輔助保護(hù)胃粘膜檢驗(yàn)方法

輔助保護(hù)胃粘膜檢驗(yàn)方法1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.1原理在一定時(shí)間內(nèi)給予一定量的受試樣品，用對(duì)胃粘膜有損傷作用的物質(zhì)造成急性胃粘膜損傷模型，觀察各劑量組胃粘膜的損傷程度；或用對(duì)胃粘膜有損傷作用的物質(zhì)造成慢性胃潰瘍模型，在一定時(shí)間內(nèi)給予一定量的受試樣品，觀察各劑量組胃潰瘍的面積和體積，反映受試樣品對(duì)胃粘膜的輔助保護(hù)作用。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用SD或Wistar健康大鼠，單一性別，180－220克，每組8－12只。1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及劑量分組受試物設(shè)三個(gè)劑量組，其中一個(gè)應(yīng)為人體推薦量的5倍劑量組，并同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組。不同的損傷模型，還應(yīng)設(shè)置相應(yīng)的模型對(duì)照組。慢性潰瘍模型應(yīng)先造模，手術(shù)次日再分組。受試樣品給予時(shí)間一般為14—30天，必要時(shí)可以延長(zhǎng)至45天。1.4胃粘膜損傷模型1.4.1急性胃粘膜損傷無(wú)水乙醇模型1.4.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用Wistar或SD健康大鼠，單一性別。1.4.1.2實(shí)驗(yàn)試劑及器材：無(wú)水乙醇、甲醛、解剖器械、游標(biāo)卡尺、病理制片系統(tǒng)、顯微鏡等。1.4.1.3實(shí)驗(yàn)方法：動(dòng)物隨機(jī)分空白對(duì)照組、模型組和受試樣品三個(gè)劑量組。各劑量組灌胃樣品30天后，全部動(dòng)物嚴(yán)格禁食24小時(shí)（不禁水此期間亦禁止給予受試物。除空白對(duì)照外，所有試驗(yàn)組動(dòng)物給予無(wú)水乙醇1.0mL/只，1小時(shí)后處死動(dòng)物，暴露完整胃，結(jié)扎幽門，灌注適量10%福爾馬林溶液，固定20min，然后沿胃大彎剪開(kāi)，洗凈胃內(nèi)容物，展開(kāi)胃粘膜，在體視解剖顯微鏡下或肉眼下用游標(biāo)卡尺測(cè)量出血點(diǎn)或出血帶的長(zhǎng)度和寬度。因?qū)挾人頁(yè)p傷的嚴(yán)重性遠(yuǎn)較長(zhǎng)度大，故雙倍積分。其評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。表1急性無(wú)水乙醇損傷大體觀察評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)損傷程度2分4分出血點(diǎn)---出血帶長(zhǎng)度1－5mm6－10mm10－15mm>15mm出血帶寬度1－2mm>2mm--總積分=出血點(diǎn)分值+長(zhǎng)度分值+（寬度分值根2）觀察指標(biāo)：各實(shí)驗(yàn)組胃粘膜損傷程度以損傷發(fā)生率（%）、損傷積分指數(shù)和損傷抑制率（%）表示。損傷發(fā)生率（%）=某組出現(xiàn)出血或潰瘍的大鼠數(shù)量／該組大鼠數(shù)量×100%；損傷積分指數(shù)=組損傷評(píng)分總和/組動(dòng)物數(shù)量；損傷抑制率（%）=(A-B)/A根100%（A、B分別為模型組與試驗(yàn)組的損傷積分）。組織病理學(xué)觀察及評(píng)分：大體檢查完畢，將每只動(dòng)物胃粘膜損傷最嚴(yán)重的部位切下，固定于10%甲醛溶液，常規(guī)制片，HE染色，鏡下觀察。注意選擇胃粘膜正橫切面，包括粘膜全層的區(qū)域觀察。評(píng)分方法：以充血、出血、粘膜細(xì)胞變性壞死在整個(gè)粘膜上皮層的累及程度分為5級(jí)。充血權(quán)重為1，出血權(quán)重為2，上皮細(xì)胞變性壞死權(quán)重為3，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)及病變總積分公式見(jiàn)表2。表2急性胃粘膜損傷組織病理學(xué)檢查評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)病變2分4分充血1/5－2/52/5－3/53/5－4/5上皮全層1/5－2/52/5－3/53/5－4/5上皮全層上皮細(xì)胞變性壞死1/5－2/52/5－3/53/5－4/5上皮全層病變總積分=充血積分+出血積分根2+上皮細(xì)胞變性壞死積分根31.4.2急性胃粘膜損傷消炎痛模型1.4.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用Wistar或SD健康大鼠，單一性別。1.4.2.2實(shí)驗(yàn)試劑及器械：消炎痛、甲醛、解剖器械、游標(biāo)卡尺、病理制片系統(tǒng)、顯微鏡等。1.4.2.3實(shí)驗(yàn)方法：動(dòng)物隨機(jī)分空白對(duì)照組、模型組和受試樣品三個(gè)劑量組，灌胃給予動(dòng)物受試物30天后，禁食不禁水24小時(shí)，模型組和劑量組給予消炎痛40mg/kg一次性腹腔注射。5小時(shí)后處死動(dòng)物，剖腹將胃取出，結(jié)扎幽門和賁門，從十二指腸與幽門部結(jié)合處注入10%甲醛溶液5mL，固定20分鐘后，沿胃大彎剪開(kāi)，洗凈胃內(nèi)容物，展開(kāi)胃粘膜，用紙吸干，觀察胃粘膜損傷程度。用游標(biāo)卡尺測(cè)量胃出血或潰瘍的最大長(zhǎng)度及寬度，以出血或潰瘍的最大長(zhǎng)寬徑作為損傷指標(biāo)評(píng)分。消炎痛所致胃粘膜損傷的潰瘍一般較小，肉眼觀查以點(diǎn)狀多見(jiàn)，其評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表3。表3急性胃粘膜損傷消炎痛模型大體觀察評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)損傷形態(tài)2分4分出血點(diǎn)---出血帶長(zhǎng)度1－2mm2－4mm4－6mm>6mm出血帶寬度1－2mm>2mm--總積分=出血點(diǎn)分值+長(zhǎng)度分值+（寬度分值根2）注：長(zhǎng)度和寬度均以最大徑計(jì)。觀察指標(biāo)：各實(shí)驗(yàn)組胃粘膜損傷程度以損傷發(fā)生率（%）、損傷指數(shù)和損傷抑制率（%）表示。損傷發(fā)生率（%）=某組出現(xiàn)出血或潰瘍的大鼠數(shù)量／該組大鼠數(shù)量×100%；損傷指數(shù)=組損傷評(píng)分總和／組動(dòng)物數(shù)量；損傷抑制率（%）=(A-B)/A根100%（A、B分別為模型組與試驗(yàn)組的損傷積分）組織病理學(xué)觀察及評(píng)分：同急性胃粘膜損傷無(wú)水乙醇模型。1.4.3慢性胃潰瘍模型1.4.3.1動(dòng)物：選用Wistar或SD健康大鼠，單一性別。1.4.3.2實(shí)驗(yàn)試劑及器材：冰醋酸、解剖鏡、微量注射器等。1.4.3.3實(shí)驗(yàn)方法：1.4.3.3.1醋酸注射法：將動(dòng)物禁食不禁水24小時(shí)，乙醚或水合氯醛或戊巴比妥鈉麻醉后，消毒腹部，于劍突下切開(kāi)腹腔，將胃輕拉出腹腔外，用微量注射器于胃幽門處漿膜下注射20－30μL的30%冰醋酸，縫合切口，術(shù)后正常喂食和水。第二天將手術(shù)后狀態(tài)良好的動(dòng)物按體重隨機(jī)分為模型組和受試樣品三個(gè)劑量組。各劑量組按相應(yīng)劑量灌胃，連續(xù)14天。模型組灌胃蒸餾水或溶劑。禁食24小時(shí)后處死，取出整個(gè)胃浸泡于10%的福爾馬林溶液內(nèi)，浸泡20分鐘后沿胃大彎剪開(kāi)，洗凈內(nèi)容物，取腺胃區(qū)展開(kāi)平鋪于玻璃板上，用紙吸干潰瘍內(nèi)的水分，測(cè)量其面積和體積。潰瘍面積和體積測(cè)量法：于帶標(biāo)尺的解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)潰瘍所占的方格數(shù)，換算成面積。然后用微量注射器將有色墨水注入潰瘍內(nèi)，將潰瘍填滿與周邊平齊，讀取微量注射器上刻度即為潰瘍的體積。1.4.3.3.2冰醋酸浸漬法：將動(dòng)物禁食不禁水24小時(shí)，乙醚、異氟烷、巴比妥鈉或水合氯醛麻醉后實(shí)施剖腹手術(shù)，消毒腹部，于劍突下切開(kāi)腹腔，將牛津杯（內(nèi)徑5mm、長(zhǎng)10mm）垂直放置胃體部粘膜上，向管腔加入冰醋酸0.2mL，1.5分鐘后用棉簽蘸出冰醋酸，縫合手術(shù)切口，術(shù)后正常喂食和水，第二天將手術(shù)后狀態(tài)良好的動(dòng)物按體重隨機(jī)分組、給藥，動(dòng)物處置和測(cè)量等操作同上。1.5數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定數(shù)據(jù)可用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性。F值≥F0.05，即P≤0.05，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。受試物一個(gè)或一個(gè)以上劑量組與模型對(duì)照組比較，急性胃粘膜損傷模型大體觀察評(píng)分或大體觀察評(píng)分與病理組織學(xué)檢查評(píng)分顯著降低，慢性胃潰瘍模型的潰瘍面積和/或體積顯著減小，表明胃粘膜損傷明顯改善，可判定該受試樣品動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。1.6注意事項(xiàng)動(dòng)物禁食應(yīng)完全，應(yīng)嚴(yán)格控制動(dòng)物禁食期間食糞便、皮毛、墊料等。2人體試食試驗(yàn)2.1受試者的選擇標(biāo)準(zhǔn)2.1.1納入受試者標(biāo)準(zhǔn)：符合慢性淺表性胃炎診斷標(biāo)準(zhǔn)且經(jīng)胃鏡篩選確診為胃粘膜損傷的自愿受試者。2.1.2慢性淺表性胃炎診斷標(biāo)準(zhǔn)：病程遷延，有不同程度的消化不良、上腹痛、燒心、噯氣、反酸、腹脹等臨床癥狀，可有上腹部輕度壓痛。符合慢性淺表性胃炎纖維胃鏡診斷標(biāo)準(zhǔn)及活體組織檢查診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除胃潰瘍患者。2.1.3排除受試者標(biāo)準(zhǔn)：2.1.3.1年齡在18歲以下或65歲以上，妊娠或哺乳期婦女，過(guò)敏體質(zhì)及對(duì)本樣品過(guò)敏者。2.1.3.2繼發(fā)性慢性胃炎。2.1.3.3合并有心血管、腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)嚴(yán)重疾病，精神病患者。2.1.3.4經(jīng)常用藥、嗜酒、吸煙，4周內(nèi)參加過(guò)其它實(shí)驗(yàn)。2.1.3.53個(gè)月內(nèi)用過(guò)已知對(duì)胃腸功能有損害的藥物。2.1.3.6癥狀、體征分級(jí)為重癥者。2.1.3.7有嚴(yán)重消化系統(tǒng)潰瘍的病人。2.1.3.8正在服用其它治療藥物或接受其它治療者。2.1.3.9未按規(guī)定服用樣品，無(wú)法判斷功效，或資料不全等影響功效或安全性判斷者。2.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)及服樣期限采用組間和自身兩種對(duì)照設(shè)計(jì)。按受試者的癥狀輕重隨機(jī)分為試食組和對(duì)照組，盡可能考慮影響結(jié)果的主要因素如年齡、性別、病程等，進(jìn)行均衡性檢驗(yàn)，以保證組間的可比性。每組受試者不少于50例。2.3受試樣品的劑量和使用方法試食組按推薦服用方法、服用量服用受試產(chǎn)品，在試驗(yàn)期間停用其它用于慢性胃病的物品，對(duì)照組服用安慰劑。按雙盲法進(jìn)行試食試驗(yàn)。觀察時(shí)間不少于30天，必要時(shí)可延長(zhǎng)至45天。試驗(yàn)期間不改變?cè)瓉?lái)的飲食習(xí)慣，正常飲食。2.4觀察指標(biāo)2.4.1安全性指標(biāo)2.4.1.1一般狀況：包括精神、睡眠、飲食、大小便、血壓等2.4.1.2血、尿、便常規(guī)檢查2.4.1.3肝、腎功能檢查2.4.1.4胸片、心電圖、腹部B超檢查（僅在試驗(yàn)開(kāi)始前檢查一次）2.4.2功效指標(biāo)2.4.2.1癥狀觀察胃痛、噯氣、反酸、腹脹、食欲不振、少食等臨床癥狀。體征觀察劍突下壓痛程度。按癥狀輕重統(tǒng)計(jì)積分（重癥3分，中度2分，輕度1分見(jiàn)表4。表4人體試食試驗(yàn)癥狀輕重分級(jí)表癥狀輕（1分）中（2分）重（3分）輕微，持續(xù)時(shí)間短，不影響工作及休息疼痛時(shí)間較長(zhǎng)，每日超4小時(shí)，尚能忍受，但對(duì)工作及休息有一定影響疼痛較重，持續(xù)難忍，需服藥才能減輕偶有發(fā)作經(jīng)常發(fā)作，引及兩脅不適頻繁發(fā)作，引及兩脅疼痛反酸偶有吐酸飲食不適即吐酸頻繁吐酸腹脹腹脹輕微，時(shí)作時(shí)止，在短時(shí)間內(nèi)可較甚腹脹較甚或發(fā)作頻繁，在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)不緩解，影響工作及休息腹脹難忍，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，需服藥才能減輕少食食欲較差，飯量減少飯量減少1/2－2/3無(wú)食欲，飯量減少2/3以上2.4.2.2胃鏡檢查與體征觀察劍突下壓痛程度檢查，根據(jù)疼痛程度分為輕（1分）、中（2分）、重（3分）。輕度：用力時(shí)才出現(xiàn)疼痛，壓痛輕微1分中度：用力即出現(xiàn)疼痛，但疼痛尚能忍受，壓痛明顯2分重癥：稍微用力即出現(xiàn)疼痛，疼痛不能忍受，壓痛劇烈3分隨機(jī)選擇試食組和對(duì)照組各15例受試者進(jìn)行胃鏡檢查，比較試食試驗(yàn)前后的改變。2.5數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定統(tǒng)計(jì)癥狀和體征積分值。試驗(yàn)數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，可用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。凡自身對(duì)