補陽還五湯調(diào)控Cav1mTORULK1通路介導的自噬抗腦缺血損傷機制研究

補陽還五湯調(diào)控Cav1/mTOR/ULK1通路介導的自噬抗腦缺血損傷機制研究缺血性中風是一種嚴重威脅人類健康的腦血管疾病,具有高發(fā)病率、高致死率和高致殘率特點,是當前神經(jīng)科學急需解決的課題。目前,雖然隨著診療技術(shù)的不斷提高,但對于該病仍缺乏有效的治療手段。因此,闡明缺血性中風的發(fā)病機制并尋找有效的治療方法顯得尤為緊迫。既往醫(yī)學界已經(jīng)達成共識,腦缺血后缺血灶內(nèi)存在缺血核心區(qū)和周圍半暗帶,核心區(qū)細胞死亡方式以壞死為主,為不可逆性損傷,而半暗帶內(nèi)細胞則以凋亡占主導,為可逆性損傷,據(jù)此,抑制半暗帶內(nèi)細胞凋亡是該病治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。然而,越來越多研究發(fā)現(xiàn),廣譜Caspase抑制劑抗凋亡治療并未減輕腦缺血所致腦損傷程度。自噬作為一種細胞內(nèi)溶酶體依賴的降解途徑,近年來大量文獻報道腦缺血后半暗帶內(nèi)細胞存在明確的自噬現(xiàn)象,并且先于凋亡發(fā)生,同時與凋亡存在相互作用,在腦缺血損傷中扮演了重要角色,但其作用尚不明確。因此,進一步觀察自噬在腦缺血后半暗帶組織中的激活情況及變化規(guī)律,同時明確其在腦缺血損傷中的作用,將有助于為缺血性中風的防治尋找新的有效靶點。國內(nèi)外研究報道小凹蛋白-1（caveolin1,Cav1）參與了肺上皮細胞、乳腺癌等多種細胞自噬的調(diào)控,同時,有學者發(fā)現(xiàn)Cav1基因敲除加重了腦缺血損傷。那么,Cav1是否參與了腦缺血后半暗帶細胞自噬的調(diào)控?若參與,其機制又如何?目前尚未闡明。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin,mTOR）/Unc-51-樣激酶1（unc-51-likekinase1,ULK1）通路作為腦缺血狀態(tài)下調(diào)控自噬的關(guān)鍵通路,腦缺血后Cav1是否通過mTOR/ULK1通路調(diào)控腦缺血后半暗帶自噬進而發(fā)揮抗腦缺血損傷作用?因此,我們擬在永久性大腦中動脈阻塞（permanentmiddlecerebralarteryocclusion,pMCAO）小鼠模型基礎(chǔ)上,通過Cav1基因敲除,在整體動物水平明確Cav1在腦缺血后半暗帶自噬中的調(diào)控作用及可能機制。補陽還五湯（BuyangHuanwuDecoction,BHD）是清代名醫(yī)王清任用來治療中風后半身不遂的經(jīng)典名方,我們現(xiàn)代常用來治療缺血性中風,取得了較好的臨床療效。大量研究表明該方具有很好的腦保護作用,但其作用機制尚不完全清楚。因此,進一步證實并闡明該方的抗腦缺血損傷作用及機制,對缺血性中風的防治具有重要的現(xiàn)實意義。本研究主要由四個部分組成。第一部分:基因敲除小鼠鑒定繁育方法的建立,以及Cav1在正常C57BL/6野生型小鼠腦內(nèi)的表達與定位檢測;第二部分:觀察腦缺血后半暗帶組織中自噬的激活情況及變化規(guī)律,同時明確半暗帶自噬在腦缺血損傷中的作用;第三部分:闡明Cav1在腦缺血后半暗帶自噬調(diào)控中的作用及可能機制;第四部分:通過藥物預處理的方法,從Cav1/mTOR/ULK1通路介導的自噬角度探討補陽還五湯抗腦缺血損傷的可能作用機理。第一部分基因敲除小鼠鑒定繁殖方法與Cav1在腦內(nèi)表達定位目的:探討Cav1基因敲除小鼠的鑒定方法與最優(yōu)繁育方式,觀察Cav1在正常C57BL/6野生型（wildtype,WT）小鼠腦內(nèi)的表達與定位情況,為深入研究Cav1在腦缺血損傷中的作用及機制提供理想的動物模型。方法:根據(jù)美國杰克遜實驗室（JacksonLaboratory）提供的引物序列,運用普通聚合酶鏈反應（polymeasechainreaction,PCR）法擴增鼠尾基因組DNA、瓊脂糖凝膠電泳檢測Cav1基因敲除小鼠子代基因型;通過Cav1雜合子互交、雜合子與Cav1純合子雜交（正交及反交）、純合子互交4種不同的配種方式,觀察親代小鼠的受孕情況及子代小鼠基因型純合情況;采用免疫組織化學（immunohis-tochemistry,IHC）法檢測Cav1在正常C57BL/6野生型小鼠腦內(nèi)的表達情況及分布區(qū)域。結(jié)果:瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物分子量大小約為200bp和661bp,與預期的目的基因片段分子量大小一致,成功鑒定了Cav1基因敲除小鼠的不同基因型;雜合子互交、雜合子與純合子正交及反交、純合子互交四種不同繁殖方式所產(chǎn)子代小鼠的基因型分布基本符合孟德爾遺傳定律,子代小鼠純合率分別為23.52%、47.36%、52.54%、100.00%;雌性、雄性Cav1基因敲除純合鼠具有一定的繁殖能力,雜合子互交雌鼠受孕率為100.00%,雜合子與純合子正交、反交雌鼠受孕率均為87.50%,純合子互交雌鼠受孕率為75.00%,雜合子互交與其余三種繁殖方式的雌鼠受孕率比較,差異均具有統(tǒng)計學意義（P均﹤0.05,n=8）;Cav1表達部位主要位于細胞膜及細胞漿,在神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞中均可見其表達,神經(jīng)細胞中尤其豐富,廣泛分布于皮層、紋狀體、室管膜下區(qū)、海馬等區(qū)域。結(jié)論:普通PCR法能夠快速可靠鑒定Cav1基因敲除小鼠的基因型;雜合子小鼠互交與純合子互交相結(jié)合的繁殖方法可能是短期內(nèi)獲得足量Cav1純合子子鼠與同源野生子鼠的較好方式;Cav1在正常C57BL/6野生型小鼠腦內(nèi)表達豐富。第二部分自噬在腦缺血后半暗帶組織中激活情況及作用目的:觀察局灶性腦缺血后半暗帶組織中自噬激活情況及變化規(guī)律,明確半暗帶自噬在腦缺血損傷中的作用,為缺血性中風的防治尋找新的有效靶點。方法:采用pMCAO法復制局灶性腦缺血模型。將C57BL/6野生型小鼠隨機分為假手術(shù)（Sham）組和模型（Model）組,在腦缺血后3h、6h、12h及24h,應用免疫印跡（westernblot,WB）檢測各個時間點小鼠腦缺血后半暗帶皮層組織自噬標志蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associatedprotein1lightchain3,LC3）亞型LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及泛素結(jié)合蛋白P62（sequestosome1,SQSTM1）的表達,同時使用透射電子顯微鏡（transmissionelectronmicroscopy,TEM）觀察半暗帶皮層組織自噬體（autophagome,AP）數(shù)量變化,以闡明腦缺血后半暗帶組織內(nèi)自噬的激活情況及變化規(guī)律;為了進一步明確半暗帶自噬在腦缺血損傷中的作用,我們通過自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）和自噬誘導劑雷帕霉素（Rapamycin）雙向調(diào)控自噬的方法,將C57BL/6野生型小鼠隨機分為Sham、Model、3-MA、Rapamycin和5%二甲基亞砜（dimethylsulfoxide,DMSO）組,相應給以3-MA(15mg·kg^-1·d^-1)、Rapamycin(6mg·kg^-1·d^-1)及5%DMSO腹腔注射預處理7d,分別在腦缺血后3h、6h、12h及24h四個時間點評價其神經(jīng)功能,造模后自噬高峰時間點采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride,TTC）染色測定腦梗死體積并計算其相對梗死體積、蘇木素伊紅（hematoxylinandeosin,HE）染色觀察半暗帶皮層組織病理形態(tài)變化、WB檢測自噬標記蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及P62表達、TEM觀察AP數(shù)量。結(jié)果:（1）自噬在腦缺血后半暗帶組織中激活情況為了觀察腦缺血后半暗帶組織中自噬的激活情況及變化規(guī)律,我們通過WB和TEM技術(shù),檢測了C57BL/6野生型小鼠pMCAO術(shù)后3h、6h、12h及24h四個時間點腦缺血半暗帶皮層組織自噬水平。WB結(jié)果顯示:與Sham組比較,Model組四個時間點LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯上調(diào)（P均<0.05,n=4）,P62表達均明顯下調(diào)（P均<0.05,n=4）;與pMCAO3h比較,pMCAO6hLC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值進一步上調(diào)（P<0.05,n=4）,P62表達進一步下調(diào)（P<0.05,n=4）;與pMCAO6h比較,pMCAO12hLC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下調(diào)（P<0.05,n=4）,P62表達則上調(diào)（P<0.05,n=4）;與pMCAO12h比較,pMCAO24hLC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、P62表達無顯著性差異（P>0.05,n=4）。TEM結(jié)果顯示:Sham組僅可見少量AP形成;與Sham組比較,Model組四個時間點AP數(shù)量均明顯增加（P均<0.05,n=4）;與pMCAO3h比較,pMCAO6hAP數(shù)量進一步增加（P<0.05,n=4）;與pMCAO6h比較,pMCAO12hAP數(shù)量減少（P<0.05,n=4）;與pMCAO12h比較,pMCAO24hAP數(shù)量無顯著性差異（P>0.05,n=4）。以上結(jié)果表明,局灶性腦缺血后半暗帶組織中自噬被激活,缺血后3h上調(diào),6h達到高峰,12h開始下調(diào),24h仍維持較高水平,具有明顯的動態(tài)變化規(guī)律。（2）半暗帶自噬在腦缺血損傷中的作用為了明確半暗帶自噬在腦缺血損傷中的作用,我們通過自噬抑制與自噬誘導雙向調(diào)控自噬的方法,運用神經(jīng)功能評分、TTC染色、HE染色、WB及TEM技術(shù)分別檢測了pMCAO術(shù)后3h、6h、12h及24h四個時間點小鼠的神經(jīng)功能,造模后自噬高峰6h相對腦梗死體積、半暗帶皮層組織病理形態(tài)、自噬標記蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與P62表達以及AP數(shù)量。神經(jīng)功能評分結(jié)果顯示:與Sham組相同時間點比較,Model組pMCAO術(shù)后四個時間點神經(jīng)功能缺損評分均明顯升高（P均<0.05,n=4）;與Model組相同時間點比較,3-MA組pMCAO術(shù)后四個時間點神經(jīng)功能缺損評分均明顯降低（P均<0.05,n=4）、Rapamycin組均明顯升高（P均<0.05,n=4）、5%DMSO組均無顯著性差異（P均>0.05,n=4）。TTC染色結(jié)果顯示:正常腦組織呈鮮紅色,梗死腦組織呈白色;與Sham組比較,Model組相對腦梗死體積明顯增加（P<0.05,n=4）;與Model組比較,3-MA組相對腦梗死體積明顯減少（P<0.05,n=4）、Rapamycin組明顯增加（P<0.05,n=4）、5%DMSO組均無顯著性差異（P>0.05,n=4）。HE染色結(jié)果顯示:假手術(shù)組皮層腦組織形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊,神經(jīng)元胞體呈圓形或梭形,胞核較大、染色較淺,核仁清楚、核膜完整,膠質(zhì)細胞胞核較小、染色較深,神經(jīng)纖維走形一致、間質(zhì)染色均勻。與Sham組比較,Model組半暗帶皮層組織形態(tài)出現(xiàn)明顯缺血后病理改變,組織結(jié)構(gòu)紊亂,神經(jīng)元數(shù)量減少、排列不齊、細胞周圍間隙增寬,部分胞體皺縮變性呈嗜酸性改變、核固縮深染、細胞形態(tài)變成三角形或長條形,少量膠質(zhì)細胞聚集,神經(jīng)纖維走形紊亂,間質(zhì)水腫、染色淡,但仍可見部分基本正常的神經(jīng)元;與Model組比較,3-MA組病理形態(tài)改善、Rapamycin組病理形態(tài)惡化、5%DMSO組無顯著差異。WB結(jié)果顯示:與Sham組比較,Model組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯上調(diào)（P<0.05,n=4）,P62表達明顯下調(diào)（P<0.05,n=4）;與Model組比較,3-MA組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下調(diào)（P<0.05,n=4）、P62表達則上調(diào)（P<0.05,n=4）,Rapamycin組與3-MA組相反（P均<0.05,n=4）,5%DMSO組無顯著差異（P均>0.05,n=4）。TEM結(jié)果顯示:Sham組僅可見少量AP形成;與Sham組比較,Model組AP數(shù)量明顯增加（P<0.05,n=4）;與Model組比較,3-MA組AP數(shù)量減少（P<0.05,n=4）,Rapamycin組與3-MA組相反（P<0.05,n=4）,5%DMSO組無顯著差異（P>0.05,n=4）。以上結(jié)果表明,自噬抑制劑3-MA預處理能夠通過抑制腦缺血后半暗帶皮層組織LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化及P62蛋白降解,減少AP形成,下調(diào)半暗帶皮層組織自噬水平,來降低腦缺血小鼠神經(jīng)功能缺損評分、減少其相對腦梗死體積、改善半暗帶皮層組織病理形態(tài),發(fā)揮腦保護作用;而自噬誘導劑Rapamycin預處理卻得到相反的結(jié)果,加重了局灶性腦缺血所導致的腦損傷。結(jié)論:自噬在局灶性腦缺血后半暗帶組織中被激活,且具有明顯的動態(tài)變化規(guī)律;半暗帶自噬在永久性腦缺血損傷中扮演了損害者的角色。第三部分Cav1通過mTOR/ULK1通路調(diào)控腦缺血后半暗帶自噬目的:明確Cav1在腦缺血后半暗帶自噬調(diào)控中的作用及可能分子機制,進一步豐富人們對腦缺血損傷自噬機理的認識,為臨床防治缺血性中風提供潛在的分子靶標。方法:采用pMCAO法建立局灶性腦缺血模型。將Cav1基因敲除（caveolin1knockout,Cav1KO）小鼠與同源WT小鼠分別隨機分為Sham組與Model組,在腦缺血造模后自噬高峰6h,應用WB檢測小鼠半暗帶皮層組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及P62的表達、TEM觀察AP數(shù)量變化,以明確Cav1在腦缺血后半暗帶自噬調(diào)控中的作用;為了進一步闡明Cav1調(diào)控腦缺血后半暗帶自噬的分子機制,我們運用WB檢測了腦缺血后半暗帶皮層組織mTOR、p-mTOR（Ser2448）與ULK1、p-ULK1（Ser757）蛋白表達水平,同時采用IHC進一步檢測了p-mTOR（Ser2448）與p-ULK1（Ser757）蛋白表達,實時熒光定量PCR（realtimequantitativePCR,RT-qPCR）檢測了mTOR與ULK1mRNA的表達變化。結(jié)果:（1）Cav1在腦缺血后半暗帶自噬調(diào)控中的作用為了明確Cav1在腦缺血后半暗帶自噬調(diào)控中的作用,我們利用WT和Cav1KO小鼠,通過WB與TEM技術(shù),檢測了pMCAO術(shù)后6h小鼠腦缺血半暗帶皮層組織自噬水平。WB結(jié)果顯示:與WTSham組比較,Cav1KOSham組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與P62蛋白表達均無顯著性差異（P均>0.05,n=4）,WTModel組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯上調(diào)（P<0.05,n=4）,P62蛋白表達明顯下調(diào)（P<0.05,n=4）;與WTModel組比較,Cav1KOModel組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值進一步上調(diào)（P<0.05,n=4）,P62蛋白表達進一步下調(diào)（P<0.05,n=4）。TEM結(jié)果顯示:WTSham組皮層半暗帶組織細胞內(nèi)僅可見少量AP形成;與WTSham組比較,Cav1KOSham組AP數(shù)量無顯著性差異（P>0.05,n=4）,WTModel組AP數(shù)量明顯增加（P<0.05,n=4）;與WTModel組比較,Cav1KOModel組AP數(shù)量進一步增加（P<0.05,n=4）。以上結(jié)果表明,Cav1基因敲除并不影響正常狀態(tài)下腦組織自噬水平,但能夠促進局灶性腦缺血后半暗帶皮層組織LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化及P62蛋白降解,增加AP數(shù)量,上調(diào)半暗帶組織自噬水平。（2）Cav1調(diào)控腦缺血后半暗帶自噬的分子機制為了進一步闡明Cav1調(diào)控腦缺血后半暗帶自噬的分子機制,我們運用WB、IHC及RT-qPCR技術(shù)檢測了小鼠pMCAO術(shù)后6h腦缺血半暗帶皮層組織mTOR、p-mTOR（Ser2448）與ULK1、p-ULK1（Ser757）蛋白表達水平及mTOR、ULK1mRNA表達水平。WB結(jié)果顯示:與WTSham組比較,Cav1KOSham組mTOR、p-mTOR（Ser2448）與ULK1、p-ULK1（Ser757）蛋白表達均無顯著性差異（P均>0.05,n=4）,WTModel組p-mTOR（Ser2448）與p-ULK1（Ser757）蛋白均表達下調(diào)（P均<0.05,n=4）,而mTOR與ULK1蛋白表達則無顯著性差異（P均>0.05,n=4）;與WTModel組比較,Cav1KOModel組p-mTOR（Ser2448）與p-ULK1（Ser757）蛋白表達進一步下調(diào)（P均<0.05,n=4）,而mTOR與ULK1蛋白表達也無顯著性差異（P均>0.05,n=4）。IHC結(jié)果顯示:WTSham組皮層腦組織可見大量p-mTOR（Ser2448）與p-ULK1（Ser757）陽性細胞,二者均主要表達于細胞漿;與WTSham組比較,Cav1KOSham組p-mTOR（Ser2448）與p-ULK1（Ser757）陽性細胞數(shù)及平均光密度（Meanopticaldensity,MOD）均無顯著性差異（P均>0.05,n=4）,WTModel組p-mTOR（Ser2448）、p-ULK1（Ser757）陽性細胞數(shù)與MOD均減少（P均<0.05,n=4）;與WTModel組比較,Cav1KOModel組p-mTOR（Ser2448）、p-ULK1（Ser757）陽性細胞數(shù)與MOD進一步減少（P均<0.05,n=4）;IHC結(jié)果與WB結(jié)果一致。RT-qPCR結(jié)果顯示:與WTSham組比較,Cav1KOSham組與WTModel組mTOR、ULK1mRNA表達均無顯著性差異（P均>0.05,n=4）;與WTModel組比較,Cav1KOModel組mTOR、ULK1mRNA表達亦均無顯著性差異（P均>0.05,n=4）;二者結(jié)果與蛋白水平表達結(jié)果一致。以上結(jié)果表明,Cav1基因敲除并不影響正常狀態(tài)下腦組織mTOR與ULK1蛋白、mRNA及關(guān)鍵位點的磷酸化水平,但能下調(diào)局灶性腦缺血后半暗帶皮層組織p-mTOR（Ser2448）與p-ULK1（Ser757）蛋白表達,而對mTOR與ULK1蛋白及mRNA表達則無影響。結(jié)論:Cav1對腦缺血后半暗帶自噬具有明確的調(diào)控作用;通過使p-mTOR（Ser2448）與p-ULK1（Ser757）磷酸化程度維持在一定水平,影響mTOR/ULK1通路活性,可能是Cav1調(diào)控腦缺血后半暗帶自噬的分子機制。第四部分補陽還五湯調(diào)控Cav1/mTOR/ULK1通路介導的自噬抗腦缺血損傷機制目的:從Cav1/mTOR/ULK1通路介導的自噬探討補陽還五湯抗腦缺血損傷機制,為臨床運用該方防治缺血性中風提供實驗依據(jù)。方法:通過藥物預處理的方法,運用Cav1基因敲除與Rapamycin雙重阻斷Cav1/mTOR/ULK1通路誘導細胞自噬,闡明補陽還五湯抗腦缺血損傷的自噬機制。將C57BL/6WT小鼠隨機分為Model組、BHD組及BHD+Rapamycin組,Cav1KO小鼠隨機分為BHD組及BHD+Rapamycin組,相應給以Rapamycin(6mg·kg^-1·d^-1)腹腔注射誘導細胞自噬及補陽還五湯(18.5g·kg^-1·d^-1)灌胃給藥預處理7d,采用pMCAO法復制局灶性腦缺血模型,分別在腦缺血后3h、6h、12h及24h四個時間點評價其神經(jīng)功能,造模后自噬高峰6h運用TTC染色測定腦梗死體積并計算其相對梗死體積、HE染色觀察半暗帶皮層組織病理形態(tài)變化、WB檢測自噬標記蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及P62表達、TEM觀察AP數(shù)量。為了進一步闡明補陽還五湯調(diào)控腦缺血后半暗帶自噬的分子機制,我們運用WB檢測了腦缺血后半暗帶皮層組織mTOR、p-mTOR（Ser2448）與ULK1、p-ULK1（Ser757）蛋白表達水平,同時采用IHC進一步檢測了p-mTOR（Ser2448）與p-ULK1（Ser757）蛋白表達,RT-qPCR檢測了mTOR與ULK1mRNA表達變化。結(jié)果:（1）補陽還五湯抗腦缺血損傷的自噬機理為了明確補陽還五湯腦保護作用與腦缺血后半暗帶細胞自噬水平的關(guān)系,我們檢測了pMCAO術(shù)后3h、6h、12h及24h四個時間點小鼠的神經(jīng)功能,造模后6h相對腦梗死體積、半暗帶皮層組織病理形態(tài)、自噬標記蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與P62表達及AP數(shù)量。神經(jīng)功能評分結(jié)果顯示:與WTModel組相同時間點比較,WTBHD組pMCAO術(shù)后四個時間點神經(jīng)功能缺損評分均明顯降低（P均<0.05,n=4）;與WTBHD組相同時間點比較,pMCAO術(shù)后四個時間點WTBHD+Rapamycin組、Cav1KOBHD組與Cav1KOBHD+Rapamycin組神經(jīng)功能缺損評分均不同程度增加（P均<0.05,n=4）,其中Cav1KOBHD+Rapamycin組增加更明顯（P<0.05,n=4）。TTC染色結(jié)果顯示:正常腦組織呈鮮紅色,缺血腦組織呈白色;與WTModel組比較,WTBHD組相對腦梗死體積明顯減少（P<0.05,n=4）;與WTBHD組比較,WTBHD+Rapamycin組、Cav1KOBHD組與Cav1KOBHD+Rapamycin組相對腦梗死體積均不同程度增加（P均<0.05,n=4）,其中Cav1KOBHD+Rapamycin組增加更明顯（P<0.05,n=4）。HE染色結(jié)果顯示:WTModel組半暗帶皮層組織形態(tài)出現(xiàn)明顯缺血后病理改變,組織結(jié)構(gòu)紊亂,神經(jīng)元數(shù)量減少、排列不齊、細胞周圍間隙增寬,部分胞體皺縮變性呈嗜酸性改變、核固縮深染、細胞形態(tài)變成三角形或長條形,少量膠質(zhì)細胞聚集,神經(jīng)纖維走形紊亂,間質(zhì)水腫、染色淡,但仍可見部分基本正常的神經(jīng)元;與WTModel組比較,WTBHD組病理形態(tài)改善,可見皮層半暗帶區(qū)核固縮細胞較模型組明顯減少,細胞形態(tài)明顯改善,細胞排列較整齊,核較清晰,細胞間隙染色較均勻;與WTBHD組比較,WTBHD+Rapamycin組、Cav1KOBHD組與Cav1KOBHD+Rapamycin組病理形態(tài)不同程度惡化,且Cav1KOBHD+Rapamycin組惡化更明顯。WB結(jié)果顯示:與WTModel組比較,WTBHD組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯下調(diào)（P<0.05,n=4）,P62表達明顯上調(diào)（P<0.05,n=4）;與WTBHD組比較,WTBHD+Rapamycin組、Cav1KOBHD組與Cav1KOBHD+Rapamycin組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值不同程度上調(diào)（P均<0.05,n=4）,P62表達則不同程度下調(diào)（P均<0.05,n=4）,其中Cav1KOBHD+Rapamycin組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和P62蛋白表達變化更明顯（P均<0.05,n=4）。TEM結(jié)果顯示:WTModel組皮層半暗帶組織細胞內(nèi)可見大量AP形成;與WTModel組比較,WTBHD組AP數(shù)量明顯減少（P<0.05,n=4）;與WTBHD組比較,WTBHD+Rapamycin組、Cav1KOBHD組與Cav1KOBHD+Rapamycin組AP數(shù)量均不同程度增加（P均<0.05,n=4）,其中Cav1KOBHD+Rapamycin組增加更明顯（P<0.05,n=4）。以上結(jié)果表明,補陽還五湯預處理能夠通過抑制腦缺血后半暗帶皮層組織LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化及P62蛋白降解,減少AP形成,下調(diào)半暗帶皮層組織自噬水平,來降低腦缺血小鼠神經(jīng)功能缺損評分、減少其相對腦梗死體積、改善半暗帶皮層組織病理形態(tài),發(fā)揮腦保護作用,而加用自噬誘導劑Rapamycin或/和基因敲除Cav1則能不同程度地抵消該作用。（2）補陽還五湯調(diào)控腦缺血后半暗帶自噬的分子機制為了進一步