高三一輪復(fù)習(xí)生物基因工程課件

本節(jié)看點(diǎn)1.真原核生物基因結(jié)構(gòu)的差異2.DNA聚合酶與DNA連接酶的區(qū)別與聯(lián)系3.理解同尾酶定義及應(yīng)用01.原理與工具02.基因工程的過(guò)程原核生物的基因

基因非基因基因通常是具有遺傳效應(yīng)的DNA片段翻譯轉(zhuǎn)錄mRNA基因2基因3基因4基因1非編碼區(qū)編碼區(qū)放大基因3原核生物DNA收裁剪&拼接

翻譯收mRNA真核生物DNA基因1基因2基因3基因4

基因

非基因收收

轉(zhuǎn)錄hnRNA放大編碼區(qū)非編碼區(qū)基因3內(nèi)含子1外顯子1內(nèi)含子2外顯子2內(nèi)含子3外顯子3內(nèi)含子4內(nèi)含子外顯子基因3編碼區(qū)放大真核生物的核基因非編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子：

編碼區(qū)上游能與RNA聚合酶結(jié)合并形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體的區(qū)域終止子：

位于編碼區(qū)下游，轉(zhuǎn)錄過(guò)程中能夠終止

RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的DNA序列，使RNA合成終止調(diào)控序列：對(duì)基因表達(dá)起調(diào)控作用的序列的統(tǒng)稱編碼區(qū)非編碼區(qū)調(diào)節(jié)基因操縱基因終止子啟動(dòng)子DNA基本結(jié)構(gòu)3'末端TTCGAA5'末端AAGCTT4

153

25'末端3'末端5'末端3'末端G

C

A

T

A

T

限制性核酸內(nèi)切酶——黏性末端5'

…

A3'

A5'3'

…

TT

C

G

A

5'黏性末端A

A

G

C

TTTTC

G

A

A3'A

G

C

TTA…

3'…

5'…

3'…

5'5'

…3'

…Hind

III5'末端A

A

G

C

T

T

3'末端TTCGAA3'末端5'末端限制性核酸內(nèi)切酶——平末端5'末端G

A

T

A

T

C

3'末端CTATAG5'

…3'

…G

A

T

A

T

CC

T

A

T

A

GEcoR

V…

3'…

5'3'5'平末端5'3'…

3'…

5'A

T

CT

A

GG

A

TC

T

A5'

…3'

…3'末端5'末端限制性核酸內(nèi)切酶限制（性核酸內(nèi)切）酶作用實(shí)質(zhì)斷開(kāi)(水解)磷酸二酯鍵作用于雙鏈作用結(jié)果形成黏性末端或平末端獲取目的基因特點(diǎn)識(shí)別特定序列（回文序列）來(lái)源原核生物（主要）舉例EcoR

I

、Alu

lSam

I

、BamH

I

等DNA連接酶5'

…

G

A

T

A

T

C

…

3'3'

…

C

T

A

T

A

G

…

5'

T4

DNA連接酶5'

…

A

A

G

C

T

T

…

3'3'

…

T

T

C

G

A

A

…

5'T4

DNA連接酶

DNA連接酶……3'5'平末端5'3'…

3'…

5'3'A

G

C

TT3'

A…

A…

TT

C

G

AA

T

CT

A

GG

A

TC

T

AA5'5'黏性末端…

3'…

5'ADNA連接酶DNA連接酶作用實(shí)質(zhì)形成磷酸二酯鍵作用于雙鏈作用結(jié)果連接已有DNA片段形成重組DNA舉例T4

DNA連接酶（黏性末端&平末端）E.coliDNA連接酶（黏性末端）注意：DNA聚合酶與DNA連接酶并非同一種酶

DNA聚合酶功能為連接游離的脫氧核糖

核苷酸(即形成單鏈)，形成磷酸二酯鍵同尾酶識(shí)別切割不同的DNA片段但產(chǎn)生相同的黏性末端的一類限制性核酸內(nèi)切酶稱為同尾酶……GC

C

T

A

G……AT

C

T

A

GG

A

T

C

CG……G

A

T

C

TA……BamH

I……A

G

A

T

C

TT

C

T

A

G

AG

G

A

TC

CC

C

T

A

G

G……G

A

T

CC

T

A

………………G

A

T

C

…T

A

A

………

C

T

ASau3A

IBgl

II……同尾酶與二次酶切識(shí)別切割不同的DNA片段但產(chǎn)生相同的黏性末端的一類限制性核酸內(nèi)切酶稱為同尾酶同尾酶切出的序列，由于黏性末端一致，可以連接到一起但重新連接的DNA分子能否被相同的限制酶二次酶切，需要依識(shí)別序列討論BamH

I……G

A

T

C

CG…………G

G

A

TC

CC

C

T

A

G

G……GC

C

T

A

GBgl

II……G

A

T

C

TA………………A

G

A

T

C

TT

C

T

A

G

AAT

C

T

A

GCG連接……GCGCATTATA……4.

在受體細(xì)胞中

自主復(fù)制

或

隨受體細(xì)胞復(fù)制多以質(zhì)粒形式存在多為重組至宿主細(xì)胞染色體上基因工程的載體工具常見(jiàn)載體：質(zhì)粒（小型環(huán)狀DNA分子）、λ噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒注意：質(zhì)粒并非只存在于原核細(xì)胞中，許多真核細(xì)胞(如酵母菌等)中也存在質(zhì)粒1.

適宜的多種限制酶切點(diǎn)(好切)2.

具有標(biāo)記基因

供重組DNA篩選

常為抗性基因3.

具有啟動(dòng)子、終止子

等調(diào)控區(qū)

以受體細(xì)胞中可表達(dá)為準(zhǔn)良好載體的基本要求復(fù)制原點(diǎn)

5.

對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害質(zhì)粒本節(jié)看點(diǎn)1.基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的區(qū)別2.單酶切的弊端與雙酶切的優(yōu)勢(shì)3.表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞的不同方式4.目的基因檢測(cè)的方式及應(yīng)用01.原理與工具02.基因工程的過(guò)程基因工程的步驟復(fù)制原點(diǎn)啟動(dòng)子、終止子目的基因

標(biāo)記基因目的基因的獲取表達(dá)載體的構(gòu)建DNA分子雜交分子雜交抗原-抗體雜交性狀檢測(cè)表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定動(dòng)物：顯微注射法微生物：Ca2+處理，感受態(tài)細(xì)胞基因文庫(kù)法人工合成法基因組文庫(kù)cDNA文庫(kù)反轉(zhuǎn)錄法

化學(xué)合成法植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

基因槍法花粉管通道法PCR技術(shù)（獲取/擴(kuò)增）基因組文庫(kù)基因組DNA用限制性核酸內(nèi)切酶酶切基因組文庫(kù)內(nèi)含完整編碼區(qū)(外顯子

+

內(nèi)含子)所以基因組文庫(kù)不適宜直接導(dǎo)入原核生物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)導(dǎo)入噬菌體進(jìn)行克隆導(dǎo)入細(xì)菌進(jìn)行克隆隨機(jī)大量酶切為多個(gè)片段隨機(jī)大量酶切為多個(gè)片段cDNA文庫(kù)操作文庫(kù)大小基因多寡啟動(dòng)子終止子內(nèi)含子物種間交流基因文庫(kù)酶切?多有有大都不可以cDNA文庫(kù)逆轉(zhuǎn)錄?少??大都可以與基因組文庫(kù)的制作方式不同，

cDNA文庫(kù)提取mRNA作為模板，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA并保存注意：cDNA文庫(kù)DNA分子沒(méi)有啟動(dòng)子、終止子及內(nèi)含子序列，更加適合種間基因交流分別導(dǎo)入

受體細(xì)胞提取mRNA逆轉(zhuǎn)錄+質(zhì)粒增殖mRNAcDNA人工合成人工合成反轉(zhuǎn)

錄

法目的基因的

mRNA雜交雙鏈(單鏈RNA/單鏈DNA)單鏈DNA雙鏈DNA(目的基因)反轉(zhuǎn)錄法的具體操作已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列推測(cè)mRNA的核苷酸序列推測(cè)目的基因的核苷酸序列DNA合成儀

化學(xué)合成目的基因化學(xué)合成法的過(guò)程化學(xué)合成法表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)載體終止子復(fù)制原點(diǎn)

標(biāo)記基因目的基因啟動(dòng)子質(zhì)粒

同一種限制酶

DNA連接酶單酶切及其弊端質(zhì)粒自身環(huán)化×目的基因反接×若只用同一種限制酶處理DNA連接酶處理目的基因正接雙酶切及其優(yōu)勢(shì)DNA連接酶處理目的基因正確連接若用兩種不同的限制酶同時(shí)處理目的基因及質(zhì)粒

分別創(chuàng)造不同的兩側(cè)末端雙酶切：

防止目的基因的反向連接及質(zhì)粒自身環(huán)化現(xiàn)象產(chǎn)生目的基因(表達(dá)載體)導(dǎo)入受體細(xì)胞(植物)注意：雙子葉和裸子植物受到傷害會(huì)產(chǎn)生酚類化合物，吸引農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是受體細(xì)胞為植物細(xì)胞時(shí)最普適的轉(zhuǎn)入方法即使受體細(xì)胞為單子葉植物細(xì)胞，也可以通過(guò)添加酚類物質(zhì)完成轉(zhuǎn)入及表達(dá)受體細(xì)胞為雙子葉植物：

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法受體細(xì)胞為單子葉植物：基因槍法

此外還有花粉管通道法等方法表現(xiàn)出新性狀

的植株含重組Ti質(zhì)粒

的農(nóng)桿菌插入染色體的目的基因DNA植物細(xì)胞表達(dá)載體再生植株培養(yǎng)為農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒T-DNA構(gòu)建轉(zhuǎn)入導(dǎo)入目的基因(表達(dá)載體)導(dǎo)入受體細(xì)胞(動(dòng)物or微生物)顯微注射法注意：若想最終獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，則表達(dá)載體必須直接導(dǎo)入受精卵中43℃;

2minCaCl2處理質(zhì)粒與鈣離子結(jié)合

吸附在細(xì)胞外受體細(xì)胞為微生物細(xì)胞受體細(xì)胞為動(dòng)物細(xì)胞CaCl2轉(zhuǎn)化法質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞正常細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定進(jìn)沒(méi)進(jìn)去是否轉(zhuǎn)錄是否翻譯性狀體現(xiàn)待測(cè)物DNAmRNA蛋白質(zhì)個(gè)體性狀檢測(cè)邏輯目的基因是否存在DNA分子雜交DNA-DNA分子雜交是否出現(xiàn)雜交帶目的基因是否轉(zhuǎn)錄分子雜交DNA-DNA分子雜交是否出現(xiàn)雜交帶目的基因是否翻譯抗原-抗體雜交是否出現(xiàn)雜交帶個(gè)體是否表現(xiàn)性狀抗蟲、抗病抗抗生素等接種實(shí)驗(yàn)是否存活習(xí)題精練苯丙酮尿癥是PKU基因突變引起的，研究人員嘗試用基因治療的方式治療該疾病，即將正?；駾導(dǎo)入到有突變基因的細(xì)胞中。下圖中的圖甲為A

、B

、C三種質(zhì)粒，圖乙為含有目的基因D的DNA片段，圖丙表示重組

載體的示意圖。其中Ap為氨芐青霉素抗性基因，

Tc為四環(huán)素抗性基因，

lacZ為藍(lán)色顯色基因(基因表達(dá)的產(chǎn)

物將無(wú)色化合物X-gal轉(zhuǎn)化為一種藍(lán)色物質(zhì)，菌落呈藍(lán)色)，

EcoRI(0.7kb)

、PvuI(0.8kb)等為限制酶及其切割

位點(diǎn)與復(fù)制原點(diǎn)之間的距離。已知1kb=1000堿基對(duì)，請(qǐng)結(jié)合所學(xué)知識(shí)回答：(1)將正常的D基因?qū)胧荏w細(xì)胞的基因工程操作步驟中，其核心是

,據(jù)圖分析上述甲圖中三種質(zhì)粒中不宜作為運(yùn)載體的有

，請(qǐng)分析原因

習(xí)題精練苯丙酮尿癥是PKU基因突變引起的，研究人員嘗試用基因治療的方式治療該疾病，即將正?；駾導(dǎo)入到有突變基因的細(xì)胞中。下圖中的圖甲為A

、B

、C三種質(zhì)粒，圖乙為含有目的基因D的DNA片段，圖丙表示重組

載體的示意圖。其中Ap為氨芐青霉素抗性基因，

Tc為四環(huán)素抗性基因，

lacZ為藍(lán)色顯色基因(基因表達(dá)的產(chǎn)

物將無(wú)色化合物X-gal轉(zhuǎn)化為一種藍(lán)色物質(zhì)，菌落呈藍(lán)色)，

EcoRI(0.7kb)

、PvuI(0.8kb)等為限制酶及其切割

位點(diǎn)與復(fù)制原點(diǎn)之間的距離。已知1kb=1000堿基對(duì)，請(qǐng)結(jié)合所學(xué)知識(shí)回答：(2)若要獲取目的基因D，上述乙圖中應(yīng)選擇限制酶

對(duì)其所在的DNA進(jìn)行切割，如果僅知道D基因首位的部分核苷酸序列，通常可根據(jù)該基因首位兩端的已知核苷酸序列合成

,利用

技術(shù)得到大量的目的基因習(xí)題精練苯丙酮尿癥是PKU基因突變引起的，研究人員嘗試用基因治療的方式治療該疾病，即將正常基因D導(dǎo)入到有突變基因的細(xì)胞中。下圖中的圖甲為A

、B

、C三種質(zhì)粒，圖乙為含有目的基因D的DNA片段，圖丙表示重組

載體的示意圖。其中Ap為氨芐青霉素抗性基因，

Tc為四環(huán)素抗性基因，

lacZ為藍(lán)色顯色基因(基因表達(dá)的產(chǎn)

物將無(wú)色化合物X-gal轉(zhuǎn)化為一種藍(lán)色物質(zhì)，菌落呈藍(lán)色)，

EcoRI(0.7kb)

、PvuI(0.8kb)等為限制酶及其切割

位點(diǎn)與復(fù)制原點(diǎn)之間的距離。已知1kb=1000堿基對(duì)，請(qǐng)結(jié)合所學(xué)知識(shí)回答：(3)將目的基因D和甲圖中可做載體的質(zhì)粒進(jìn)行連接后，會(huì)得到圖丙中三種連接方式。需要選出正向連接的重組質(zhì)粒，可使用

酶切割所獲得的重組質(zhì)粒。完全酶切后進(jìn)行電泳分析。若是載體自連，電泳圖譜

中出現(xiàn)2.7kb一條帶，若是正向連接載體和反向連接載體，電泳圖譜中出現(xiàn)長(zhǎng)度分別為

和

.習(xí)題精練苯丙酮尿癥是PKU基因突變引起的，研究人員嘗試用基因治療的方式治療該疾病，即將正?；駾導(dǎo)入到有突變基因的細(xì)胞中。下圖中的圖甲為A

、B

、C三種質(zhì)粒，圖乙為含有目的基因D的DNA片段，圖丙表示重組

載體的示意圖。其中Ap為氨芐青霉素抗性基因，

Tc為四環(huán)素抗性基因，

lacZ為藍(lán)色顯色基因(基因表達(dá)的產(chǎn)

物將無(wú)色化合物X-gal轉(zhuǎn)化為一種藍(lán)色物質(zhì)，菌落呈藍(lán)色)，

EcoRI(0.7kb)

、PvuI(0.8kb)等為限制酶及其切割

位點(diǎn)與復(fù)制原點(diǎn)之間的距離。已知1kb=1000堿基對(duì)，請(qǐng)結(jié)合所學(xué)知識(shí)回答：(4)選擇自身不含lacZ基因且對(duì)抗生素敏感的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，在已轉(zhuǎn)化的含重組質(zhì)粒、空質(zhì)粒的受體細(xì)胞中和未轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞中如何篩選出成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞性狀檢測(cè)——雙標(biāo)記問(wèn)題在真實(shí)的基因工程相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，若表達(dá)載體上只有一個(gè)標(biāo)記基因(如抗性基因)，則通過(guò)含抗生素培養(yǎng)基篩選后所得菌落有兩種可能，其一為含有完整表達(dá)載體，其二為只含有空質(zhì)粒，內(nèi)部并沒(méi)有目的基因存在。因此在實(shí)際操作中常使用雙抗性標(biāo)記，以平板影印法輔助鑒定完成基因工程操作進(jìn)行目的基因檢測(cè)含四環(huán)素培養(yǎng)基四環(huán)素抗性基因目的基因啟動(dòng)子Tetr復(fù)制原點(diǎn)

表達(dá)載體終止子性狀檢測(cè)——雙標(biāo)記問(wèn)題在真實(shí)的基因工程相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，若表達(dá)載體上只有一個(gè)標(biāo)記基因(如抗性基因)，則通過(guò)含抗生素培養(yǎng)基篩選后所得菌落有兩種可能，其一為含有完整表達(dá)載體，其二為只含有空質(zhì)粒，內(nèi)部并沒(méi)有目的基因存在。因此在實(shí)際操作中常使用雙抗性標(biāo)記，以平板影印法輔助鑒定Pst

I酶切位點(diǎn)1472583691458369Tetr四環(huán)素抗性基因Ampr青霉素抗性基因完成基因工程操作進(jìn)行目的基因檢測(cè)含四環(huán)素培養(yǎng)基含青霉素培養(yǎng)基沾取菌落無(wú)菌絨布習(xí)題精練(1)獲取目的基因的方法很多，上圖是利用人生長(zhǎng)激素mRNA

。而在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)必須使用的酶是

和

。⑤過(guò)程要用CaCl2處理大腸桿菌，目的是

。(2)如果限制性內(nèi)切晦Pst

l

、EcoR

l和Hind

lll對(duì)質(zhì)粒pBR322進(jìn)行切割，用兩種晦、三種晦分別切割時(shí)，則形

成的DNA片段共

種，其中含有完整四環(huán)素抗性基因的DNA片段的所占比例是

。習(xí)題精練(3)如果只用限制性內(nèi)切酶Pst

I切割目的基因和質(zhì)粒pBR322，完成過(guò)程

④、⑤后，將三角瓶?jī)?nèi)的大腸桿菌（不含Ampr

、Tetr抗性質(zhì)粒）先接種到甲培養(yǎng)基上，形成菌落后用無(wú)菌牙簽挑取甲上的單個(gè)菌落，分別接種到乙和丙兩個(gè)培養(yǎng)基的相同位置上，一段時(shí)間后，菌落的生長(zhǎng)狀況如圖所示。能在乙培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的大腸桿菌是含有

抗性基因，含有目的基因的大腸桿菌應(yīng)該在

（填“乙培養(yǎng)基”、“丙培養(yǎng)基”）性狀檢測(cè)——“藍(lán)白斑”(報(bào)告基因)問(wèn)題已知：lacZt編碼Z酶氨基端的一個(gè)片段(稱為α-肽)α-肽、缺失α-肽的Z酶片段單獨(dú)存在時(shí)均無(wú)Z酶活性，共同存在時(shí)

就會(huì)表現(xiàn)出Z酶活性底物X-gal正常大腸桿菌

表達(dá)Z酶水解為藍(lán)色物質(zhì)所謂“報(bào)告基因”是指一類在細(xì)胞、組織/器官或個(gè)體處于特定情況下會(huì)表達(dá)并使得他們產(chǎn)生易于檢測(cè)、且實(shí)驗(yàn)材料原本不會(huì)產(chǎn)生的性狀的基因Sal

I酶切位點(diǎn)lacZt

基因報(bào)告基因青霉素抗性基因性狀檢測(cè)——“藍(lán)白斑”(報(bào)告基因)問(wèn)題所謂“報(bào)告基因”是指一類在細(xì)胞、組織/器官或個(gè)體處于特定情況下會(huì)表