動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的生物學(xué)知識課件

細(xì)胞工程云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院林潔主講linjie@組成人及哺乳類動(dòng)物機(jī)體的細(xì)胞具有極其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能，細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)生長時(shí)相互依賴、相互制約，在神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)下形成了一種天然的內(nèi)環(huán)境，體外生長時(shí)脫離了這些內(nèi)平衡系統(tǒng)，與機(jī)體內(nèi)細(xì)胞相比不完全相同。細(xì)胞體外生長時(shí)，有其特有的生長類型、特點(diǎn)、過程和所需的生長條件。第三章

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的生物學(xué)知識第一節(jié)體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式及類型第二節(jié)體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)第三節(jié)體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程第四節(jié)體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長條件第五節(jié)體外培養(yǎng)細(xì)胞生長的監(jiān)測方法第一節(jié)

體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式和類型體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞，按照其生長方式可以分為：1.貼壁生長型細(xì)胞（貼壁型細(xì)胞）2.懸浮生長型細(xì)胞（懸浮型細(xì)胞）1.貼壁生長型細(xì)胞貼壁生長是大多數(shù)由機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式。貼壁有兩種含義：一是細(xì)胞之間相互接觸；二是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞必須附著在固體表面生長，當(dāng)細(xì)胞布滿表面后即停止生長，這時(shí)若取走一片細(xì)胞，存留在表面上的細(xì)胞就會(huì)沿著表面生長而重新布滿表面。而從生長表面脫落進(jìn)入液體的細(xì)胞通常不再生長而逐漸退化，這種細(xì)胞培養(yǎng)稱為單層附壁培養(yǎng)。貼壁生長型細(xì)胞的生長一般都經(jīng)歷游離期、吸附期、繁殖期和退化期。貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞可用以蛋白酶、酸、堿等試劑或機(jī)械方法處理，使之從生長表面上脫落下來。1.貼壁生長型細(xì)胞在體外，細(xì)胞的貼壁方式與體內(nèi)也不相同，體外培養(yǎng)細(xì)胞需要附著于某些帶適量正電荷的固體或半固體表面，大多是只附著一個(gè)平面，因而體外培養(yǎng)的細(xì)胞的外形一般與在體內(nèi)時(shí)明顯不同。按照貼壁型細(xì)胞的體外培養(yǎng)時(shí)的形態(tài)，主要分為四大類：成纖維細(xì)胞型細(xì)胞上皮型細(xì)胞游走型細(xì)胞多形型細(xì)胞此型細(xì)胞具有類似巨噬細(xì)胞樣的特征：在支持物上分散生長，一般不連接成片、形成群落；細(xì)胞胞質(zhì)常伸出偽足和突起；在培養(yǎng)皿壁上生長位置不固定，呈活躍的游走和變形運(yùn)動(dòng)，速度快且方向不規(guī)則；細(xì)胞內(nèi)易出現(xiàn)色暗的吞噬性顆粒。表現(xiàn)此類細(xì)胞形態(tài)的主要是具有吞噬作用的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。游走型細(xì)胞此型細(xì)胞形態(tài)上不規(guī)則，一般分為胞體和胞突兩部分，其中胞突為細(xì)長形，類似絲狀偽足；胞體雖然也略呈多角形，但沒有成纖維細(xì)胞那樣不規(guī)則。此類細(xì)胞不常見，只有某些神經(jīng)組織細(xì)胞等那以確定其穩(wěn)定形態(tài)的才歸入多形細(xì)胞。多形型細(xì)胞上述四種細(xì)胞形態(tài)學(xué)形式是細(xì)胞體外培養(yǎng)最常見的、也是形態(tài)最明顯的幾種形式，體外培養(yǎng)時(shí)所謂的某型細(xì)胞，僅是因?yàn)槠湫螒B(tài)與體內(nèi)的某種細(xì)胞類似，而不能將體外培養(yǎng)的這些細(xì)胞與體內(nèi)同名的細(xì)胞完全等同，同時(shí)也不能說明培養(yǎng)細(xì)胞的起源。在實(shí)際培養(yǎng)中，所培養(yǎng)的細(xì)胞并不一定呈現(xiàn)某一種典型的形態(tài)形式，而多呈現(xiàn)的是一些過渡性形態(tài)。體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征受到多種培養(yǎng)條件的影響，因此，細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征僅是對培養(yǎng)物判斷或識別的一種參考性指標(biāo)，不能用于確定某一培養(yǎng)物的確切細(xì)胞類型。重要提示2.懸浮生長型細(xì)胞此類細(xì)胞在體外生長時(shí)可在培養(yǎng)基中懸浮生長，不必貼壁，因此也叫非貼壁型細(xì)胞。懸浮培養(yǎng)類似微生物的深層培養(yǎng)。由于是懸浮生長，細(xì)胞密度一般都較高，培養(yǎng)的效率也高、操作也容易，易于大規(guī)模生產(chǎn)，便于過程的控制；大規(guī)模培養(yǎng)可采用培養(yǎng)微生物細(xì)胞用的發(fā)酵罐，但須將其稍加改進(jìn)，如將攪拌速度減慢，攪拌葉改用螺旋槳式、通氣裝置通過硅橡膠管擴(kuò)散的方式等。一些在體內(nèi)原本就以懸浮狀態(tài)生長的細(xì)胞，當(dāng)接種于體外環(huán)境中，也可以以懸浮狀態(tài)生長，這類細(xì)胞的胞體始終為球形。還有一些細(xì)胞，在體外培養(yǎng)時(shí)，即可貼壁生長，也可懸浮生長。第二節(jié)

體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)體外培養(yǎng)細(xì)胞重要的生長特點(diǎn)包括：1.貼附與伸展2.運(yùn)動(dòng)的接觸抑制和生長的密度抑制1.貼附與伸展貼附并伸展是大多數(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞的基本生長特點(diǎn)，大多數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體外均附著于一定的底物而生長。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞在未貼附于底物之前一般均似球體樣；當(dāng)與底物貼附后，細(xì)胞將逐漸伸展而形成一定的形態(tài)，呈成纖維細(xì)胞樣或上皮細(xì)胞樣等在體外，細(xì)胞貼附的底物可以是其它細(xì)胞、膠原、玻璃或塑料等。一些促細(xì)胞附著因子（例如纖維連接蛋白、層粘連蛋白、血清擴(kuò)展因子、III型膠原等）可以促進(jìn)細(xì)胞與底物的附著。一般來說，從底物脫離下來的貼附生長型細(xì)胞，不能長時(shí)期在懸浮中生長，除非是一些轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞的貼附與伸展受到離子的作用、機(jī)械和物理因素以及生物因素的影響。細(xì)胞貼附與伸展的步驟2.運(yùn)動(dòng)的接觸抑制與生長的密度抑制接觸抑制是體外培養(yǎng)中多數(shù)貼壁型細(xì)胞的生長特性之一。一般情況下，正常細(xì)胞在不斷分裂而增殖的過程中存在不停頓的活動(dòng)或移動(dòng)，其外周的細(xì)胞膜呈現(xiàn)一些特征性皺褶樣活動(dòng)，但是，當(dāng)兩個(gè)細(xì)胞移動(dòng)而互相靠近時(shí)，其中之一或兩個(gè)將停止移動(dòng)并向另一方向離開，這保證了細(xì)胞將不會(huì)重疊。當(dāng)貼壁細(xì)胞長滿底物時(shí)，一個(gè)細(xì)胞被其他細(xì)胞圍繞致無處可去而發(fā)生接觸時(shí)，細(xì)胞不再移動(dòng)，在接觸區(qū)域的細(xì)胞膜皺褶樣活動(dòng)將停止，此即接觸抑制。2.運(yùn)動(dòng)的接觸抑制與生長的密度抑制一般來說，當(dāng)細(xì)胞生長、匯合形成單層時(shí)，細(xì)胞變得比較擁擠，扁平形成的程度減小，與培養(yǎng)液接觸的表面積減少；同時(shí)培養(yǎng)液中的一些營養(yǎng)物將逐漸消耗掉，尤其是細(xì)胞周圍的部位，因此，這種形成的單層細(xì)胞，其分裂將停止，單層細(xì)胞的密度常與培養(yǎng)液中的血清濃度有關(guān)，這種貼壁細(xì)胞的體外生長特性被稱為細(xì)胞生長的密度抑制（或密度依賴性調(diào)節(jié)）形成密度抑制的單層細(xì)胞可在靜止?fàn)顟B(tài)維持存活一段時(shí)間，但不發(fā)生分裂增殖。轉(zhuǎn)化細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞不同，它們的密度依賴性調(diào)節(jié)常常降低，因而可以生長成較高的終末細(xì)胞密度第三節(jié)

體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長過程體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長過程包括三個(gè)層次的概念：1.細(xì)胞生長的全生命過程2.每代細(xì)胞的生長過程3.單個(gè)細(xì)胞的生長過程（細(xì)胞周期）1.細(xì)胞生長的全生命過程培養(yǎng)的細(xì)胞是生長在培養(yǎng)器皿之中的，當(dāng)細(xì)胞持續(xù)生長繁殖一段時(shí)間后，到達(dá)一定的細(xì)胞密度之后，就應(yīng)當(dāng)將細(xì)胞分離成兩部分或更多部分至新的培養(yǎng)器皿并補(bǔ)充更新培養(yǎng)液，這一過程稱為傳代或再培養(yǎng)。從動(dòng)物體取出的原代培養(yǎng)的原代細(xì)胞，經(jīng)過傳代以后，便成為了細(xì)胞系，一般正常細(xì)胞的這種細(xì)胞系的壽命只能維持一定的時(shí)間期限（被稱為有限細(xì)胞系），然后將自行停止生長，即使提供足夠的營養(yǎng)，最終仍致死亡，這個(gè)完整的過程，被稱為細(xì)胞生長的全生命過程，也叫細(xì)胞系的生長過程。細(xì)胞系在培養(yǎng)中能夠存活時(shí)間的長短，主要取決于細(xì)胞來自何種動(dòng)物種族。在一些情況下，培養(yǎng)的條件也會(huì)在一定程度上影響細(xì)胞系的壽命。1.細(xì)胞生長的全生命過程在進(jìn)行正常細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，無論細(xì)胞的種類和供體的年齡如何，在細(xì)胞的全生長過程中大致都要經(jīng)過三個(gè)主要階段：原代培養(yǎng)或初代培養(yǎng)期

自體內(nèi)取出在體外培養(yǎng)和第一次傳代的時(shí)期，一般約1~4周。與體內(nèi)相應(yīng)的細(xì)胞性狀相似。傳代期

傳代大約數(shù)天至1周左右重復(fù)一次，持續(xù)數(shù)月，此期間細(xì)胞增殖旺盛。衰退（老）期

反復(fù)傳代一定時(shí)間后（大概30至50代后），細(xì)胞增殖變慢，端粒進(jìn)行性縮短，直至停止分裂。有的細(xì)胞的極少部分后來細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)化，獲得永生，成為無限細(xì)胞系。細(xì)胞系原代細(xì)胞經(jīng)第一次傳代后形成的能夠繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)的細(xì)胞群體稱為細(xì)胞系，一般為有限細(xì)胞系。原代培養(yǎng)后得到細(xì)胞系，再經(jīng)多次傳代培養(yǎng)后，一部分細(xì)胞死亡，一部分細(xì)胞繼續(xù)生長并轉(zhuǎn)化為連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系。細(xì)胞株從一個(gè)經(jīng)生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系經(jīng)過克隆化或其他篩選方法獲得的單一類型的細(xì)胞群體被稱為細(xì)胞株。重要概念：細(xì)胞系與細(xì)胞株2.每代細(xì)胞的生長過程在體外培養(yǎng)的細(xì)胞的生長過程中，當(dāng)細(xì)胞繁殖到一定密度后，將之分開并轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中的（稱之為接種），使之繼續(xù)繁殖生長，即為傳代。細(xì)胞自接種至新的培養(yǎng)皿中至其下一次再傳代接種的時(shí)間稱為細(xì)胞的一代，每代細(xì)胞的生長過程可分為四個(gè)階段：I.滯留期（24~96h）II.指數(shù)生長期（3~5天）III.平臺期（傳代時(shí)機(jī)）IV.衰亡期第四節(jié)

體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長條件體外培養(yǎng)的細(xì)胞需要合適的生長環(huán)境和必需的條件才能生存、繁殖。1.無污染環(huán)境2.溫度3.pH4.氣體環(huán)境5.滲透壓6.營養(yǎng)7.生長附著物8.抑制物1.無污染環(huán)境在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，離體細(xì)胞對任何毒性物質(zhì)都非常敏感。因此，培養(yǎng)環(huán)境的無污染是保證細(xì)胞生存的首要條件，培養(yǎng)環(huán)境的無污染主要包括：無毒性物質(zhì)污染、無微生物污染和無其他細(xì)胞污染。保證無污染的措施有：所有培養(yǎng)材料、器具要嚴(yán)格按照一定程序嚴(yán)格清洗，絕對保證無毒和潔凈，使用前必須進(jìn)行消毒處理；細(xì)胞培養(yǎng)過程中所需的氣體、液體，均應(yīng)去除細(xì)菌、病毒和支原體等各類污染物；所有操作過程都必須在潔凈條件下進(jìn)行。2.溫度維持細(xì)胞增殖生長，必須有適宜的溫度。人和哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)溫度為36.5℃±0.5℃，若偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會(huì)受到影響，甚至死亡?？偟恼f來，培養(yǎng)細(xì)胞對低溫的耐受力比對高溫強(qiáng)。高溫會(huì)使細(xì)胞內(nèi)酶失活并破壞細(xì)胞膜上的脂類結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。溫度不超過39℃時(shí)，細(xì)胞代謝強(qiáng)度與溫度成正比；超過41℃時(shí)，細(xì)胞受損；超過43℃時(shí)，細(xì)胞死亡。低溫會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)酶的活性，對細(xì)胞傷害不大；溫度降至冰點(diǎn)以下時(shí)，細(xì)胞可因胞質(zhì)結(jié)冰受損而死亡。但如果向培養(yǎng)液中加一定量的保護(hù)劑（如DMSO、甘油），改變冰晶的性質(zhì)，裝入凍存管保存于液氮（溫度可達(dá)-196℃）中，能長期貯存，細(xì)胞解凍復(fù)蘇后，仍能繼續(xù)增殖生長，細(xì)胞的生物學(xué)性狀不受任何影響，這是保存細(xì)胞的最主要手段。3.pH合適的pH也是細(xì)胞生存的必要條件之一，不同細(xì)胞對pH的要求不同，哺乳動(dòng)物細(xì)胞一般為7.2~7.4之間。一般來說，原代細(xì)胞對pH變動(dòng)的耐受差，而傳代細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞對pH變動(dòng)的耐受較強(qiáng)。當(dāng)pH超出合適的范圍，如低于6或高于7.6都會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生不利的影響，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞蛻變或死亡。一般來說，細(xì)胞對堿性不如對酸性的變化耐受。為保持培養(yǎng)環(huán)境的適宜的pH條件，可采用的措施：在培養(yǎng)液中加入緩沖劑以穩(wěn)定培養(yǎng)液的pH；在開放式培養(yǎng)環(huán)境中，通入約5%的CO2，平衡培養(yǎng)過程中的CO2流失。4.氣體環(huán)境氣體是細(xì)胞生存的必須條件之一，其主要包括O2和CO2。O2參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量供給細(xì)胞生長、增殖和合成各種所需成分。不同的細(xì)胞和同一細(xì)胞的不同生長時(shí)期，對氧的需求各不相同。細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中的溶氧要適度，溶氧過低會(huì)影響細(xì)胞的能力代謝，從而影響細(xì)胞的生長；反之，溶氧過高是也會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，影響細(xì)胞的能量代謝。在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中溶解氧一般控制在5%~80%。CO2可以參與調(diào)節(jié)維持培養(yǎng)環(huán)境的pH。5.滲透壓滲透壓對動(dòng)物細(xì)胞也有影響。多數(shù)傳代細(xì)胞，對滲透壓有較強(qiáng)的耐受性，而原代細(xì)胞和正常二倍體細(xì)胞對滲透壓波動(dòng)則比較敏感。人血漿滲透壓約290mOsm/kg，為體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的理想滲透壓。不同細(xì)胞要求的滲透壓略有不同，對大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞來說，滲透壓在260~320mOsm/kg的范圍內(nèi)是較為適宜的。常用的滲透壓保護(hù)劑有：三甲基甘氨酸、脯氨酸和甘氨酸-甜菜堿等。6.營養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)對營養(yǎng)的要求較高，往往需要多種營養(yǎng)成分的優(yōu)化組合：氨基酸

所有動(dòng)物細(xì)胞都需要12種基本氨基酸（精氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸和纈氨酸）和谷氨酰胺。碳水化合物（糖類）

糖是細(xì)胞物質(zhì)構(gòu)成碳架的來源，并且能夠?yàn)榧?xì)胞生長代謝提供所需的能量。葡萄糖利用率最高。維生素

是維持細(xì)胞生長的生物活性物質(zhì)，其中煙酰胺、葉酸、核黃素、維生素B12、泛酸、吡哆醇及維生素C是必不可少的。微量元素

細(xì)胞體外培養(yǎng)除需鉀、鈉、鈣、鎂、氮和磷等基本元素外，也需微量元素，如鐵、鋅、硒等。生長因子

包括激素類物質(zhì)和促生長因子，胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子、神經(jīng)生長因子、血小板生長因子、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、生長調(diào)節(jié)素等。7.附著物除少數(shù)懸浮型細(xì)胞外，絕大多數(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞需附著在適宜的附著物上方能生長。原則上講，凡對細(xì)胞無毒性的物質(zhì)都可用作附著物。現(xiàn)今，常用的細(xì)胞培養(yǎng)附著物有：玻璃是最常用的附著物，有透明、便于觀察、易洗滌和能反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是易破碎。一次性塑料種類很多，常用有聚苯乙烯，具有疏水性，制成的培養(yǎng)瓶皿光潔平坦，且經(jīng)加工處理后其表面帶有電荷，產(chǎn)生疏水性，有利于細(xì)胞生長。微載體是由聚苯乙烯、葡聚糖和聚丙烯酰胺制成的直徑為100至300微米的小球體，細(xì)胞貼附表面積大，能夠融合貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的特點(diǎn)。8.抑制物當(dāng)細(xì)胞的體外培養(yǎng)時(shí)，由于缺乏體內(nèi)的調(diào)節(jié)機(jī)制，會(huì)造成代謝副產(chǎn)物的積累，從而抑制細(xì)胞的功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的抑制物主要有：乳酸可以螯合鈣離子，抑制谷氨酰胺酶，增加培養(yǎng)液的滲透壓，并使pH下降。氨能穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，改變微環(huán)境的pH，刺激糖酵解，使葡萄糖消耗率和乳酸生成速率增加，抑制細(xì)胞呼吸。CO2

在培養(yǎng)液中過度積累會(huì)使pH下降，同時(shí)也會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。第五節(jié)

體外培養(yǎng)細(xì)胞的監(jiān)測（常規(guī)性檢查）細(xì)胞按種或傳代以后，在生存期間，實(shí)驗(yàn)者每天或至多間隔1-2d，要對細(xì)胞做常規(guī)性檢查。隨時(shí)掌握細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化，以便做換液或傳代處理；如發(fā)現(xiàn)異常情況應(yīng)及時(shí)采取措施。體外培養(yǎng)細(xì)胞的常規(guī)性檢查的目的是：考察三個(gè)問題污染與否？pH環(huán)境是否適宜？細(xì)胞的生長狀態(tài)如何？第四節(jié)

體外培養(yǎng)細(xì)胞的監(jiān)測（常規(guī)性檢查）為達(dá)到體外培養(yǎng)的常規(guī)性檢查目的，可采用的檢查方法有：1.微生物污染監(jiān)測2.培養(yǎng)液觀察3.細(xì)胞形態(tài)觀察4.細(xì)胞計(jì)數(shù)5.細(xì)胞活性檢測1.微生物污染在長時(shí)間多量培養(yǎng)工作中，即使用品消毒徹底，操作嚴(yán)密，亦難避免偶而發(fā)生污染。污染主要來于培養(yǎng)用液、培養(yǎng)基、血清或操作時(shí)由空氣播散所致。最常發(fā)生的是霉菌和細(xì)菌污染。霉菌污染易于發(fā)現(xiàn)，如培養(yǎng)液中長出了各種菌落，肉眼可見，不難確認(rèn)。細(xì)菌感染時(shí)，有的引起培養(yǎng)液混濁，鏡下可見大量細(xì)菌，有的培養(yǎng)液無明顯改變?nèi)鐟岩晌廴荆匾獣r(shí)可向肉湯或瓊脂培養(yǎng)基里滴少量培養(yǎng)物，置37℃溫箱培養(yǎng)數(shù)日，觀察有無菌落形成，以驗(yàn)證是否污染。經(jīng)常發(fā)生和難以發(fā)現(xiàn)的是支原體污染。PPLO體積小，只有0.25~1m大小，且無細(xì)胞壁。PPLO污染后的細(xì)胞仍然能生存，甚至無明顯變化，有時(shí)導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生不同程度的病理改變。2.培養(yǎng)液觀察在正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色。用一般恒溫箱培養(yǎng)時(shí)，隨細(xì)胞生長時(shí)間延長，二氧化碳（CO2）積累增多，在超出緩沖范圍后，營養(yǎng)液酸化變黃，此時(shí)如不調(diào)節(jié)pH，對細(xì)胞會(huì)發(fā)生不利影響，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞脫落死亡。營養(yǎng)液堿化變紅除因瓶口不嚴(yán)二氧化碳（CO2）溢出外，也可能由于培養(yǎng)瓶和瓶塞刷洗不潔，殘留堿性物質(zhì)所致。更換營養(yǎng)液的時(shí)間，可依營養(yǎng)物的消耗而定，細(xì)胞生長旺盛時(shí)2-3d換一次，生長緩慢時(shí)3-4d亦可。3.細(xì)胞形態(tài)檢查

生長狀態(tài)良好的細(xì)胞在一般顯微鏡下觀察時(shí)透明度大，輪廓不清，只有用相差顯微鏡，才能看清細(xì)胞的細(xì)微形態(tài)。細(xì)胞機(jī)能不良時(shí)輪廓增強(qiáng)，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其它顆粒狀物，細(xì)胞之間空隙加大，細(xì)胞形態(tài)常變得不規(guī)則和失去原有特點(diǎn)，如上皮細(xì)胞會(huì)變成纖維細(xì)胞等。4.細(xì)胞計(jì)數(shù)用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)是目前采用的最普遍的方法。常用的技術(shù)方法有兩種：用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板人工計(jì)數(shù)，是最經(jīng)濟(jì)的方法；用細(xì)胞計(jì)數(shù)器，比較昂貴。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板：有不同的型號，常用的是改良的紐巴氏血細(xì)胞計(jì)數(shù)板。紐巴氏血細(xì)胞計(jì)數(shù)板有兩個(gè)計(jì)算室，各室劃分為9個(gè)大格，每個(gè)大格的平均面積為1mm2。計(jì)算室上方蓋上血細(xì)胞計(jì)數(shù)板專用的蓋玻片后，室的深度則為1/10mm。在計(jì)算室四角的4個(gè)大方格又各劃分為16個(gè)中方格。計(jì)算室中央的一大格，用雙線劃分為25個(gè)中方格。每個(gè)中方格內(nèi)又劃分為16個(gè)小方格。用于血細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，白細(xì)胞用四角的4個(gè)大格，紅細(xì)胞用中央的1個(gè)大格。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)的步驟S1[準(zhǔn)備計(jì)數(shù)板]:用無水酒精或95%酒精清潔計(jì)數(shù)板及專用蓋玻片將，讓后用綢布輕輕擦拭，并蓋玻片放于計(jì)算室上。S2[制備細(xì)胞懸液]:用消化液分散單層培養(yǎng)細(xì)胞或直接收集懸浮細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，一般要求細(xì)胞密度不低于104/ml。S3[加樣]:用吸管輕輕吹打細(xì)胞懸液，取少許細(xì)胞懸液，在計(jì)數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)加微量細(xì)胞懸液，加樣時(shí)不要溢出蓋玻片也不能溢入兩側(cè)的玻璃槽內(nèi)，也不要過少或帶氣泡。S4[計(jì)數(shù)]:在顯微鏡下，用低倍鏡觀察對焦距找到劃格線區(qū)域。對好焦距進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)中央大方格內(nèi)的細(xì)胞，可依中方格順序計(jì)數(shù)中方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，避免計(jì)數(shù)重復(fù)或漏計(jì)。細(xì)胞壓線時(shí)，只計(jì)左側(cè)和上方者，不