DB34-T 3653-2020 番鴨胚垂直傳播病毒(RT-)PCR檢測技術(shù)規(guī)范

41DB34

番鴨胚垂直傳播病毒(RT-)PCR

技術(shù)規(guī)范Technical

regulation

for

transmission

viruses

Muscovy

Duck

安徽省市場監(jiān)督管理局

DB34/T

2020前言

DB34/T

2020

檢測技術(shù)規(guī)范

GB

19489實(shí)驗(yàn)室

GB/T

27401

3.1

virus

Muscovy

番鴨傳播統(tǒng)稱鴨甲

（Duck

Hepatitis

Duck

subtypeof

4.1

4.2

4.3

電泳儀，電壓范圍：60～120

V。4.4

4.5

4.6

4.7

水浴鍋，溫控范圍：37℃～100℃。4.8

L，100～1000

L。

DB34/T

2020

5.1

5.2

Trizol。5.3

5.4

GB/T

6682

的要求。5.5

磷酸鹽緩沖液（PBS），見附錄

A.1。5.6

蛋白酶

K（10

A.2。5.7

5.8

5.9

5.1075％乙醇，見附錄

A.3。5.11 乙酸鈉（3

5.4）。5.12 5.13

5.14 TAE

A.4。5.15 10

A.5。5.16

H9-AIV

5.17

AIV

防治技術(shù)規(guī)范》（農(nóng)醫(yī)發(fā)[2007]12

號(hào)）進(jìn)行合成，引物序列及預(yù)期片段大小說明見表

1：

以下所有實(shí)驗(yàn)室操作均按照

GB

19489

27401

DB34/T

2020

選擇孵化過程中的死亡種番鴨胚、晚啄殼種番鴨胚和孵出的

采集的尿囊液經(jīng)

8000

離心

10

min，取上清分裝后，于

-20℃凍存?zhèn)溆?；采集的組織經(jīng)剪碎處理后，與

PBS

按照體積比

1:3

的比例制成組織勻漿液，反復(fù)凍融

次，8000

10

min，取上清分裝后，于

6.3

min。

40

蛋白酶

h。

1.5

mL

min

15

樣品

PCR

50

M）各

L，4

Mixture（各

2.5

37.5

Taq

離心

15

PCR

管底。

將上述反應(yīng)混合液按照以下步驟進(jìn)行

PCR

min；

循環(huán)參數(shù)為

94℃變性50

30

35

s，循環(huán)

35

72℃再延伸

min

結(jié)束。

RFLP

滅菌雙蒸水，2

h。

檢測

混勻

15

DB34/T

2020

15

1.5

mL

滅菌離心管，小心吸取離心上清液

600

15

800

于吸水紙上

20

30

樣品

RT-PCR

PCR

50

28

處理水，5

Taq

反轉(zhuǎn)錄酶，1

L，6

離心

15

s，使反應(yīng)混合液都沉降到

PCR

將上述反應(yīng)混合液按照以下步驟進(jìn)行一步法

RT-PCR

30

PCR

50

30

35s，循環(huán)

35

次；第三步

72℃再延伸

min

6.5

PCR

0.5

DHAV-1

DHAV-1

DHAV-3

B.1）。

MDPV

PCR

EcoR

PCR

180

PCR

641bp（見附錄

B.2

B）。

MDRV

MDRV

DB34/T

2020

N-MDRV

陽性對(duì)照出現(xiàn)約

600

當(dāng)待檢樣品出現(xiàn)約

600

bp

MDRV

B.4）。

H9-AIV

陽性對(duì)照出現(xiàn)約

732

H9-AIV

感染陽性（見附錄

DB34/T

2020 以下試劑配制所用的滅菌雙蒸水水質(zhì)應(yīng)符合

GB/T

6682

成分NaCl 8.0

KCl 0.2

Na2HPO412H22.9

KH2PO40.2

制法將上述試劑溶于

800

mL

滅菌雙蒸水中，定容至

1000

Pa

高壓滅菌

30

蛋白酶K（10

將蛋白酶

K（20

mg/mL）和滅菌水按照體積比

1:1

250

000

A.4

乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH

50

DB34/T

2020

50

A.5

10

DB34/T

2020

見圖B.1。

DB