大豆β-伴大豆球蛋白α-亞基基因RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)調(diào)控的研究

大豆β-伴大豆球蛋白α’-亞基基因RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)調(diào)控的研究大豆蛋白是人和動(dòng)物的主要的植物蛋白來源,約占大豆種子的40%,其中含有90%的貯藏蛋白,7s蛋白和11s蛋白是大豆貯藏蛋白的主要成分,研究表明,調(diào)節(jié)二者比例可以改善大豆蛋白加工適應(yīng)性,提高1ls蛋白含量降低7s蛋白的含量可以改善大豆蛋白的營養(yǎng)品質(zhì)。7s蛋白中的主要成分為β-伴大豆球蛋白,它是大豆中引起嬰兒和幼齡動(dòng)物消化道過敏反應(yīng)的主要大豆抗原蛋白。α’、α和β是β-伴大豆球蛋白的三個(gè)主要亞基,這三個(gè)亞基均被證明是潛在的食物致敏因子。p-伴大豆球蛋白擁有較好的熱穩(wěn)定性,通過常規(guī)的加熱處理對(duì)其抗原活性的降低效果非常有限,因此,通過育種手段降低β-伴大豆球蛋白含量是目前降低其活性的主要途徑。到目前為止,人們已經(jīng)得到了一系列經(jīng)自然變異或人工誘變產(chǎn)生的具有p-伴大豆球蛋白不同亞基缺失表現(xiàn)的育種材料,并對(duì)其分子基礎(chǔ)進(jìn)行了深入研究。但是,通過基因工程手段以達(dá)到降低β-伴大豆球蛋白各亞基含量的研究還鮮見報(bào)道。故本研究根據(jù)RNA干擾技術(shù)原理,克隆了β-伴大豆球蛋白α’-亞基基因的核心保守序列中一段400bp大小的片段,采用基因工程手段,分別構(gòu)建了以抗除草劑Bar基因和耐鹽堿BADH基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的a’-亞基基因ihp-RNAi高效表達(dá)載體p3301-PFNZ和p3301-PFNZ-BADH兩個(gè)單價(jià)表達(dá)載體及以Bar基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的雙價(jià)表達(dá)載體p3301-α’+β。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和花粉管通道法將兩個(gè)單價(jià)表達(dá)載體導(dǎo)入大豆,經(jīng)過抗性篩選,并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測,Southernblot雜交,]RT-PCR和ELISA檢測,以期應(yīng)用RNA干擾技術(shù)對(duì)β-伴大豆球蛋白α’-亞基基因的表達(dá)調(diào)控加以研究,為應(yīng)用基因工程技術(shù)進(jìn)行大豆品質(zhì)改良奠定了基礎(chǔ)。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：分別克隆了構(gòu)成ihp-RNAi表達(dá)載體結(jié)構(gòu)的4個(gè)片段：種子特異性啟動(dòng)子7ap,α’-亞基基因正義和反義片段及功能性間隔序列intron-s。以植物表達(dá)載體pCAMBIA3301為基礎(chǔ),經(jīng)雙酶切連接的方法依次連入種子特異性啟動(dòng)子7αp、α’-亞基基因反義片段,功能性間隔序列intron-s和α’-亞基基因正義片段,構(gòu)成以植物表達(dá)載體pCAMBIA3301本身帶有的抗除草劑Bar基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的ihp-RNAi表達(dá)載體p3301-PFNZ?？寺∧望}堿基因BADH,利用XholⅠ單酶切替換了表達(dá)載體p3301-PFNZ中的抗除草劑基因Bar,并通過EcoRⅠ單酶切鑒定方向后,構(gòu)建了以BADH基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的安全型植物表達(dá)載體p3301-PFNZ-BADH。將已克隆好的p-伴大豆球蛋白β-亞基基因的正義片段和反義片段分別插入到啟動(dòng)子7αp下游和終止子nos上游,并通過酶切鑒定其插入方向,構(gòu)建成β-伴大豆球蛋白a’-亞基和β-亞基的雙價(jià)ihp-RNAi表達(dá)載體p3301-α’+β。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將兩個(gè)單價(jià)表達(dá)載體導(dǎo)入受體大豆,經(jīng)抗性篩選和PCR初步檢測得到耐鹽堿的T0代“吉農(nóng)27”轉(zhuǎn)基因大豆15株,抗草銨膦T0代“吉農(nóng)28”轉(zhuǎn)基因大豆10株,轉(zhuǎn)化率為2.1%。采用花粉管通道法將兩個(gè)單價(jià)表達(dá)載體導(dǎo)入受體大豆,共獲得780粒轉(zhuǎn)化籽粒,其中轉(zhuǎn)p3301-PFNZ-BADH籽粒：“吉農(nóng)27"125粒,“吉新豆1號(hào)”112粒,“通農(nóng)13"143粒；轉(zhuǎn)p3301-PFNZ籽粒：“吉農(nóng)27"123粒,“吉新豆1號(hào)”131粒,“通農(nóng)13"146粒。經(jīng)抗性篩選并PCR檢測,從獲得的幼苗中初步篩選出耐鹽堿陽性植株“吉農(nóng)27"10株,“吉新豆1號(hào)”7株,“通農(nóng)13"5株；抗草銨膦陽性植株：“吉農(nóng)27"8株,“吉新豆1號(hào)”6株,“通農(nóng)13"5株；平均轉(zhuǎn)化率為3.2%。對(duì)轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行PCR檢測,獲得農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化的T1代陽性植株45株,其中耐鹽堿“吉農(nóng)27”T1代陽性植株25株,抗草銨膦“吉農(nóng)28”T1代陽性植株20株。為了進(jìn)一步鑒定表達(dá)載體的T-DNA區(qū)是否整合到大豆基因組中,隨機(jī)分別抽取吉農(nóng)27和吉農(nóng)28的T1代陽性植株提取基因組,以BADH/Bar為探針進(jìn)行Southern雜交檢測,結(jié)果陽性植株均出現(xiàn)雜交信號(hào),非轉(zhuǎn)基因植株沒有出現(xiàn)雜交信號(hào),由此證明兩個(gè)單價(jià)表達(dá)載體的T-DNA區(qū)已整合到大豆基因組中。對(duì)經(jīng)過Southern雜交分析為陽性的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行RT-PCR檢測,結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株的α’亞基基因(?)nRNA量明顯低于非轉(zhuǎn)基因植株,表明RNA干擾機(jī)制在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮了作用。選取經(jīng)RT-