對(duì)讀測(cè)序模塊(Paired-End

Module)引導(dǎo)互補(bǔ)鏈在原位置再生和擴(kuò)增，以達(dá)到第二輪測(cè)序所用的模板量，進(jìn)行第二輪互補(bǔ)鏈的合成測(cè)序。Single-read,Paired-end,Mate-pairMate-pair文庫(kù)制備:旨在生成一些短的DNA片段，這些片段包含基因組中較大跨度(2-10kb)片段兩端的序列，更具體地說：首先將基因組DNA隨機(jī)打斷到特定大小（2-10kb范圍可選）；然后經(jīng)末端修復(fù)，生物素標(biāo)記和環(huán)化等實(shí)驗(yàn)步驟后，再把環(huán)化后的DNA分子打斷成400-600bp的片段并通過帶有鏈親和霉素的磁珠把那些帶有生物素標(biāo)記的片段捕獲。這些捕獲的片段再經(jīng)末端修飾和加上特定接頭后建成mate-pair文庫(kù)，然后上機(jī)測(cè)序。第二代測(cè)序的應(yīng)用

——基因組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)基因組從頭測(cè)序及重測(cè)序從頭測(cè)序：

denovosequencing，主要應(yīng)用于基因組序列未知的物種，ＤＮＡ片段測(cè)序后，用生物信息學(xué)軟件對(duì)序列進(jìn)行拼接、組裝，從而獲得該物種的基因組序列圖譜。重測(cè)序是指該物種基因組序列已被測(cè)序，有參考基因組序列的測(cè)序工作。由于第２代測(cè)序技術(shù)測(cè)序讀長(zhǎng)較短，完成基因組的從頭測(cè)序一般需要第一代測(cè)序技術(shù)的輔助，但是可以完成簡(jiǎn)單生物的基因組從頭測(cè)序及所有生物的基因組重測(cè)序。在第二代測(cè)序技術(shù)的推動(dòng)下，大量生物的全基因組被順利測(cè)序，大量物種的基因組計(jì)劃完成?；蚪M研究策略

主要分為基因組測(cè)序、基因組組裝、基因組完成、基因預(yù)測(cè)、基因注釋和基因組比較分析六大部分。

第一步：DNA的提取及測(cè)序。

常用平臺(tái)有：Solexa、454、SOLiD。第二步：基因組組裝。

常用的軟件有Newbler、AMOScmp、Phred/Phrap/Consed和Velvet等。第三步：基因組完成。即確定組裝獲得的Contigs之間的連接順序并修補(bǔ)Gaps。第四步：基因預(yù)測(cè)。常用的蛋白質(zhì)編碼基因預(yù)測(cè)軟件有Glimmer、GeneMarkS和Prodigal。第五步：基因注釋。通常要整合多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù),通過序列比對(duì)進(jìn)行預(yù)測(cè)基因的注釋。第六步：基因組比較分析。通常會(huì)進(jìn)行相近物種之間或同一物種不同個(gè)體之間的基因組比較分析。轉(zhuǎn)錄組研究?jī)?nèi)容

轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)的研究（起始密碼子鑒定、內(nèi)含子邊界確定、UTR確定、可變剪切等），表達(dá)量研究，ＳＮＰ（單核苷酸多態(tài)性）位點(diǎn)研究，新轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)，非編碼區(qū)功能研究（小RNA、非編碼RNA的研究）

轉(zhuǎn)錄組:是指在特定的發(fā)育階段和生理?xiàng)l件下細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的所有轉(zhuǎn)錄物，包括mRNA、rRNA、tRNA和其他的非編碼RNA，狹義上也可以指細(xì)胞所能轉(zhuǎn)錄出的所有mRNA，這個(gè)術(shù)語(yǔ)適用的范圍是一個(gè)給定的有機(jī)體、組織或者特定的細(xì)胞集合。轉(zhuǎn)錄組學(xué)(transcriptomics):是一門從整體水平上研究基因轉(zhuǎn)錄情況和轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究分為序列水平與表達(dá)量水平兩個(gè)層面的內(nèi)容，這兩個(gè)層面綜合在一起完整的反映了生物體遺傳信息的表達(dá)方式。序列水平的研究:包括對(duì)未知轉(zhuǎn)錄本的探索以及對(duì)同一個(gè)基因在不同樣品中的序列差異分析。表達(dá)量水平的研究:可以加深了解生物體基因調(diào)節(jié)的過程和特殊性狀產(chǎn)生的分子機(jī)制。RNA-seq：基于第二代測(cè)序平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)。轉(zhuǎn)錄組研究策略第一步：RNA提取和測(cè)序。提取總RNA，進(jìn)行預(yù)處理；將預(yù)處理后的RNA打斷后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，在兩端加上接頭后固定到測(cè)序芯片上；隨后對(duì)測(cè)序芯片上的每個(gè)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，測(cè)到的每一段序列都是一個(gè)read。測(cè)得的所有reads就包含了樣品中的轉(zhuǎn)錄組信息。第二步,檢查reads質(zhì)量。當(dāng)二代測(cè)序的原始數(shù)據(jù)拿到手之后，第一步要做的就是看一看原始reads的質(zhì)量，常用的工具就是fastqc。轉(zhuǎn)錄組研究策略橫軸代表位置，縱軸quality。紅色表示中位數(shù)，黃色是25%-75%區(qū)間，觸須是10%-90%區(qū)間，藍(lán)線是平均數(shù)。若任一位置的下四分位數(shù)低于10或中位數(shù)低于25，報(bào)"WARN"；若任一位置的下四分位數(shù)低于5或中位數(shù)低于20，"FAIL".第三步，Readsmapping首先將Reads進(jìn)行Mapping,從而獲得Reads在基因組上的位置,常用的Mapping軟件有BWA、Bowtie、SOAP2等?；诤缶YＴｒｉｅ思想的Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ轉(zhuǎn)換可以用“循環(huán)、排序”四個(gè)字來概括．將基因組序列按一定規(guī)則壓縮并建立索引，再通過查找和回溯來定位讀段，在查找時(shí)可通過堿基替代來實(shí)現(xiàn)允許的錯(cuò)配。轉(zhuǎn)錄組研究策略轉(zhuǎn)錄組研究策略第四步，根據(jù)Readsmapping結(jié)果,進(jìn)行后繼分析。TSS鑒定:根據(jù)基因組上的Readscoverage來鑒定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn);5′UTR和3′UTR鑒定:鑒定編碼基因中轉(zhuǎn)錄但不翻譯的區(qū)域,即5′UTR和3′UTR;Operon鑒定:根據(jù)TSS、Readscoverage等鑒定;新基因鑒定:找出之前沒有注釋但是表達(dá)的區(qū)域,并根據(jù)是否存在ORF區(qū)分為蛋白質(zhì)編碼基因(Codinggene)和非蛋白質(zhì)編碼基因(SmallRNAgene);AntisenseRNA鑒定:根據(jù)SmallRNA與其他基因的位置關(guān)系確定是否是AntisenseRNA;Pseudogenes分析: