微生物工程 第5章 發(fā)酵過程及控制

第五章發(fā)酵過程及控制發(fā)酵是一個復(fù)雜的生物化學(xué)過程影響要素很多：菌種、培育基、溫度、pH、溶氧、污染等。一、種子制備工藝及質(zhì)量控制二、發(fā)酵過程中的代謝變化及規(guī)律三、基質(zhì)濃度變化及控制四、溫度對發(fā)酵的影響及控制五、溶解氧對發(fā)酵的影響及控制六、pH對發(fā)酵的影響及控制七、CO2對發(fā)酵的影響八、泡沫的構(gòu)成及控制九、染菌分析及控制第五章發(fā)酵過程及控制一、種子制備工藝及質(zhì)量控制菌種是發(fā)酵的關(guān)鍵，從一個保管的菌種，到消費(fèi)上運(yùn)用的種子，假設(shè)按幾十～幾百噸的發(fā)酵規(guī)模，10％的種子量〔接種量〕計，需求幾噸～幾十噸的種子?！惨弧?、作為種子的要求：1、細(xì)胞的生活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長2、菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求3、無雜菌污染4、生理外形穩(wěn)定、堅持穩(wěn)定的消費(fèi)才干〔二〕、種子制備的工藝流程及對發(fā)酵的影響1、工藝流程2、接種時間〔種齡〕和接種量接種時間：對數(shù)生長期，菌體量還未達(dá)最頂峰。接種量：決議于消費(fèi)菌種在發(fā)酵罐中的繁衍速度。谷氨酸棒狀桿菌：1％大多數(shù)抗生素發(fā)酵：5～10%個別的發(fā)酵：20～25％接種量過小，除延伸發(fā)酵周期外，往往還引起其它不正常情況。接種量過高，會使菌體生長過快，培育液粘度過高，呵斥供氧缺乏。3、種子質(zhì)量檢查與判別①檢查pH②檢查培育基滅菌后糖、氮、磷等的含量③檢查菌絲的形狀、濃度、種子液外觀等④無菌檢查⑤穩(wěn)定性檢查⑥其它參數(shù)檢查：某種酶的活性產(chǎn)物量等〔三〕、影響種子質(zhì)量的要素：1、原資料質(zhì)量2、培育溫度、濕度、時間等3、種子罐通氣量4、冷藏時間5、傳代次數(shù)二、發(fā)酵過程中的代謝變化及規(guī)律與代謝有關(guān)的參數(shù)：1、物理參數(shù)⑴、溫度⑵、罐壓⑶、攪拌速度⑷、空氣流量⑸、表觀粘度⑹、發(fā)酵液分量與代謝有關(guān)的參數(shù)：2、化學(xué)參數(shù)⑴、基質(zhì)濃度⑵、pH⑶、產(chǎn)物濃度⑷、DNA量⑸、關(guān)鍵酶⑹、溶解氧⑺、排氣中的氧含量⑻、排氣中的CO2含量與代謝有關(guān)的參數(shù)：3、生物參數(shù)⑴、菌絲形狀⑵、菌絲干重或濕重⑶、菌體比生長速率⑷、氧的比耗費(fèi)速率⑸、糖的比耗費(fèi)速率⑹、氮的比耗費(fèi)速率⑺、產(chǎn)物的比消費(fèi)速率三、基質(zhì)濃度變化及控制〔一〕、碳源濃度變化及控制碳源物質(zhì)是發(fā)酵過程中菌體生長和產(chǎn)物合成的能量和碳素的來源。在發(fā)酵的前期，碳源物質(zhì)主要用于生長，耗費(fèi)較快，在發(fā)酵后期，碳源物質(zhì)主要用于產(chǎn)物合成，耗費(fèi)速度放緩?？焖倮玫奶荚次镔|(zhì)：對生長有利，對次級代謝產(chǎn)物的構(gòu)成有抑制造用。緩慢利用的碳源物質(zhì)：對延伸產(chǎn)物的合成是有利的，尤其是次級代謝產(chǎn)物。到發(fā)酵的中后期，發(fā)酵液中的殘?zhí)歉竞谋M，影響產(chǎn)物的合成。 假設(shè)采用豐富碳源的培育基，又會產(chǎn)生其它的問題; 如培育基濃度過高，影響通氣攪拌，過高的碳源濃度也抑制菌體的生長。處理的方法是采取“中間補(bǔ)料〞補(bǔ)糖的方法：延續(xù)滴加補(bǔ)糖小量多次間歇補(bǔ)糖大量少次補(bǔ)糖“中間補(bǔ)料〞可以延伸產(chǎn)物的產(chǎn)生時間，推遲菌體的自溶時間，添加了發(fā)酵液的體積，而使發(fā)酵單位大幅度上升?！捕?、氮源濃度變化及控制氮源物質(zhì)主要用于菌體中蛋白質(zhì)、核酸等含氮物質(zhì)的合成，有些發(fā)酵產(chǎn)物中含有氮。發(fā)酵前期，氮源物質(zhì)隨菌體濃度的急劇添加而迅速減少，發(fā)酵中期，氮源〔氨基氮〕的下降速度比較緩慢，發(fā)酵后期，由于菌體自溶，氨基氮會上升。氮源物質(zhì)往往抑制次級產(chǎn)物的合成。

快速利用的氮源物質(zhì)：如氨水、銨鹽促進(jìn)菌體生長。緩慢利用的氮源物質(zhì)：有利于延伸產(chǎn)物的合成期。普通情況下，發(fā)酵培育基中同時含快速利用的氮源和緩慢利用的氮源物質(zhì)。假設(shè)氮源物質(zhì)投料多，會呵斥菌體生長快，但菌體衰老也快。處理方法：“中間補(bǔ)料〞。四、溫度對發(fā)酵的影響及控制〔一〕、溫度對微生物和發(fā)酵的影響1、不同的菌、不同的發(fā)酵對溫度的要求不一樣。2、菌體生長的最適溫度與產(chǎn)物構(gòu)成的最適溫度往往不一致。3、菌種在不同的生長期對溫度的敏感性不同。4、溫度歸根結(jié)底是影響酶的活力。

菌種溫度（℃）12996171542T-613最適生長溫度最適產(chǎn)物形成溫度30-323432-3434-3630-3434-3632-3636-38谷氨酸菌種的最適生長溫度和產(chǎn)物構(gòu)成的最適溫度〔二〕、溫度在發(fā)酵中的變化規(guī)律圖生物熱的變化規(guī)律〔三〕、溫度的控制依托夾層或蛇管控制。目前許多發(fā)酵罐都采用自動化控制。五、溶解氧對發(fā)酵的影響及控制溶解氧：溶解于液體〔發(fā)酵液〕中的氧。氧難溶于水，在25℃，1atm下，氧在水中的溶解度為0.26mmol/升，臨界溶解氧濃度：滿足微生物呼吸的最低限制的溶解氧濃度。普通好氣性微生物約為0.003～0.05mmol/升之間。微生物名稱溫度（℃）C臨界（mmol/升）固氮菌300.018-0.049大腸桿菌150.0031大腸桿菌37.80.0082酵母菌200.0037酵母菌34.80.0046橄欖型青霉菌240.0022橄欖型青霉菌300.009橄欖型青霉菌320.02影響微生物需氧量的要素1、菌種2、菌體濃度3、菌齡4、培育基〔一〕影響需氧和供氧的要素影響供氧量的要素1、攪拌2、通氣量3、空氣分布管的構(gòu)造4、發(fā)酵罐的液柱高度/直徑比5、培育液的物理性質(zhì)6、泡沫溶解氧的控制：應(yīng)滿足需氧≤供氧〔二〕溶解氧的控制需氧方面控制最適的菌體濃度供氧方面：1、改動氣體成份2、提高攪拌速度3、添加擋板4、添加通氣量5、提高罐壓幾個概念：呼吸強(qiáng)度：指一克干菌體，在一小時內(nèi)所需氧的毫摩爾數(shù)攝氧量：指一升發(fā)酵液，在一小時內(nèi)所需氧的毫摩爾數(shù)通氣量：指一分鐘內(nèi)，經(jīng)過發(fā)酵液的空氣體積比發(fā)酵液的體積六、pH對發(fā)酵的影響及控制〔一〕、pH值對發(fā)酵的影響：1、pH影響酶的活性2、pH影響微生物細(xì)胞膜的帶電情況，從而影響微生物對養(yǎng)料的吸收和對代謝產(chǎn)物的分泌3、pH影響培育基中某些營養(yǎng)物質(zhì)的可給性4、pH能夠改動培育基的氧化復(fù)原電位5、pH會影響某些微生物的形狀〔二〕、影響pH變化的要素：1、菌種特性2、培育基組成3、發(fā)酵條件〔三〕、pH在發(fā)酵過程中的變化規(guī)律在發(fā)酵前期，菌體生長緩慢，糖分解的少，銨離子利用的也少，所以pH變化緩慢。隨菌的生長，菌分解了含氮有機(jī)物，釋放出銨，培育基的pH會緩慢上升。當(dāng)菌轉(zhuǎn)入對數(shù)生長期，由于菌體大量繁衍，大量利用糖和銨離子，培育基的pH逐漸下降。在生長后期，由于菌體自溶，釋放出銨，pH又上升。1、調(diào)理培育基的配方2、補(bǔ)料控制①加酸、加堿②添加無機(jī)氮源③添加碳源物質(zhì)3、調(diào)理通氣量〔四〕、發(fā)酵過程中pH的調(diào)理七、CO2對發(fā)酵的影響CO2是微生物的代謝產(chǎn)物，同時它往往也是合成所需的一種基質(zhì)。排氣中CO2的濃度與細(xì)胞量有一定的聯(lián)絡(luò)，經(jīng)過測定CO2的生成，可用來估算菌的生長速率和細(xì)胞量。溶解在發(fā)酵液中的CO2對氨基酸、抗生素等發(fā)酵具有抑制或刺激作用。〔一〕、CO2對菌體生長及產(chǎn)物構(gòu)成的影響當(dāng)排氣中的CO2濃度高于4％時，菌體碳水化合物的合成及呼吸速率下降。發(fā)酵液中的CO2濃度為1.6×10－2mol時，會嚴(yán)重抑制酵母菌的生長。CO2影響產(chǎn)黃青霉的形狀。CO2對氨基酸合成的影響進(jìn)氣中CO2含量（％）紫蘇霉素相對產(chǎn)量01234100661500CO2對紫蘇霉素生物合成的影響〔二〕、排氣中CO2與菌體生長的關(guān)系〔三〕、排氣中CO2與pH的關(guān)系對數(shù)生長期pH變小生長后期,菌體自溶,銨離子被釋放,pH升高RQ〔呼吸商〕=CEOOUTCEO：CO2釋放率〔molCO2/Lh〕OUT：菌耗氧率〔molO2/Lh〕〔四〕、排氣中CO2與排氣中O2之間的關(guān)系酵母菌：RQ=0.93生成檸檬酸RQ=1.0生成菌體RQ＞1.1生成乙醇青霉素發(fā)酵RQ=0.909菌體生長RQ=1菌體維持RQ=4青霉素消費(fèi)八、泡沫的構(gòu)成及控制泡沫的危害：泡沫的耐久存在影響著微生物對氧的吸收；妨礙二氧化碳的排除，因此破壞其生理代謝的正常進(jìn)展，不利于發(fā)酵；致使培育液的容量普通只能等于種子罐容量的一半左右，大大影響了設(shè)備的利用率，甚至發(fā)生跑料，招致染菌，呵斥宏大損失。泡沫多會從軸封溢出，容易呵斥染菌。降低了發(fā)酵罐的裝料系數(shù)。嚴(yán)重時停攪拌，影響正常的發(fā)酵過程。產(chǎn)生泡沫的緣由:通氣和機(jī)械攪拌使液體分散和空氣竄入，構(gòu)成氣泡；培育基中某些成分的變化或微生物的代謝活動產(chǎn)生氣泡；培育基中某些成分(如蛋白質(zhì)及其他膠體物質(zhì))的分子，在氣泡外表陳列構(gòu)成鞏固的薄膜。因此，氣泡不易破裂，聚成泡沫層。玉米漿>花生餅粉>黃豆餅粉通氣攪拌的劇烈程度種子和接種量染菌1、機(jī)械消泡

泡沫的消除靠機(jī)械劇烈振動和壓力的變化，促使氣泡破裂，或借助機(jī)械力將排出氣體中的液體加以分別回收，到達(dá)消泡作用。優(yōu)點(diǎn)：不需再發(fā)酵液中參與其它物質(zhì)，減少了由于參與消泡劑所引起的染菌時機(jī)和對后繼分別工藝的影響。缺陷：效果不如化學(xué)消泡迅速、可靠、不能根本上消除引起穩(wěn)定泡沫的要素，同時它還需求設(shè)備和耗費(fèi)動力。機(jī)械消泡分類罐內(nèi)消泡和罐外消泡罐內(nèi)消泡：耙式消泡槳、旋轉(zhuǎn)圓板式、氣流吸入式、沖擊反射板式、碟式及超聲波式等罐外消泡：旋轉(zhuǎn)葉片式、噴霧式、離心式及轉(zhuǎn)向板式等2、化學(xué)法消泡發(fā)酵工業(yè)常用的消泡劑有各種天然的動植物油及來自石油化工消費(fèi)的礦物油、改性油、外表活性劑等。新型的有機(jī)硅聚合物如硅油、硅樹脂等，那么具有效率高、用量省、無毒性、無代謝性，同時兼有提高微生物合成酶等多種優(yōu)良特性，是一類有開展出路的消泡劑。泡沫的控制除了添加消泡劑外，改良培育基成分也是相輔相成的一個重要方面。化學(xué)消泡劑應(yīng)具備以下特點(diǎn)：必需是外表活性劑，具有較低的外表張力，消泡作用迅速有效；具有一定的親水性，使消泡劑對氣－液界面的分散系數(shù)足夠大，從而迅速發(fā)揚(yáng)消泡活性；在水中的溶解度必需小，以堅持耐久地消泡或抑泡性能；對人、畜及微生物無毒；不影響氧在發(fā)酵液中的溶解和傳送；來源方便、廣泛、價錢廉價；常見的消泡劑:天然油脂:玉米油,米糠油,豆油,棉子油….聚醚類,高級醇,脂肪酸,…..九、染菌分析及控制〔一〕染菌緣由分析歸結(jié)起來是：設(shè)備、管道、閥門漏損、滅菌不徹底；空氣凈化不好；無菌操作不嚴(yán)或菌種不純等。染菌的緣由1、種子帶菌或疑心種子帶菌9.64%2、罐壓跌零呵斥染菌0.19%3、培育基未徹底滅菌0.79%4、空氣系統(tǒng)帶菌19.96%5、泡沫冒頂0.48%6、夾層穿孔12.36%7、其它管道穿孔5.89%8、接種管穿孔0.59%9、閥門走漏1.54%10、攪拌軸密封走漏2.09%11、罐基漏1.54%12、其它設(shè)備漏10.13%13、操作問題10.15%14、緣由不祥20.91%某發(fā)酵廠染菌景象的統(tǒng)計分析1、種子帶菌或疑心種子帶菌～10%2、培育基未徹底滅菌～1%3、空氣系統(tǒng)帶菌～20%4、操作問題～10%5、設(shè)備問題～40%6、緣由不祥～20%染菌規(guī)模：大零售酵罐染菌、部分發(fā)酵罐染菌、個別發(fā)酵罐染菌染菌時間：早期、中后期染菌種類：芽孢桿菌、小球菌、霉菌、酵母菌、水生細(xì)菌〔二〕防止染菌的措施主要是加強(qiáng)管理：1、培育基的無菌實驗2、種子的無菌實驗3、設(shè)備的定期檢查、維修4、嚴(yán)厲、規(guī)范的操作〔三〕染菌后的挽救措施1、種子罐染菌：倒罐，從其它未染菌的罐移種。2、發(fā)酵罐早期染菌：調(diào)酸以抑制雜菌生長；參與藥物抑制雜菌生長；培育基重新滅菌，轉(zhuǎn)入發(fā)酵旺盛的發(fā)酵液。3、發(fā)酵罐后期染菌：根據(jù)情況，提早放罐?！菜摹呈删w污染與防治噬菌