大豆皮中過氧化物酶的提取

華中農業(yè)大學楚天學院本科畢業(yè)論文（設計）PAGE5目錄摘要 2關鍵詞 2Abstract 3Keywords 3前言 41材料與方法 51.1試驗材料 51.1.1主要儀器及耗材 51.1.2主要試劑 51.1.3原材料 51.2 實驗內容 51.2.1過氧化物酶的提取工藝流程 51.2.2酶活測定 51.2.3放置時間對酶活影響 61.2.4單因素試驗 61.2.5正交試驗 72結果與分析 72.1酶活測定 72.2放置時間對酶活影響 92.3 單因素試驗 92.3.1液料比對酶活的影響 92.3.2提取時間對酶活的影響 102.3.3提取液濃度對酶活的影響 112.3.4提取溫度對酶活的影響 112.3.5提取次數對酶活的影響 123討論 143.1 關于酶活測定方法的思考 143.2 關于酶液稀釋方法的思考 143.3 關于單因素試驗及正交試驗優(yōu)化的思考 143.4 實驗操作注意事項 153.5 本實驗的存在的問題及改進 15參考文獻 15致謝 16大豆皮中過氧化物酶的提取字數不足1萬，還應擴展前言，實驗方法部分要詳盡，讓沒做過這個實驗的也知道怎么做。結果與分析部分應盡可能結合文獻，印證自己的觀點。字數不足1萬，還應擴展前言，實驗方法部分要詳盡，讓沒做過這個實驗的也知道怎么做。結果與分析部分應盡可能結合文獻，印證自己的觀點。摘要過氧化物酶[Peroxidase,POD，ECl.11.1.7(x)]是一類以血紅素為輔基的酶，在生物中廣泛存在，具有多種不同的生物功能，主要催化H2O2和有機過氧化物對多種有機物和無機物的氧化作用。它在蛋白質、多肽、激素、病毒、寄生蟲、生物降解及神經系統等方面都有應用，具有特異性強，靈敏度高等優(yōu)點。描述性的話放在前言中，摘要只寫論文中的核心內容，就算有描述的話也應盡量簡潔。本課題以大豆皮為原料，對大豆皮中提取過氧化物酶的工藝進行研究。通過單因素試驗考察不同液料比、提取時間、提取溫度、提取次數、提取液體積等對酶活的影響，并選取單因素試驗中影響最明顯的3個因素進行正交試驗。結果顯示，液料比、提取時間、提取溫度這三個因素對提取效果明顯。然后對此三因素進行正交試驗結果顯示：液料比20ml/g，提取時間5h，提取溫度40℃下，提取效果很好。雖然正交驗證試驗不是最好的一組，但考慮到誤差存在，可視為最適組合。描述性的話放在前言中，摘要只寫論文中的核心內容，就算有描述的話也應盡量簡潔。關鍵詞大豆皮，過氧化物酶，提取Table1-1PBSpreparationxyPHxyPH6.58.010.012.315.018.522.526.531.537.543.549.093.592.090.087.785.081.577.573.568.562.556.551.05.75.85.96.06.16.26.36.46.56.66.76.855.061.067.072.077.081.084.087.089.591.593.094.745.039.033.028.023.019.016.013.010.58.57.05.36.97.07.17.27.37.47.57.67.77.87.98.0其余不同濃度磷酸緩沖液（PBS）皆可由0.2mol/LPBS稀釋至需要濃度。1.2.2.3測定方法：首先先將提取的酶液稀釋到合適的倍數，之后取兩支干凈的試管，加入反應混合液（PH7.00.02mol/LPBS緩沖液，愈創(chuàng)木酚，過氧化氫），配方(見表1-2)：表1-2反應物混合表Table1-2Thereactionmixture編號磷酸緩沖液(ml)2％過氧化氫(ml)4%愈創(chuàng)木酚溶液(ml)蒸餾水/酶液(ml)OD470nmCK2.91.01.00.1調零測定管2.91.01.00.1？加入反應液后，先將試管置于15℃水浴鍋中預熱10min，用移液槍吸取酶液，加入到試管中計時，前45s在水浴鍋中預熱，之后將試管中液體轉移至比色皿中，立即放置于分光光度計中，記錄1min的吸光值，此后每半分鐘幾次一次吸光值，直到吸光值的變化減弱時即可結束實驗。以吸光值(A)為縱坐標，以時間（t）為橫坐標，即可得到酶促反應的速度曲線，根據公式可算得酶活。再根據換算可算出比活。以lg大豆皮提取的總酶活為指標，根據換算可算出比活。，0.1為酶液的添加量。1.2.3放置時間對酶活影響取同一酶液，測定放置不同時間（放置的溫度條件？1h～6h）后的酶活，作出放置時間對酶活影響的曲線，確定單因素試驗中的提取方案。放置的溫度條件？1.2.4單因素試驗以lg大豆皮提取的總酶活為指標，選定液料比、提取溫度、提取時間、提取液濃度、提取次數為考察因素進行單因素試驗。1.2.4.1液料比對酶活的影響準確稱取粉碎后大豆皮0.5g于50mL三角瓶中，加入濃度為0.02mol/LPH7.0緩沖液，常溫下提取4h，平行一組，液料比分別為：10mL/g、15mL/g、20mL/g、25mL/g、30mL/g，提取完畢后轉移至離心管中離心10min后測定其酶活，作圖研究曲線。1.2.4.2提取時間對酶活的影響準確稱取粉碎后大豆皮0.5g于50mL三角瓶中，加入濃度為0.04mol/LPH7.0的PBS緩沖液10mL，常溫下提取，平行一組，提取時間分別為3h、4h、5h、6h，7h，提取完畢后轉移至離心管中離心10min后測定其酶活，作圖研究曲線。1.2.4.3提取液濃度對酶活的影響準確稱取粉碎后大豆皮0.5g于50mL三角瓶中，加入不同濃度濃度的PBS緩沖液10mL，常溫下，提取時間為5h，平行一組，緩沖液濃度：0.01mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L，提取完畢后轉移至離心管中離心后10min測定其酶活，作圖研究曲線。1.2.4.4提取溫度對酶活的影響準確稱取粉碎后大豆皮0.5g于50mL三角瓶中，加入濃度為0.02mol/LPH7.0緩沖液10mL，封上封口膜，作好水位線，提取5h，平行一組，提取溫度為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，提取完畢后，加蒸餾水至水位線，再轉移至離心管中離心10min后測定其酶活，作圖研究曲線。1.2.4.5提取次數對酶活的影響準確稱取粉碎后大豆皮0.5g于50mL離心管中，加入濃度為0.04mol/LPH7.0的PBS緩沖液10mL，常溫下提取5h，平行一組，采取不同的提取次數，如1、2、3、4、5等。提取完畢后離心10min測定其酶活，作圖研究曲線。1.2.5正交試驗1.2.5.1正交試驗的設計對本試驗進行分析，影響提取效果的因素很多，例如液料比、提取溫度、提取液濃度、提取時間、提取時間等。從中選取單因素試驗中影響最明顯的3個因素，分別記為A、B、C，進行三因素正交試驗，每個因素均取三個水平。利用正交表L9(33)安排試驗。為了減少誤差干擾，9組試驗全部平行一組。其它條件為單因素最佳條件。1.2.5.2正交試驗結果的驗證本試驗為3因素3水平的試驗，按試驗要求，須進行33=27種組合的試驗。而按L9(33)正交表按排試驗，只需作9次試驗。為了保證正交試驗結果的可靠性，從9個正交試驗組合中，選取提取效果最好的試驗（記為試驗A）與正交試驗所得出的理論最優(yōu)水平組合（記為試驗B），然后將兩者的優(yōu)劣進行對比，驗證正交試驗結果是否可靠。2結果與分析2.1酶活測定酶液稀釋合適的倍數（25倍），加入反應液中，置于吸光光度計中，記錄數據。表2-1吸光度隨時間的變化Table2-1Thechangeinabsorbancewithtime011.522.533.544.5500.070.1230.1820.2440.3070.3630.4150.4640.5085.566.577.588.599.5100.5490.5820.6140.6430.6660.6890.7070.7220.7330.743表中數值是什么值？應有文字說明。圖2-1-1酶促反應的速度曲線表中數值是什么值？應有文字說明。Fig2-1-1Velocitycurveofenzymaticreaction圖不要邊框，坐標單位要標明圖不要邊框，坐標單位要標明圖2-1-1＊每分鐘下酶液顏色的變化Fig.2-1-1＊Eachminuteofenzymesolutioncolorchange根據酶催化反應速度曲線，能夠真正代表酶活性大小的是線性期的酶促反應速度，即酶促反應初速度。酶活性測定時首先要確定線性期，在此期測定反應速度才能準確代表酶活性。酶剛開始參加反應時，速度比較慢，隨著反應的進行，速度加快，一般在底物濃度足夠的條件下，酶在催化反應中會達到最大反應速度，保持一定時間后，速度又會慢慢變小，其原因主要為底物減少和酶在反應過程中自身失活，最大反應速度持續(xù)時間的多少與酶本身的特性有關。由此可見，線性期應選擇1.5min—3min，以此區(qū)域內的點，作出直線，進而求得斜率，就可以得到酶活及比活。圖2-1-2線性期的反應曲線Fig2-1-2Thelinearphaseresponsecurve由圖可知，此圖線的R2為0.9998；當R2>0.99時，則可以認為這些點位于一條直線上。斜率為0.1228，進而可以計算出酶活和比活。酶活=0.1228*25/0.01=307U比活=（307*10）/（0.5*0.1）=61400U/g2.2放置時間對酶活影響選取某次實驗剩余酶液，稀釋合適的倍數（20倍），測定同一酶液在常溫下放置不同時間段下的酶活。表2-2放置時間對比活影響Table2-2Theplacetimeeffectonenzymeactivity建議增加相對活力，更直觀的表現出來時間（h）建議增加相對活力，更直觀的表現出來01246比活（U/g）4496042800400003520031040圖2-2放置時間對比活影響Fig2-2Theplacetimeeffectonenzymeactivity由圖可知。比活隨時間的變化大致成線性關系，且每小時下降2300左右各單位。因此，后續(xù)的提取工作，均需要錯開時間段進行提取，時間間隔為半小時。應分析酶比活下降的原因，提取完成后酶活測定時間應如何確定？應分析酶比活下降的原因，提取完成后酶活測定時間應如何確定？單因素試驗2.3.1液料比對酶活的影響表2-3-1液料比對酶活的影響Table2-3-1Liquidratioofenzymeactivity液料比(mL/g)1015202530比活（U/g）5468459475652405476038115圖2-3-1液料比對酶活的影響Fig2-3-1Liquidratioofenzymeactivity所有的圖的標題及英文對照都要放到圖下方所有的圖的標題及英文對照都要放到圖下方由圖可知，隨著液料比的增大，提取酶的活力是增大的，當液料比達到20mL/g時，酶的活力達到最大，隨著液料比的繼續(xù)增加，酶的活力反而有所下降。因此，采用液料比為20mL/g較適宜。2.3.2提取時間對酶活的影響表2-3-2提取時間對酶活的影響Table2-3-2Effectofextractiontimeonenzymeactivity時間（h）34567比活（U/g）5025056850580005380046950圖2-3-2提取時間對酶活的影響Fig2-3-2Effectofextractiontimeonenzymeactivity由圖可知，隨著提取時間的增長，酶的活力升高，5h時達到最大，5h后酶活反而下降。其原因可能是酶溶解的量隨著時間的增加而增加，5h時溶解量達到最大，隨著時間的繼續(xù)增加酶可能會失活或者分解，此時溶出量小于失活或分解的量，所以酶的活力下降。因此，采用提取時間5h較為適宜。2.3.3提取液濃度對酶活的影響表2-3-3提取液濃度對酶活的影響Table2-3-3Effectofextractconcentrationonenzymeactivity提取液濃度(mol/L)0.010.020.030.040.05比活(U/g)5560056850591006365057175圖2-3-3提取液濃度對酶活的影響Fig2-3-3Effectofextractconcentrationonenzymeactivity由圖可知，隨著提取液濃度的升高酶活力增加，在0.04mol/L時達到最大，隨著濃度的繼續(xù)升高，酶活力下降。因此，采用提取液濃度為0.04mol/L比較為適宜。2.3.4提取溫度對酶活的影響表2-3-4提取溫度對酶活的影響Table2-3-4Effectofextractiontemperatureonenzymeactivity溫度（℃）2030405060比活（U/g）6315076860642605505048150圖2-3-4提取溫度對酶活的影響Fig2-3-4Effectofextractiontemperatureonenzymeactivity由圖可知，隨著溫度的升高酶的活力不斷增加看不出來。當提取溫度達到30℃以后，酶活力驟降。其原因可能是隨著溫度升高酶的溶解性升高，但是超過30℃以后，高溫使得酶失活，所以酶的活力驟降。因此，采用30℃為提取適宜溫度?？床怀鰜?.3.5提取次數對酶活的影響表2-3-5提取次數對酶活的影響Table2-3-5Effectofextractingtimesonenzymeactivity提取次數12345比活（U/g）447202968058722784956圖2-3-5提取次數對酶活的影響Fig2-3-5Effectofextractingtimesonenzymeactivity由圖可知，提取第2次后，還有3萬左右的比活，到第3次卻只有6千比活，因此最適提取次數應取2次；但是提取次數增加勢必會延長實驗時間，增加實驗量，在本實驗中不適用，故提取次數仍用1次。正交試驗試驗結果分析：本實驗目的是研究過氧化物酶的最適提取條件，以提高酶的提取率，是以酶活作為檢測指標的。根據單因素結果可知，液料比、提取溫度、提取時間對提取效果影響較大，因此選用這3個因素進行3因素3水平的正交試驗，其他因素皆選用最適條件：提取液濃度（0.04mol/L）、提取次數（1次）。正交試驗完畢后，再根據實驗結果進行極差分析，確定最優(yōu)組合。表2-4正交試驗極差分析表Table2-4試驗號溫度A(℃)液料比B（mL/g）提取時間C(h)比活123456789K1K2K3k1k2k3極差R主次順序優(yōu)水平優(yōu)組合1（20）1（20）1（20）2（30）2（30）2（30）3（40）3（40）3（40）1（15）2（20）3（25）1（15）2（20）3（25）1（15）2（20）3（25）1（4）2（5）3（6）2（5）3（6）1（4）3（6）1（4）2（5）49680535005100075276562805406369498640806350015418018561919707851393.361872.865692.714299.319445417386016856364818.057953.356187.58630.516782319227617677855940.864092.058926.08151.2A>B>CA3B1C2A3B1C2驗證試驗結果：從9個正交試驗組合中，選取提取效果最好的4號試驗（試驗A）的發(fā)酵條件與正交試驗所得出的理論最優(yōu)水平組合（試驗B）進行試驗，對比兩者的優(yōu)劣，驗證正交試驗結果是否可靠。驗證試驗：A3B1C240倍011.522.533.5400.0820.1360.1970.2570.3170.370.42比活72600A3B1C240倍011.522.533.5400.0820.1430.2080.2720.3320.3960.451比活75600相對誤差0.039比活（平均）74100通過對比發(fā)現試驗B略小于實驗A,考慮到正交試驗有一定的遺漏性以及誤差的存在（實驗誤差小于10%，皆可認為是合理的，數據直接取平均值），可以認為正交試驗結果基本是可靠。因此最適組合應為：提取溫度40℃，液料比15mL/g數值和單位建應空格，“℃”和“%”數值和單位建應空格，“℃”和“%”除外3討論關于酶活測定方法的思考酶活的測定方法有很多，首行縮進常見的有比色法，還原糖法，免疫學法，比濁法等。本實驗是用愈創(chuàng)木酚與過氧化物酶的顯色反應來進行檢測的，屬于比色法。比色法又根據對酶促反應時間的選擇不同分為固定時間法和連續(xù)監(jiān)測法。這兩種方法又有各自的適用條件以及優(yōu)缺點。固定時間法，操作簡單但是難以確定反應時間段酶促反應是否處于線性期。連續(xù)監(jiān)測法，能動態(tài)觀測酶促反應進程，可以明顯地找到反應的線性期，結果準確可靠，標本和試劑用量少，可在較短時間內完成測定。本實驗初期，采用的是固定時間法，實驗過程中卻發(fā)現一個嚴重的問題——反應液的顏色變化無法停止，反應開始時，反應液顏色逐漸加深，反應結束時，反應液顏色又在逐漸褪去，最終變?yōu)闊o色。經過反復思考以及詢問導師的幫助，出現此問題的原因可能是酶促反應的產物不穩(wěn)定，極易分解轉而又生成反應物，使得反應液褪色。此外，固定時間法要確定反應時間段酶促反應是否處于線性期才可以使用，通過后續(xù)實驗，才發(fā)現本實驗反應曲線前期不處于線性期，因此也應該將測定方法改為連續(xù)監(jiān)測法。通過這個問題也可以看出，并不是所有酶促反應都可以用固定時間法進行測定，要在詳細了解反應過程的前提下，選擇合適的測定方法。首行縮進關于酶液稀釋方法的思考本實驗初期采用蒸餾水一步稀釋法，即從原酶液一步稀釋到所需倍數。但是，測定酶活時，發(fā)現平行試驗誤差能達到30%。后經老師指導，平行試驗誤差大的原因可能有兩點：一、蒸餾水的PH偏酸性，可能影響稀釋后的酶活。二、稀釋方法不當，用來稀釋的原酶液不具有代表性。根據以上兩點，對稀釋方法進行改進。其一，酶液稀釋改用PH7.0PBS緩沖液；其二，采用兩步稀釋法，即將要所稀釋的倍數改用該倍數的因數，分兩次進行稀釋，如需要稀釋20倍，則先稀釋5倍，再稀釋4倍。關于單因素試驗及正交試驗優(yōu)化的思考本課題是研究過氧化物酶的提取，影響提取效果的因素很多，如不同液料比、提取時間、提取溫度、提取次數、提取液體積等。試驗中對各因素進行單因素試驗。從單因素試驗結果可以看出，液料比、提取時間、提取溫度這三個因素對酶活的影響最為顯著。相對而言，提取次數，提取液濃度對提取的效果影響不大。因此，最終液料比、提取時間、提取溫度為本試驗的試驗因素，分別記作A、B、C，進行正交試驗，各因素均取三個最優(yōu)水平。通過單因素試驗，從若干單因素中找對提取效果影響最明顯的三個因素進行正交試驗，縮小了試驗范圍，提高了優(yōu)化效率。正交試驗設計就是安排多因素試驗，用部分試驗來代替全面試驗，通過對部分試驗結果的分析，了解全面試驗的情況，尋求最優(yōu)水平組合的一種高效率試驗設計方法。即在單因素測定出的最適初始條件下，分別將單因素的控制量在一定的范圍內進行重新設定組合。本試驗為3因素3水平的試驗，按試驗要求，須進行33=27種組合的試驗。按L9(33)正交表按排試驗，只需作9次試驗，顯然大大減少了工作量，提供了效率，而且對正交試驗結果進行極差分析（見表2-4），可以得到各因素的對本試驗的影響大小，找到各因素的優(yōu)水平組合。試驗中將優(yōu)水平組合與9組正交試驗中的最優(yōu)組進行比較，驗證了優(yōu)水平組合的可靠性。實驗操作注意事項原料選?。涸蠎x擇顆粒較大且飽滿無雜色的黃豆，以便降低因原料差異而對實驗造成的誤差。此外，大豆皮粉碎后，應放置低溫保藏，以減少環(huán)境對過氧化物酶的影響。浸取操作：稱量好的大豆皮粉轉移至三角瓶中，加入PBS緩沖液后，三角瓶內會留有氣泡，影響酶的提取。所以，加入緩沖液后，要輕輕搖晃三角瓶，待瓶中氣泡消除后，即可放置浸取。稀釋操作：酶液稀釋過程中，一定要用槍頭混合均勻，而且取液和混合要分別使用槍頭，不可混合使用，因為毛細現象，會導致用于混合的槍頭會存有少許液體，進而產生誤差。本實驗的存在的問題及改進原料：本次實驗的原料獲取皆為手工勞作，工作量大，產率低，以致于之后實驗都才用0.5g原料提取，容易產生較大的誤差。因此，原料生產應該盡量采用機械化生產，提高產率，提高酶液提取率，降低因原料之間的差異所造成的誤差。提?。禾崛『笏@得的酶液成分復雜，理應進行進一步純化，但是考慮到初始原料少，純化過程中會有進一步的損失，為了避免加大誤差，因此，只得采用粗提取。稀釋：本實驗存在的最大問題就是稀釋倍數對酶活有著顯著的。通過對同一酶液在不同稀釋倍數下的酶活測定，發(fā)現酶活隨稀釋倍數的增加而降低，而且相差值盡然達到一萬數量級。最開始是認為放置時間過長導致酶活降低，但是，通過2.2實驗排除此干擾了。最后經過反復實驗仍不能排除此誤差，因此只能讓不同酶液所測出的吸光值變化盡量在每分鐘0.8～1.2內（線性期階段）變化。測定：酶活測定過程中理應控制環(huán)境溫度，但是由于學校不提供恒溫室，只能利用水浴鍋進行控溫。但是水浴鍋控溫存在著明顯的不足，即從水浴鍋取出酶液后，溫度就會逐漸下降，會影響曲線的變化。但是考慮到水的比熱容較大，溫度降低不會太大，因此或許可以忽略此誤差。參考文獻按照引用格式插入正文中按照引用格式插入正文中